片仔癀調(diào)控膜聯(lián)蛋白A1/VEGF通路對人肝癌細(xì)胞系HepG2作用的影響

賴文芳，黃 鑫，劉俊杰，唐宇恒，林 昱，林 雅，林國清

(1.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122; 2. 福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院傳統(tǒng)內(nèi)科，福建 福州 350004)

片仔癀(Pien Tze Huang，PZH)是我國的傳統(tǒng)名貴中成藥，具有悠久歷史，配方及其制備工藝已被國家保密，該復(fù)方為國家一級中藥保護(hù)品種，由麝香、牛黃、蛇膽、三七等名貴中藥組成。常用于熱毒血瘀所致急慢性病毒性肝炎、癰疽疔瘡、無名腫毒及各種炎癥，具有清熱解毒、涼血化瘀、消腫止痛的功效[1-2]。近年來，越來越多關(guān)于片仔癀對肝病的作用機(jī)制研究，鄭海音等[3]研究發(fā)現(xiàn)，片仔癀對CCl4所致肝纖維化大鼠具有保護(hù)作用，其機(jī)制與抑制NF-κB的表達(dá)有關(guān)；陳志亮等[4]研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)方片仔癀肝寶一定程度上能夠改善酒精性肝損傷的肝功能并能夠通過抑制酒精引起的SREBP2和HMGCRa蛋白表達(dá)的升高，從而起到保護(hù)肝臟的作用；同時也有研究發(fā)現(xiàn)片仔癀對肝細(xì)胞性肝癌患者，可緩解疼痛、縮小瘤體、抑制腫瘤轉(zhuǎn)移；能明顯提高毒熱瘀結(jié)型肝癌患者血液NK、CD4、CD4/CD8含量，改善患者經(jīng)肝動脈化療栓塞所致的免疫抑制，增強(qiáng)機(jī)體免疫功能而產(chǎn)生一定抗肝癌作用。

膜聯(lián)蛋白 A1(annexin A1，ANXA1)是結(jié)構(gòu)相關(guān)鈣依賴的磷脂結(jié)合蛋白超家族成員之一，參與調(diào)控炎性反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞分泌和信號傳導(dǎo)等進(jìn)程[5]，ANXA1 是重要的炎性調(diào)控蛋白，能夠參與炎性反應(yīng)；且ANXA1表達(dá)的增加與NF-κB活性增強(qiáng)關(guān)系密切，NF-κB是一組具特殊DNA結(jié)合序列的轉(zhuǎn)錄因子[6]，諸多研究發(fā)現(xiàn)其能夠控制細(xì)胞增殖和癌變，且可促進(jìn)腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)，是分子量在40 000～45 000的同源二聚體糖蛋白，在腫瘤細(xì)胞和相鄰免疫細(xì)胞中，以自分泌或旁分泌的方式影響著早期腫瘤血管的發(fā)生發(fā)展過程[7]。有研究表明，VEGF在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起到促進(jìn)新生血管生成的作用[8]，同時為腫瘤細(xì)胞生長提供必需的氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)[9-10]。

本文以ANXA1及其下游VEGF/VEGF受體、NF-κB信號通路為機(jī)制研究的切入點(diǎn)，通過研究片仔癀對人肝癌細(xì)胞HepG2的作用，從細(xì)胞水平闡明片仔癀抑制肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)，也為研究中藥復(fù)方多靶點(diǎn)、多途徑產(chǎn)生藥效的機(jī)制提供一定借鑒。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞人肝癌細(xì)胞HepG2購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院。

