祛痘皂的抑菌活性及安全性研究

武子敬，鐘乃順，李明達，張 冰，杜躍中，王 悅

（1.通化師范學(xué)院，通化134002；2.通化朝鮮族學(xué)校，通化134001；3.吉林人參研究院，通化134001）

香皂屬于人們?nèi)粘Ｉ钕礈煊闷?。香皂制作主要通過動植物油與氫氧化鈉等堿性物質(zhì)，在一定條件下發(fā)生皂化反應(yīng)，添加一定香料、發(fā)泡劑和乳化劑等冷卻制備而成[1,2]。在此基礎(chǔ)上適當(dāng)添加某些具有祛痘作用的中藥就制備成祛痘皂，而祛痘皂近年來廣泛運用于人們的日常生活。本研究以中藥提取物制備祛痘皂，考察中藥提取物的抑菌效果及觀察該抗菌香皂生物安全性[3]?，F(xiàn)將研究結(jié)果報告如下。

1 實驗儀器與材料

1.1 實驗材料

黃連50g；黃柏50g；蒲公英50g（藥材均購于通化市醫(yī)藥大廈）；95%乙醇；水楊酸；植物皂基；起泡劑；制皂模具；MH培養(yǎng)基；瓊脂；吐溫-80。

菌種：大腸桿菌；金色葡萄球菌。

實驗動物為昆明種小鼠 （合格證號：SCXK（遼）2015-0001），體重 18～22g，由長春高新醫(yī)學(xué)動物實驗研究中心提供，給予基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)1周，觀察皮膚無破損后進行后續(xù)實驗。

1.2 實驗儀器

MAX-A30002電子天平（深圳市無限量衡器有限公司）；ZNHW-II型智能恒溫電熱套（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；HHS型電熱恒溫水浴鍋（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；KQ-100E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；BG2-246電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；SW-CJ-2F凈化工作臺 （上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；HZQX100恒溫振蕩培養(yǎng)箱（蘇州培英實驗設(shè)備有限公司）；生化培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；立式壓力蒸汽滅菌器（上海云泰儀器儀表有限公司）；圓底燒瓶；冷凝管；索氏提取器；鐵架臺；蒸發(fā)皿；試管；試管架；錐形瓶；移液槍；接種環(huán)；涂布器；酒精燈；培養(yǎng)皿；打孔器；濾紙。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品的提取

取黃連、黃柏和蒲公英等量，用95%的乙醇回流提取，提取2次，每次2h，回收乙醇，濃縮至干備用。

2.2 菌液的制備

2.2.1 菌種的復(fù)蘇

在無菌操作條件下，用接種環(huán)取大腸桿菌菌株，用劃線法接種在已滅菌的培養(yǎng)基中，在36～37℃恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)24h，24h后取出放入4℃冰箱中保存?zhèn)溆肹4]。用同樣方法對金黃色葡萄球菌進行活化。

2.2.2 配制菌懸液

在無菌操作條件下，將活化后的菌種用接種環(huán)分別置于裝有無菌生理鹽水的試管中，振蕩均勻，制成菌懸液備用。

2.3 培養(yǎng)基的制備

稱取24g MH培養(yǎng)基加1000mL蒸餾水，再加入2%的瓊脂，與培養(yǎng)皿一起放入立式壓力蒸汽滅菌器進行121℃，20min高溫滅菌。滅菌后將培養(yǎng)基和培養(yǎng)皿放在已經(jīng)紫外滅菌15min的工作臺上，將液體培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中進行固體培養(yǎng)基的制備，將配制好的固體培養(yǎng)基倒置，放在冰箱里備用[5]。

