蕨菜超臨界萃取物化學成分及其抑制3T3-L1前脂肪細胞分化作用研究

吳永祥, 張 瑤，盧瑋瑋，胡曉倩，權泰亨，金泰完

( 1. 黃山學院生命與環(huán)境科學學院, 安徽 黃山 245041; 2. 安東國立大學食品科學與生物技術學院，韓國 安東 760749 )

隨著人們生活質量的不斷提高，全球肥胖率呈直線增長趨勢，中國現(xiàn)已成為肥胖超級大國。肥胖是一種慢性疾病，可引發(fā)Ⅱ型糖尿病、血脂異常癥、心血管疾病和高血壓等疾病，嚴重危害公眾的身體健康[1]。脂肪細胞分化與調控的失常，可導致脂肪細胞體積的增大、脂肪組織的沉積以及脂肪細胞調控因子分泌的紊亂，繼而引起肥胖代謝性疾病[2]。因此，研究脂肪細胞分化的抑制作用有助于尋找抗肥胖代謝性疾病的新原料，對于探索預防與治療代謝性疾病具有重要的理論意義和應用價值。蕨菜 (Pteridiumaquilinum(Linn.) Kuhn var. Latiusculum (Desv) Underw) 作為藥食兩用植物，有很高的藥用價值，有清熱解毒、消腫、利水、安神、潤腸通便等功效，可用于治療高血壓、糖尿病、風濕性關節(jié)炎等癥狀[3]?，F(xiàn)代藥理研究表明：蕨菜含有多酚、多糖、黃酮、萜類等多種生物活性物質，具有抗氧化、降血糖及增強機體免疫等功效[4]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)[5]，不同真菌固體發(fā)酵前后蕨菜醇提取物具有明顯體外抗氧化和抗炎癥活性。蕨菜水提取物對高血脂小鼠的血脂代謝紊亂具有良好調節(jié)作用[6]，但蕨菜超臨界萃取物對3T3-L1脂肪細胞分化的抑制作用及其分子機制尚不明確。

超臨界CO2萃取是一種低溫綠色環(huán)保萃取分離技術，與溶劑提取法、酶解輔助法和超聲提取法等傳統(tǒng)工藝相比，具有萃取高效、時間短、無溶劑殘留等優(yōu)點，且更大程度上保留了天然植物熱敏性和易氧化等生物活性成分。顧仁勇等[7]采用超臨界CO2萃取技術提取八月瓜多酚，多酚含量提高2.45倍，產品純度提高15.46%。Tohar等[8]采用超臨界CO2萃取美麗帽柱木葉的活性成分，明顯增加了其抗炎癥作用。然而，目前尚鮮有關于蕨菜超臨界萃取及其化學成分的研究。為此，本研究采用超臨界CO2技術萃取蕨菜活性成分，通過GC-MS對萃取物進行化學成分分析，并探究蕨菜萃取物對3T3-L1前脂肪細胞分化的抑制作用及分子機制，以期為蕨菜進一步的開發(fā)利用提供科學依據(jù)。

1 材料

1.1 細胞株3T3-L1前脂肪細胞株購自美國模式培養(yǎng)物集存庫(American Type Culture Collection, ATCC)。

1.2 藥品與試劑四甲基偶氮唑藍(MTT；批號：M2128，規(guī)格：1 g)、胰島素(insulin；批號：I9278，規(guī)格：5 mL)、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(3-Isobutyl-l-methylxanthine，IBMX；批號：17018，規(guī)格：100 mg)、地塞米松(dexamethasone，Dex；批號：D4902，規(guī)格：100 mg)、油紅 O(批號：O0625，規(guī)格：25 g)，均購自美國Sigma公司；DMEM培養(yǎng)基(批號：88425，規(guī)格：135 g)、胰蛋白酶(批號：A40009，規(guī)格：100 μg)、胎牛血清(批號：26400044，規(guī)格：500 mL)、小牛血清(批號：16010159，規(guī)格：500 mL)及其它細胞培養(yǎng)試劑購自美國Gibco公司；cDNA合成試劑盒(批號：6110B，規(guī)格：200 rxns)購自日本TaKaRa公司。

1.3 儀器Waters MV-10型超臨界萃取系統(tǒng)(美國Waters公司)；Agilent HP7890-5975C型氣相色譜-質譜聯(lián)用儀(美國Agilent公司)；SpectraMax-190型全波長酶標儀(美國Molecular Devices公司)；IX51型倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；ECOTM實時熒光定量PCR儀(美國Illumina公司)。

