高遷移率族蛋白2在結(jié)直腸癌組織中的表達及臨床意義

李前，李定明，王衛(wèi)衛(wèi)，邱家聲，陳澤群

（廣東省茂名市人民醫(yī)院 胃腸外科，廣東 茂名 525000）

結(jié)直腸癌是全球范圍內(nèi)第三大常見的惡性腫瘤，也是全球癌癥相關(guān)死亡的第二大原因[1]，由于生活和飲食習(xí)慣的改變，過去10年來，我國結(jié)直腸癌發(fā)病率迅速上升[2-3]。復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致結(jié)直腸癌患者預(yù)后不佳的主要原因[4]，轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者5年生存率約為13.9%[5-6]。高遷移率族蛋白（high-mobility group box，HMGB）是高遷移率族蛋白超家族（HMG）成員之一，含有HMG盒基序，其家族的4個成員分別為HMGB1～4，其中HMGB1和HMGB2都是高度保守的核蛋白，作為染色質(zhì)結(jié)合因子，可結(jié)合DNA并促進轉(zhuǎn)錄蛋白組裝[7]。研究[8-9]證實HMGB1是結(jié)直腸癌的致癌基因，其高表達是預(yù)測結(jié)直腸癌預(yù)后的分子標(biāo)志物。HMGB2在胚胎發(fā)育過程中高表達，主要在成人睪丸和淋巴器官中表達[10]，在前列腺和卵巢癌中發(fā)現(xiàn)HMGB2可調(diào)控細胞增殖、遷移和凋亡[11]。在胃癌中，HMGB2高表達與胃癌預(yù)后不良相關(guān)[12]。然而，結(jié)直腸癌中HMGB2表達模式和臨床意義尚未見報道。本研究通過免疫組化方法評估結(jié)直腸癌患者組織標(biāo)本中HMGB2表達模式及其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

回顧性分析我院2012年1月—2014年1月間胃腸外科收治并行結(jié)直腸癌切除術(shù)患者共82例。納入標(biāo)準(zhǔn)：⑴ 經(jīng)手術(shù)后切除病理診斷為原發(fā)性結(jié)直腸癌患者；⑵ 除結(jié)直腸癌外，不存在其他原發(fā)腫瘤；⑶ 患者檢驗及病例資料完整且有完整隨訪資料者；⑷ 結(jié)直腸癌患者按NCCN指南原則治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：⑴ 不符合上述標(biāo)準(zhǔn)者；⑵ 患者隨訪資料缺失者。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)實施。

1.2 臨床資料收集

從患者病歷資料中提取臨床和病理資料。其中臨床參數(shù)包括如下：年齡、性別、腫瘤部位、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠處轉(zhuǎn)移。根據(jù)國際癌癥控制聯(lián)盟（UICC）和美國癌癥聯(lián)合委員會（AJCC）結(jié)直腸癌TNM分期系統(tǒng)推薦的腫瘤-淋巴結(jié)-轉(zhuǎn)移（TNM）分類系統(tǒng)（第8版）[13]對病理切片進行評估。由2名對患者的臨床資料不知情的病理醫(yī)師對腫瘤樣本進行獨立評估。

1.3 隨訪

無瘤生存時間定義為患者術(shù)后當(dāng)天至隨訪期間腫瘤首次復(fù)發(fā)時間或隨訪截止時間之間的時間間隔。總生存時間定義為患者手術(shù)后當(dāng)天到隨訪期間或死亡或隨訪截止時間之間的時間間隔。術(shù)后通過門診或電話定期隨訪，每半年隨訪1次，隨訪內(nèi)容包括復(fù)發(fā)及生存情況。

1.4 免疫組化

通過孵育5 μm厚的石蠟包埋的結(jié)直腸癌切片行免疫組織化學(xué)染色。將石蠟包埋的切片在二甲苯中脫石蠟并在不同濃度梯度的系列乙醇中再水合；用3%過氧化氫溶液阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，并用3%山羊血清阻斷非特異性抗原。隨后，將抗HMGB2（1:200；英國Abcam公司）一抗4 ℃下孵育于組織切片過夜。以磷酸鹽緩沖鹽水孵育的切片為陰性對照。將切片與過氧化物酶綴合的二抗于37 ℃室溫孵育2 h。待組化切片出現(xiàn)棕黃即終止染色，組織切片用蘇木精復(fù)染，顯微鏡下觀察。