2.4 樣品和紙片的制備

制備直徑6mm的小圓紙片備用，用95%乙醇稀釋溶解提取的樣品，分別配制20%；40%；60%；80%樣品溶液備用。

2.5 抑菌效果

將95%乙醇；50%水楊酸；20%樣品；40%樣品；60%樣品；80%樣品各樣品分別量取2μL加在滅菌后的紙片上。取出固體培養(yǎng)基，用移液槍加入10μL大腸桿菌的菌液，用涂布器將菌液均勻涂布在固體培養(yǎng)基上，用鑷子取紙片放置在帶有菌液的固體培養(yǎng)基上，做好標(biāo)記。金色葡萄球菌用同樣的方法進行制備。兩種菌液分別做三個平行對照。觀察紙片周圍抑菌圈大小見表1。

表1 各樣品抑菌圈大小

圖1 大腸桿菌的抑菌圈

圖2 金色葡萄球菌的抑菌圈

2.6 菌液稀釋平板計數(shù)

將上述配制好的大腸桿菌菌液取1mL加入9mL無菌水中混勻，吸取1mL加入第2支試管中混勻，在第2支試管中吸取1mL加入到第3支試管中混勻以此類推[6,7]，直至第10支試管。依次標(biāo)明10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9。 取出事先準(zhǔn)備好的固體培養(yǎng)基，用移液槍依次移取菌液20μL均勻的涂布在固體培養(yǎng)基上，做出平行對照。金色葡萄球菌按照同樣的方法制備。將制作完成的平板放入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，取出平板分別數(shù)出各菌液的菌落數(shù)如表2。

表2 各菌液的菌落個數(shù)

2.7 樣品濃度的配制

取樣品分別配制出濃度為20%；15%；10%；5%，備用。

2.8 試管法（MIC最小抑菌濃度法）

取2mL待測樣品試劑，加入50μL吐溫-80搖勻，用移液槍加入已備好10mL培養(yǎng)液的試管中，各樣品濃度分別為20%；15%；10%；5%。在用移液槍向每個試管中加入0.05mL大腸桿菌菌液，置37℃搖床（200rpm）中培養(yǎng)18h，觀察試管澄清度，將開始出現(xiàn)渾濁的試管[8,9]。金色葡萄球菌用同樣的方法制備。

3 祛痘皂的制作

本實驗中制作30g皂，經(jīng)計算應(yīng)加入7.5g樣品提取物。取30g植物皂基，7.5g藥品固體提取物，1mL起泡劑放在小燒杯中，在實驗室超聲波清洗機中50℃超聲融化。融化后，趁熱將液體倒入制皂模具中，置室內(nèi)干燥處塑形干燥，即制備成祛痘皂。

4 安全性實驗

4.1 急性皮膚毒性實驗[10]

實驗方法依據(jù)國標(biāo)GB/T21606-2008《化學(xué)品急性經(jīng)皮毒性實驗方法》規(guī)定執(zhí)行。取祛痘皂使用劑量應(yīng)為3.00g·kg-1，將其研成粉末并稱取 0.30g，加入 10.00g凡士林中混合。選取健康皮膚無破損小鼠4只，在小鼠兩側(cè)背部剪取背毛，露出大小為2.50cm×2.50cm的皮膚。觀察皮膚無破損和滲出，將凡士林混合劑涂敷一側(cè)背部皮膚，另一側(cè)背部涂敷相同劑量的凡士林，做自身對照，觀察動物出現(xiàn)的健康損害效應(yīng)，同時取4只小鼠做平行對照。

4.2 皮膚刺激性實驗

根據(jù)上述國際推薦的方法，劑量設(shè)計為3.00g·kg-1，選取健康皮膚無破損小鼠4只，香皂及動物的處理方法同4.1。香皂涂敷后用4層紗布(3.00cm×3.00cm)固定。在1h、24h、48h和72h觀察涂抹部位皮膚的反應(yīng)。根據(jù)皮膚刺激反應(yīng)評分標(biāo)準(zhǔn)，評價祛痘皂對皮膚的刺激作用[11,12]。

4.3 急性眼刺激實驗[13]

實驗方法仍根據(jù)GB/20609-2008規(guī)定，劑量設(shè)計為0.50 g·kg-1，選取健康小鼠4只，將祛痘皂研成粉末并稱取0.30g，加入10mL生理鹽水充分溶解。將祛痘皂溶液0.1mL滴在小鼠右側(cè)眼睛周圍，左側(cè)眼睛周圍不處理，作自身對照，1h后觀察動物眼睛周圍的刺激作用程度之后，每隔24h觀察一次，連續(xù)觀察7d，按照評分標(biāo)準(zhǔn)進行評分。