2 方法

2.1 蕨菜超臨界萃取物的制備將蕨菜洗凈晾干，于60 ℃烘干至恒重，粉碎過40目篩，得蕨菜粉末。準確稱取原料5.0 g，采用超臨界CO2流體萃取方法提取蕨菜活性成分。萃取條件為：萃取壓力20 Mpa，溫度30 ℃，動態(tài)萃取時間10 min，靜態(tài)萃取時間10 min，CO2流量10 mL·min-1，夾帶劑為75%乙醇1 mL·min-1，循環(huán)萃取2次。萃取后采用旋轉蒸發(fā)儀濃縮至恒重，得到粘稠狀萃取物。

2.2 蕨菜萃取物化學成分的GC-MS分析將超臨界萃取得到的蕨菜萃取物用甲醇配制成1 000 mg·L-1溶液，利用GC-MS對試樣進行分析。色譜條件：選用HP-5MS彈性石英毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；進樣量為0.5 μL，進樣口模式為不分流，進樣口溫度為280 ℃；柱箱程序為40 ℃保持3 min，以4 ℃·min-1升至160 ℃保持3 min，以4 ℃·min-1升至285 ℃保持10 min；運行時間為 70 min。質譜條件：電離方式為電子轟擊(EI)，電子能量為70 eV，離子源溫度為230 ℃；掃描范圍m/z為35～450 amu全離子掃描；質譜數(shù)據(jù)庫為NIST08標準譜庫。

2.3 3T3-L1前脂肪細胞的培養(yǎng)與誘導分化將3T3-L1前脂肪細胞置于含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，在37 ℃、5% CO2、95%濕度的培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。待細胞生長至80%時，傳代培養(yǎng)。

取對數(shù)生長期的3T3-L1前脂肪細胞，以1×108·L-1細胞密度接種于24孔板中，每孔加入500 μL細胞懸浮液。待細胞融合后接觸抑制48 h(記為分化d 0)，加含0.5 mmol·L-1IBMX、5 mg·L-1胰島素、1 μmol·L-1Dex及10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng) 48 h(d 2)，更換為含5 mg·L-1胰島素的10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h(d 4)。以后每48 h更換一次10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，直至90%的前脂肪細胞分化為脂肪細胞，并于d 8檢測脂肪的含量[2]。在0～8天中，同時加入不同濃度的蕨菜超臨界萃取物(50、100、200 mg·L-1)。實驗設置未誘導分化的細胞為對照組(Control)、誘導分化的脂肪細胞為模型組(Model)、SFE-PA組(誘導分化+ SFE-PA 50、100、200 mg·L-1)。每組平行3個復孔，重復3次。

2.4 MTT法檢測3T3-L1前脂肪細胞的活性取對數(shù)生長期的3T3-L1前脂肪細胞，以1×108·L-1細胞密度接種于96孔板中，每孔加入100 μL。待細胞完全貼壁良好后(約48 h)，更換含不同濃度蕨菜超臨界萃取物(50、100、200 mg·L-1)的10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。培養(yǎng)48 h后，每孔加入MTT溶液 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)3 h, 然后去除孔內的液體，每孔中加入200 μL DMSO 使紫色結晶充分溶解，于570 nm波長處測各孔的OD值[9]。

2.5 油紅O染色比色法分析3T3-L1前脂肪細胞的分化程度誘導分化d 8，移去培養(yǎng)液，用PBS清洗3次，然后用4%多聚甲醛固定30 min，PBS清洗3次，加入油紅O染液。染色60 min后去除染液，PBS清洗3次，倒置顯微鏡下觀察并拍攝照片，之后加入200 μL異丙醇使其充分溶解染色脂肪細胞內的油紅O，于520 nm波長處測定吸光值[2]。

2.6 qRT-PCR法檢測脂肪細胞分化轉錄調控因子和脂質合成相關基因mRNA的表達采用不同濃度蕨菜超臨界萃取物(50、100、200 mg·L-1)處理3T3-L1細胞，利用TRIzol試劑提取總RNA，然后采用PrimeScriptTMRT試劑將RNA逆轉錄為cDNA。加入SYBR Green、引物及cDNA模板，進行實時熒光定量PCR反應。引物序列見表Tab 1。

Tab 1 Primer sequences for targeted mouse genes

3 結果

3.1 蕨菜超臨界萃取物的化學成分分析對蕨菜超臨界萃取物的主要化學成分進行了GC-MS定性分析，總離子流圖譜如Fig 1所示。運用NIST08質譜庫對照，從SFE-PA中鑒定出10種化合物，占總峰面積量的87.17%。由Tab 2可知，SFE-PA含有酚類、酯類、有機酸類、醇類等化合物，以酚類、醇類化合物為主，其中含有2種酚類化合物(44.33%)、4種醇類化合物(32.08%)、2種有機酸類化合物(9.46%)、2種酯類化合物(1.30%)。SFE-PA的主要化學成分為4,4,5,7,8-五甲基-二氫香豆素(36.07%)、β-谷甾醇(25.66%)、4-氨基-7-二乙氨基-香豆素(8.26%)、棕櫚酸(5.05%)、亞油酸(4.41%)、植醇(3.31%)、菜油甾醇(2.06%)等。