1.2 藥品與試劑片仔癀(漳州片仔癀藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，規(guī)格：每粒重3 g，批號：0908035)；胎牛血清(HyClone，貨號：SV 30087.02)；β-Actin 抗體(碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號：AA128)；PCNA抗體(Cell Signaling Technology，貨號：#13110)；Bax抗體(Cell Signaling Technology，貨號：#5023)；Bcl-2抗體(Cell Signaling Technology，貨號：#15071)；cleaved caspase-3抗體(Cell Signaling Technology，貨號：#9661)；cleaved caspase-9抗體(Cell Signaling Technology，貨號：#20750)；ANXA1抗體(Abcam，貨號：ab97485)；VEGF抗體(Cell Signaling Technology，貨號：#2463)；VEGFR抗體(Cell Signaling Technology，貨號：#9698)；NF-κB p50抗體(Cell Signaling Technology，貨號：#3035)；總RNA提取試劑盒(QIAGEN，貨號：74104、74106)；cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fermentas，貨號：K1622)；TaqMan? Universal PCR Master Mix(Applied Biosystems，貨號：R11022)；超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號：P0018)。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器熒光定量PCR儀(Applied Biosystems，型號：7900HT)；多功能酶標(biāo)儀(TECAN，型號：Infinite M200 Pro)；小型垂直電泳槽(Bio-rad，型號：Mini PROTEAN Tetra)；小型轉(zhuǎn)印槽(Bio-rad，型號：Mini Trans-Blot)；凝膠成像系統(tǒng)(Bio-rad，型號：ChemiDoc XRS+)。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)采用含有10% FBS，50 U·mL-1青霉素和50 mg·L-1鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)HepG2細(xì)胞，置于6孔板培養(yǎng)3 h(37 ℃，5% CO2)。用培養(yǎng)基小心清洗未黏附的細(xì)胞，然后加入含有10% FBS，rhGM-CSF(1 000 U·mL-1)，50 U·mL-1青霉素和50 mg·L-1鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液，每2天置換一半新鮮培養(yǎng)液。

2.2 MTT實(shí)驗(yàn)取對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化5min，收集培養(yǎng)瓶中細(xì)胞。用RPMI1640 培養(yǎng)液制備成細(xì)胞懸液，并對細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，使細(xì)胞密度為1×105個·mL-1。之后將細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔為100 μL，培養(yǎng)12 h，使細(xì)胞貼壁生長。細(xì)胞分為空白對照組(Normal)、片仔癀不同濃度劑量組(濃度分別為1、10、100 mg·L-1)，每孔DMSO的使用濃度為0.5%，每組細(xì)胞設(shè)6個重復(fù)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h后，吸棄孔中的培養(yǎng)液，并每孔加入已配好的MTT 溶液10 μL，MTT濃度為5 mg·mL-1，于37 ℃ 孵育4 h 后吸棄各孔中的培養(yǎng)液，加入100 μL 的DMSO，振蕩混勻2min，使結(jié)晶充分溶解，用多功能酶標(biāo)儀測定各孔吸光度值(即A 值)，檢測波長為570 nm，細(xì)胞活力的計(jì)算公式如下。

HepG2細(xì)胞活力/%=[各實(shí)驗(yàn)組A值/對照組A值]×100%。

2.3 集落形成實(shí)驗(yàn)取對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞，6孔板每孔接種2×105個細(xì)胞，培養(yǎng)12 h后，分別用片仔癀不同濃度劑量組(濃度分別為1 mg·L-1、10 mg·L-1、100 mg·L-1)作用，培養(yǎng)24 h，每孔接種2×105細(xì)胞于6孔板，用RPMI1640 培養(yǎng)液培養(yǎng)，隔天更換1次培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為7～8 d，在倒置顯微鏡下，觀察并計(jì)算集落形成的情況與數(shù)量。