5 結(jié)果與討論

5.1 抑菌實驗結(jié)果

經(jīng)抑菌實驗結(jié)果表明，大腸桿菌菌液的最小抑菌濃度為15%，藥含量為25%；金色葡萄球菌菌液的最小抑菌濃度為10%，藥含量為10%。綜合考慮，祛痘皂的最小抑菌濃度應(yīng)大于15%。該祛痘皂具有一定的抑菌作用。經(jīng)3個批次重復(fù)實驗結(jié)果基本一致，表明其抗菌效果穩(wěn)定。

5.2 安全性實驗結(jié)果[14]

5.2.1 急性經(jīng)皮毒性實驗結(jié)果

實驗結(jié)果表明，祛痘皂的粉末涂敷部位皮膚色澤未見明顯改變，未觀察到皮膚有干燥、紅腫、皰疹、滲出等癥狀。受試期間小鼠狀態(tài)良好，沒有出現(xiàn)騷動、萎靡、抓撓皮膚、抽搐和意識障礙等行為表現(xiàn)。祛痘皂未觀察到有急性毒性作用。

5.2.2 皮膚刺激性實驗結(jié)果

結(jié)果顯示，祛痘皂涂敷1h后，有2只受試動物在涂敷部位觀察到了輕微的紅斑，未觀察到水腫[15]。根據(jù)皮膚刺激強度分級標(biāo)準(zhǔn)，求得積分均值為0.5，結(jié)果見表3。因此，認(rèn)定祛痘皂涂敷1h時，對皮膚刺激強度為無刺激性。隨著觀察時間的延長，皮膚刺激癥狀逐漸緩解，72h時在涂敷樣品組未觀察到紅斑及水腫，結(jié)果提示，祛痘皂與皮膚長時間接觸無刺激作用見表3。

表3 祛痘皂皮膚刺激性實驗結(jié)果

5.2.3 急性眼刺激實驗結(jié)果

祛痘皂在含量為30g·L-1生理鹽水溶液對小鼠眼睛周圍接觸1h后，可觀察到小鼠眼睛周圍有些紅腫；接觸24h后觀察發(fā)現(xiàn)，眼睛周圍輕微紅腫；接觸48h后觀察發(fā)現(xiàn)，眼睛周圍紅腫進一步減輕；接觸7d后觀察發(fā)現(xiàn)，小鼠眼睛周圍刺激癥狀全部消失。結(jié)果提示，祛痘皂對小鼠眼睛周圍無刺激作用。

5.3 討論

通過對祛痘皂的研究發(fā)現(xiàn)黃連、黃柏和蒲公英三種藥材的提取物具有較好的抗菌活性，且其抑菌效果明顯。急性經(jīng)皮毒性實驗和皮膚刺激實驗進一步證實了祛痘皂對皮膚無明顯刺激作用，生物安全性高。急性眼刺激實驗結(jié)果表明，祛痘皂不會對眼睛周圍造成嚴(yán)重影響。據(jù)很多文獻當(dāng)中可知，黃連、黃柏和蒲公英植物本身就具有抑菌的功效，所以我們把它們加入到香皂當(dāng)中，對于祛痘皂的拓展與開發(fā)起到了良好的作用。

隨著人們對生活必需品品質(zhì)的要求，無化學(xué)添加劑的天然抗菌香皂越來越受到人們的青睞，尤其是抗菌譜廣以及適用于特殊人群的抗菌香皂更受歡迎。黃連、黃柏和蒲公英有較強的抗菌和消炎作用，且其抗菌譜廣資源豐富非常適合用于開發(fā)具有抗菌作用的產(chǎn)品。本研究結(jié)果顯示祛痘皂不僅具有一定的抗菌作用，且具有良好的生物安全性。