Fig 1 Total ion chromatogram of supercritical extract from Pteridium aquilinum

Tab 2 Chemical constituents and relative contents of supercritical extract from Pteridium aquilinum

3.2 SFE-PA對3T3-L1前脂肪細胞活性的影響由Fig 2可知，在50 ～ 200 mg·L-1濃度下，蕨菜超臨界萃取物對3T3-L1前脂肪細胞活性無明顯影響，且無劑量效應。當濃度達到200 mg·L-1時，3T3-L1前脂肪細胞活力為99.39%，與空白對照組相比(Control)，差異無統(tǒng)計學意義。以上說明，SFE-PA在200 mg·L-1濃度內，對3T3-L1前脂肪細胞無明顯毒性作用。

Fig 2 Effect of SFE-PA on cell viability of 3T3-L1 preadipocytes n=3)

3.3 SFE-PA對3T3-L1前脂肪細胞分化的影響由Fig 3可知，蕨菜超臨界萃取物可以明顯抑制3T3-L1前脂肪細胞的分化，明顯減少成熟脂肪細胞中的脂肪積累。采用油紅O染色比色進行分析，SFE-PA在濃度50、100、200 mg·L-1處理條件下，其脂肪含量分別是模型組(Model)的86.73%、64.01%、48.54%，呈劑量依賴性降低，且差異具有顯著性(P<0.01)。

Fig 3 Effect of SFE-PA on differentiation of

##P<0.01vscontrol group，**P<0.01vsmodel group

Fig 4 Morphological micrographs of 3T3-L1 preadipocytes after incubation with SFE-PA (×200)

a: Control; b: Model; c: SFE-PA 50 mg·L-1; d: SFE-PA 100 mg·L-1; e: SFE-PA 200 mg·L-1.

3.4 SFE-PA對3T3-L1前脂肪細胞分化前后形態(tài)學的影響Fig 4所示為3T3-L1前脂肪細胞分化前后的形態(tài)變化，在顯微鏡下觀察，未誘導分化的3T3-L1前脂肪細胞為長梭形，細胞內無脂滴。采用雞尾酒式誘導分化后，細胞形態(tài)變大變圓，體積增大，細胞質內出現(xiàn)脂滴，8 d后90%以上的細胞分化為成熟的脂肪細胞。通過油紅O染色，可見胞質中含有的大量脂滴被染成紅色，在核周圍形成“戒指環(huán)”結構。經蕨菜超臨界萃取物干預后，脂肪細胞中被染成紅色的脂滴減少，且呈劑量效應。

3.5 SFE-PA對脂肪細胞分化中轉錄調控因子PPARγ，CEBPα，SREBP-1c mRNA表達影響過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ)和CCAAT/增強子結合蛋白α(CCAAT/enhancer-binding protein α，C/EBPα)是3T3-L1前脂肪細胞分化的關鍵轉錄調控因子。由Fig 5可知，與對照組(Control)相比，隨著脂肪細胞分化過程的進行，模型組PPARγ和CEBPα的mRNA相對表達量明顯增加(P<0.01)。

Fig 5 Effect of SFE-PA on mRNA expression of PPARγ, CEBPα, SREBP-1c in adipocytes n=3)

##P<0.01vscontrol group,*P<0.05,**P<0.01vsmodel group

SFE-PA可以明顯下調PPARγ和CEBPα mRNA表達量，其中200 mg·L-1SFE-PA處理組分別下降為模型組(Model)的18.21%和15.54%，差異有顯著性(P<0.01)。SFE-PA還明顯降低了固醇調節(jié)元件結合蛋白-1c(sterol regulatory element-binding protein 1c, SREBP-1c)mRNA表達水平，其中100、200 mg·L-1SFE-PA處理組分別下降為模型組(Model)的52.65%、27.16%，呈劑量依賴性降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

3.6 SFE-PA對脂肪細胞分化中脂質合成相關基因FAS，ACC mRNA表達的影響乙酰輔酶A 羧化酶 (acetyl CoA carboxylase，ACC)和脂肪酸合成酶(fatty acid synthase，F(xiàn)AS)是脂質合成途徑中關鍵酶，在脂肪沉積中發(fā)揮了重要作用。由Fig 6可知，與對照組(Control)相比，隨著脂肪細胞分化過程的進行，模型組(Model)FAS和ACC的mRNA相對表達量明顯增加(P<0.01)，分別是對照組的15.76、5.35倍。SFE-PA明顯抑制了脂肪細胞分化中脂質合成基因FAS、ACC mRNA的表達水平，隨著SFE-PA濃度的增加，抑制效果呈濃度依賴性增加，差異且有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與模型組(Model)相比，當SFE-PA濃度為200 mg·L-1時，對細胞內FAS、ACC mRNA表達的抑制率分別96.54%、90.11%。