2.4 Western blot 檢測蛋白表達(dá)提取細(xì)胞總蛋白，按照SDS-PAGE凝膠配制試劑盒說明書配置合適濃度的分離膠。上樣，電泳至藍(lán)色帶剛好跑到凝膠底部時終止電泳。轉(zhuǎn)膜成功后TBS洗一遍，把PVDF膜浸泡在封閉液中，置于搖床上室溫封閉2 h。孵育一抗：封閉好的PVDF膜用TBS洗滌10 min，按抗體說明書提供稀釋比例加入一抗稀釋液，各一抗稀釋倍數(shù)分別為Bax一抗(1 ∶800)、Bcl-2一抗(1 ∶800)、cleaved caspase-3一抗(1 ∶800)、cleaved caspase-9一抗(1 ∶600)、ANXA1一抗(1 ∶800)、VEGF一抗(1 ∶800)、VEGFR一抗(1 ∶800)、NF-κB p50一抗(1 ∶600)、PCNA(1 ∶3 000)、β-actin(1 ∶3 000)。4 ℃孵育過夜。孵育二抗，搖床室溫孵育2 h。收集二抗稀釋液，PVDF膜用TBS洗滌(10 min×3)，顯影。

3 結(jié)果

3.1 不同濃度的片仔癀對HepG2細(xì)胞活性的影響用MTT比色法檢測各組HepG2細(xì)胞的活性，研究發(fā)現(xiàn)，與空白對照組比較，經(jīng)不同濃度片仔癀處理后，A值明顯升高(P<0.05)，且隨著片仔癀濃度的升高，抑制作用也逐漸增強(qiáng)，見Fig 1。

*P<0.05,**P<0.01vsnormal

用集落形成實(shí)驗(yàn)檢測不同濃度的片仔癀對HepG2細(xì)胞集落形成能力(即細(xì)胞存活能力)的影響，研究發(fā)現(xiàn)，與空白對照組比較，不同濃度的片仔癀能夠抑制HepG2細(xì)胞集落形成數(shù)量，且隨著片仔癀濃度的升高，對HepG2細(xì)胞存活的抑制作用也增強(qiáng)(P<0.05)，見Fig 2。

3.2 不同濃度的片仔癀對HepG2細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響研究發(fā)現(xiàn)，與空白對照組比較，經(jīng)不同濃度片仔癀作用后，能夠促進(jìn)細(xì)胞凋亡的Bax，cleaved caspase-3，cleaved caspase-9蛋白的表達(dá)，同時抑制Bcl-2蛋白的表達(dá)，結(jié)果表明，片仔癀對HepG2細(xì)胞的凋亡相關(guān)蛋白具有一定作用，且隨著片仔癀濃度升高，對HepG2細(xì)胞凋亡的抑制作用也增強(qiáng)，見Fig 3。

Fig 2 Effect of PZH on HepG2 cell survival n=6)*P<0.05, **P<0.01 vs normal

Fig 3 Effect of salidroside on Bax, Bcl-2, cleaved caspase-3, cleaved caspase-9 protein expression of HepG2 n=6)

*P<0.05,**P<0.01vsnormal

3.3 不同濃度的片仔癀調(diào)控膜聯(lián)蛋白A1/VEGF通路對HepG2細(xì)胞的影響研究發(fā)現(xiàn)，與空白對照組比較，經(jīng)不同濃度片仔癀作用后，能夠促進(jìn)ANXA1蛋白表達(dá)，且隨著片仔癀濃度升高，ANXA1蛋白也升高；同時，片仔癀能夠抑制VEGF及其受體VEGFR的蛋白表達(dá)，且隨著片仔癀濃度的升高，其抑制作用增強(qiáng)；提取HepG2細(xì)胞細(xì)胞核蛋白，檢測NF-κB p50核轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果表明，片仔癀能夠抑制NF-κB p50核轉(zhuǎn)錄水平，且隨著片仔癀濃度的升高，其抑制作用增強(qiáng)，見Fig 4。

Fig 4 Effect of salidroside on ANXA1, VEGF, VEGFR protein and NF-κB p50 nuclear protein expression of HepG2 n=6)