1.5 免疫組化評分

選擇每個載玻片中至少5個隨機視野并由2名病理醫(yī)師獨立評估。陽性細胞的百分比評分：0分=0%細胞染色；1分=1%～10%細胞染色；2分=11%～50%細胞染色；3分=51%～100%細胞染色。染色強度評分如下：0分=陰性染色；1分=弱染色；2分=中度染色；3分=重度染色。最終免疫評分=染色百分比評分×染色強度評分。染色評分0～4分定義為低表達,染色評分6～9分定義為高表達。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

所有分析均使用SPSS 17.0軟件進行。χ2檢驗評估臨床病理因素與HMGB2表達之間的關(guān)系，Kaplan-Meier生存分析及對數(shù)秩檢驗分析和比較患者生存率，Cox比例風(fēng)險回歸模型分析影響結(jié)直腸癌患者預(yù)后的因素，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 結(jié)直腸癌組織中HMGB2的表達

免疫組化顯示HMGB2主要表達于癌細胞細胞核中。全部患者中HMGB2高表達者比例為60.9%（50/82），HMGB2低表達者比例為39.1%（32/82）。HMGB2在結(jié)直腸癌癌組織中代表性免疫組化染色結(jié)果見圖1。

2.2 結(jié)直腸癌組織中HMGB2表達與臨床病理因素的關(guān)系

HMGB2高表達與患者的組織學(xué)分化程度低、臨床分期、T分期、N分期和M分期有關(guān)（均P＜0.05）；與患者年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤位置無關(guān)（均P＞0.05）（表1）。

2.3 結(jié)直腸癌組織中HMGB2表達與患者預(yù)后間的關(guān)系

生存分析示，HMGB2高表達組5年無瘤生存率和總生存率分別為27.7%和32.1%，而HMGB2低表達組5年無瘤生存率和總生存率分別為38.7%和41.5%，HMGB2高表達組無瘤生存率和總生存率均明顯低于HMGB2低表達組（均P＜0.05）（圖2）。

圖1 免疫組織檢測HMGB2表達（標(biāo)尺：100 μm） A：癌組織中HMGB2低表達；B：癌組織中HMGB2高表達Figure 1 Immunohistochemical staining for HMGB2 expression (bar:100 μm) A: Low expression of HMGB2 in cancer tissue; B: High expression of HMGB2 in cancer tissues

表1 結(jié)直腸癌患者中HMGB2表達與臨床病理因素之間的關(guān)系[n（%）]Table 1 Associations between HMGB2 expression and clinicopathologic characteristics in colorectal cancer patients [n (%)]

圖2 不同HMGB2表達狀態(tài)結(jié)直腸癌患者生存曲線Figure 2 Th e survival curves between colorectal cancer patients with diff erent HMGB2 expressions

2.4 結(jié)直腸癌患者無瘤生存率的影響因素分析

單因素分析示：患者臨床分期、T分期、N分期、M分期和HMGB2表達是影響結(jié)直腸癌患者無瘤生存率的危險因素（均P＜0.05），多因素分析示：M分期（P=0.002）和HMGB2表達（P=0.027）是影響結(jié)直腸癌患者無瘤生存率的獨立危險因素（表2）。

2.5 結(jié)直腸癌患者總生存率的影響因素分析

單因素分析示：患者臨床分期、T分期、N分期、M分期、組織分化和HMGB2表達是影響結(jié)直腸癌患者總生存率的危險因素（均P＜0.05），多因素分析示：M分期（P=0.001）和HMGB2表達（P=0.005）是影響結(jié)直腸癌患者總生存率的獨立危險因素（表3）。

表2 結(jié)直腸癌患者術(shù)后無瘤生存率影響因素的單變量與多變量分析Table 2 Univariate and multivariate analyses of factors for disease-free survival in colorectal cancer patients