Fig 6 Effect of SFE-PA on mRNA expression of FAS, ACC in adipocytes n=3)

##P<0.01vscontrol group,**P<0.01vsmodel group

4 討論

肥胖作為一種慢性代謝性疾病已成為危害全球公眾健康的主要問題之一，它與血脂異常癥、心血管疾病和Ⅱ型糖尿病等多種疾病的發(fā)生密切相關[1]。治療肥胖的藥物主要有奧利司他(orlistat)和西布曲明(sibutramine)，但長期服用效果不理想，而且存在嚴重的副作用，如頭疼、胃疼、腹瀉等，甚至可能增加患心血管疾病的風險，因此，人們急需一種安全并高效的治療藥物[10]。酚類、黃酮、多糖、醇類等生物活性物質是近年來各領域研究的熱點，大多數(shù)體外研究表明[2,4,10]，天然植物資源來源的酚類、黃酮、多糖等具有抗氧化、抗肥胖、降血糖及增強機體免疫等生物學作用。本研究采用超臨界CO2萃取蕨菜活性物質，通過GC-MS分析其主要化學成分，并以3T3-L1前脂肪細胞為研究對象，研究蕨菜超臨界萃取物對3T3-L1前脂肪細胞分化的影響，探討蕨菜在抗肥胖代謝性疾病方面的功效。共鑒定出10種化合物，占總峰面積量的87.17%，主要化學成分為4,4,5,7,8-五甲基-二氫香豆素(36.07%)、β-谷甾醇(25.66%)、4-氨基-7-二乙氨基-香豆素(8.26%)等。姚元發(fā)[11]研究表明，香豆素類化合物能改善高脂小鼠的血脂水平，并明顯減輕肥胖小鼠體重。Yang等[12]從魯桑中分離鑒定出β-谷甾醇等活性成分，并發(fā)現(xiàn)β-谷甾醇能明顯抑制3T3-L1脂肪細胞的分化。從本試驗中我們得出蕨菜超臨界萃取物顯著性的抑制脂肪細胞的分化，而高含量的酚類、醇類可能是其潛在的抑制3T3-L1脂肪細胞分化的活性物質基礎。

為了闡明其中的分子機制，本研究檢測了脂肪細胞分化過程中細胞分化轉錄調控因子和脂質合成相關基因的表達水平。目前研究認為調節(jié)脂肪細胞分化的主要調控因子包括PPARγ、CEBPα和SREBP-1c。PPARγ和CEBPα具有調節(jié)脂肪形成、糖脂代謝和細胞增殖分化等生物學功能，它們的過度表達可以誘導并加快脂肪細胞分化，并激活眾多脂肪細胞分化相關基因的轉錄表達，促進細胞內脂肪的累積[13]。SREBP-1c在前脂肪細胞分化早期發(fā)揮著重要作用，并能夠在脂肪細胞分化過程中增加PPARγ的活性[14]。本研究中，蕨菜超臨界萃取物可以明顯抑制脂肪細胞中PPARγ、CEBPα和SREBP-1c的mRNA表達，從而一定程度上抑制了前脂肪細胞的分化，減少成熟脂肪細胞中的脂肪積累。研究表明脂肪細胞分化也與脂質合成酶基因密切相關。FAS和ACC是脂質合成途徑中的關鍵酶，在脂肪沉積中發(fā)揮著重要作用，當脂肪細胞分化時，脂滴增多，即FAS和ACC表達增加[15]。本研究結果表明，蕨菜超臨界萃取物在mRNA水平對FAS和ACC表達下調明顯，從而明顯減少了細胞內三酰甘油脂滴生成。

綜上所述，蕨菜超臨界萃取物能夠明顯抑制3T3-L1細胞分化，減少細胞脂肪沉積，可能是通過減少脂肪細胞分化轉錄調控因子PPARγ、CEBPα和SREBP-1c的mRNA表達量，下調脂質合成相關基因FAS和ACC的mRNA表達實現(xiàn)的。經GC-MS分析萃取物中的主要化學成分，共鑒定出10種化合物，其中高含量的酚類、醇類可能是其潛在的抑制3T3-L1脂肪細胞分化的活性物質基礎。本研究揭示了蕨菜在肥胖的預防治療中具有潛在的價值。

(致謝：本實驗主要在安徽省黃山學院生態(tài)與健康技術中心和韓國安東國立大學食品科學與生物技術國家重點實驗室完成，感謝胡長玉老師、耿玉闖、武夢雪、王雅莉等同學的幫助，在此致以真誠的感謝。)