**P<0.01vsnormal

4 討論

肝癌在全球癌癥發(fā)病率排名第六位，其致死人數(shù)排名第四位的惡性腫瘤[8]。目前早期肝細(xì)胞癌的治療主要以外科手術(shù)切除為首選[9]，但術(shù)后復(fù)發(fā)率高，預(yù)后較差。因此，探索抑制肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，尋找更有效安全治療藥物是當(dāng)務(wù)之急。片仔癀是我國的傳統(tǒng)名貴中成藥，常用于急慢性病毒性肝炎，具有清熱解毒、涼血化瘀、消腫止痛的功效。近年來，越來越多關(guān)于片仔癀對肝細(xì)胞性肝癌患者的研究，本文主要研究片仔癀對人肝癌細(xì)胞系 HepG2 作用的影響，結(jié)果表明，片仔癀能夠抑制HepG2細(xì)胞活性及抑制HepG2細(xì)胞集落形成數(shù)量(即細(xì)胞存活能力)。

腫瘤細(xì)胞是通過在細(xì)胞內(nèi)外過度表達(dá)抗凋亡因子，使平衡朝向自身生存，對細(xì)胞凋亡抵抗，從而導(dǎo)致腫瘤生長控制的喪失[10-11]。Bcl家族的蛋白在細(xì)胞凋亡過程中起到非常重要的引導(dǎo)作用，主要包括促凋亡基因，如Bax，及抗凋亡基因，如Bcl-2[12-13]。caspase-3 是由CASP3基因編碼的，外部死亡受體途徑和內(nèi)在線粒體途徑啟動后共同的效應(yīng)酶，在肝癌細(xì)胞凋亡中明顯表達(dá)[14]。而caspase-9由 CASP9 基因編碼的凋亡啟動蛋白酶，通過磷酸化再進(jìn)行調(diào)控激活，引發(fā)線粒體內(nèi)部活化凋亡途徑，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是癌癥治療中細(xì)胞死亡的首選模式[15]，是癌癥治療關(guān)鍵。本研究通過檢測片仔癀對HepG2細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響，發(fā)現(xiàn)片仔癀可以促進(jìn)促凋亡因子Bax、caspase-3和caspase-9片段的表達(dá)，減少抗凋亡基因 Bcl-2 的表達(dá)，對凋亡相關(guān)蛋白具有調(diào)控作用。

為進(jìn)一步探討片仔癀抑制HepG2細(xì)胞活性及對凋亡相關(guān)蛋白調(diào)控作用的機(jī)制，本研究立足于ANXA1及下游通路的活化，ANXA1參與調(diào)控細(xì)胞凋亡和信號傳導(dǎo)等進(jìn)程[5]，ANXA1表達(dá)的增加與NF-κB活性增強(qiáng)關(guān)系密切，NF-κB能夠控制細(xì)胞增殖和癌變，且可促進(jìn)腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移；VEGF在腫瘤細(xì)胞和相鄰免疫細(xì)胞中，以自分泌或旁分泌的方式影響著早期腫瘤血管的發(fā)生發(fā)展過程[7]。在此基礎(chǔ)上，本研究發(fā)現(xiàn)片仔癀可以促進(jìn)ANXA1蛋白表達(dá)，抑制其下游蛋白VEGF及其受體VEGFR的表達(dá)，抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子分泌作用；同時，其能夠抑制核蛋白NF-κB p50核轉(zhuǎn)錄水平，作用于腫瘤炎癥。

綜上所述，片仔癀能夠抑制腫瘤細(xì)胞HepG2細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，與其能夠促進(jìn)ANXA1蛋白表達(dá)，抑制VEGF及其受體VEGFR，進(jìn)而抑制核蛋白NF-κB p50核轉(zhuǎn)錄水平，促進(jìn)促凋亡因子Bax、caspase-3和caspase-9片段的表達(dá)，減少抗凋亡基因 Bcl-2的表達(dá)有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，片仔癀具有潛在的抗癌作用，利用細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探討片仔癀對肝癌細(xì)胞的作用及其分子機(jī)制，以期為臨床應(yīng)用片仔癀治療肝癌提供新的理論根據(jù)，為肝癌的藥物治療開辟新途徑。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)在福建中醫(yī)藥大學(xué)生物醫(yī)藥研發(fā)中心完成，感謝各位老師的幫助與支持！)