表3 結(jié)直腸癌患者術(shù)后總生存率影響因素影的單變量與多變量分析Table 3 Univariate and multivariate analyses of factors for overall survival in colorectal cancer patients

3 討 論

隨著結(jié)腸鏡篩查的普及，越來越多的結(jié)直腸癌患者在疾病早期被診斷，但仍存在部分患者確診時已處于中晚期，導(dǎo)致術(shù)后效果欠佳[14-18]。

HMGB2蛋白是H M G蛋白家族之一，位于4q34.1上，分子量約15 kD，盡管其與癌基因HMGB1高度同源且80%蛋白質(zhì)相似，但其在癌癥中的表達模式和功能研究少見報道[19-22]。

最近研究[12]報道在198例胃癌癌組織中，HMGB2高表達占110例，低表達占88例，這與本研究結(jié)果類似。本研究發(fā)現(xiàn)HMGB2高表達與結(jié)直腸癌患者組織學(xué)分化程度低、臨床分期晚、T分期、N分期和M分期密切相關(guān)（均P＜0.05），提示HMGB2高表達患者腫瘤分化程度低且處于臨床晚期。HMGB2高表達與結(jié)直腸癌患者年齡、性別、腫瘤大小和腫瘤位置間無明顯關(guān)系。文獻[12]報道HMGB2高表達與胃癌患者晚期臨床分期相關(guān)，結(jié)果與本研究類似。

本研究發(fā)現(xiàn)HMGB2高表達組患者無瘤生存率和總生存率均顯著低于HMGB2低表達組患者，提示HMGB2高低表達組患者無瘤生存率和總生存率存在差異。單因素和多因素分析均顯示HMGB2表達是影響結(jié)直腸癌患者無瘤生存率和總生存率的獨立危險因素。Kwon等[23]報道肝細胞癌患者癌組織中HMGB2高表達與患者總生存率低顯著相關(guān)，且敲降HMGB2表達可在體外抑制肝癌細胞的增殖和侵襲能力。Wu等[24]證實HMGB2蛋白在多形性膠質(zhì)母細胞瘤中的表達顯著高于正常腦組織，HMGB2高表達是影響多形性膠質(zhì)母細胞瘤患者總生存率的唯一獨立危險因素，體外沉默HMGB2表達可顯著降低癌細胞活力、侵襲能力并顯著抑制小鼠體內(nèi)成瘤能力。上述研究結(jié)果均提示HMGB2高表達促進腫瘤進展，且和腫瘤預(yù)后不良密切相關(guān)。

在結(jié)直腸癌中HMGB2表達影響預(yù)后的機制尚不清楚，可能機制如下：⑴ HMGB2基因表達可能參與癌細胞的凋亡：文獻[25]報道在結(jié)直腸癌細胞系中，HMGB2表達水平高于正常結(jié)直腸癌細胞系，結(jié)直腸癌細胞系HMGB2高表達通過調(diào)節(jié)P53基因表達抑制癌細胞凋亡。⑵ 在結(jié)直腸癌中，HMGB2基因受到長鏈非編碼RNA表達調(diào)節(jié)，研究顯示長鏈非編碼RNA CRCMSL可顯著降低癌細胞系中HMGB2基因表達水平，進而抑制癌細胞增殖和侵襲能力，并促進凋亡[26]。⑶ HMGB2表達影響癌細胞糖代謝過程，研究發(fā)現(xiàn)在乳腺癌細胞中[21]，HMGB2通過靶向乳酸脫氫酶B和果糖-1，6-二磷酸酶1促進乳腺癌細胞的代謝重編程過程而加速癌癥進展。本研究中發(fā)現(xiàn)的HMGB2高表達與患者不良預(yù)后相關(guān)是否與上述因素相關(guān)需要進一步研究。

本研究存在如下局限性：本研究為單中心回顧性研究，病例數(shù)目較少，尚需要多中心大樣本研究來證實本研究結(jié)論；未探討HMGB2影響結(jié)直腸癌患者預(yù)后的分子機制。

總之，結(jié)直腸癌中HMGB2表達與患者惡性臨床病理特征密切相關(guān)；HMGB2表達是影響結(jié)直腸癌患者預(yù)后的獨立危險因素。