豬傳染性胃腸炎病毒膜蛋白親和肽的原核表達(dá)及其病毒親和性分析

于天飛，董慧瑩，謝鵬宇，孫婉姝，尹海暢，黎 明，于志丹

(1．齊齊哈爾大學(xué) 生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2．黑龍江省抗性基因工程與寒地生物多樣性保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 齊齊哈爾 161006；3. 齊齊哈爾大學(xué) 計算機(jī)與控制工程學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

豬傳染性胃腸炎(Transmissible gastroenteritis，TGE)是由豬傳染性胃腸炎病毒(Transmissiblegastroenteritisvirusof swine，TGEV)引起的接觸性、傳染性腸道疾病[1]。感染后，2 周齡以內(nèi)仔豬死亡率高達(dá)100%，5 周齡以上的豬死亡率較低，成年豬一般無死亡現(xiàn)象[2]。TGEV為巢狀病毒目(Nidovirales)冠狀病毒科(Coronaviridae)冠狀病毒屬(Coronavirus)成員，它是仔豬急性病毒性腹瀉的重要病原之一，可導(dǎo)致養(yǎng)豬業(yè)遭受破壞性的經(jīng)濟(jì)損失[3]。1933年，TGEV首次報告于美國。中國在1970年第1次檢測到TGEV[4]。

TGEV基因組為不分節(jié)段的單股正鏈RNA，長度約28.5 kb，可分別編碼纖突(Spike)蛋白、包膜(E)蛋白、膜(M)蛋白和核衣殼(N)蛋白等4 種結(jié)構(gòu)蛋白以及5種非結(jié)構(gòu)蛋白[5]。TGEV M蛋白高度糖基化，有助于病毒核衣殼與囊膜結(jié)合[6]。M蛋白羧基末端暴露于病毒顆粒外表面，具有良好的免疫原性和反應(yīng)原性[7]。

病毒親和肽可與病毒特異性結(jié)合，在診斷和治療領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景[8]。Zou等[9]曾通過噬菌體展示技術(shù)對TGEV病毒親和肽進(jìn)行了篩選。其對含有TGEV M蛋白的重組蛋白為靶分子進(jìn)行了5 輪生物淘選，成功篩選出10 種能與靶分子蛋白結(jié)合的十二肽，并通過噬菌體ELISA驗(yàn)證了親和肽與病毒粒子的親和性。本研究選取這10 種十二肽中親和性最強(qiáng)的3 種，通過串聯(lián)表達(dá)方法進(jìn)行體外表達(dá)，并利用Western Blot、Dot-ELISA等方法檢測重組蛋白的病毒親和性。本研究為建立TGEV感染診斷方法和檢測技術(shù)奠定了一定的物質(zhì)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌種、質(zhì)粒和抗體 原核表達(dá)載體pET-32a、pGEX-6p-1、大腸桿菌DH5α和Rosetta(DE3)由齊齊哈爾大學(xué)生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院動物免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。TGEV陽性血清購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記His標(biāo)簽單克隆抗體和HRP標(biāo)記GST標(biāo)簽單克隆抗體購自Thermo Fisher公司。HRP標(biāo)記羊抗豬抗體購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。TGEV H株(1×105TCID50/mL)由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑 異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)、DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、T4DNA連接酶、BamHⅠ和XhoⅠ限制性內(nèi)切酶購自TaKaRa公司。高保真KOFTaq酶、dNTP mix和4氯-1-奈酚(4-CN)購自哈爾濱超峰生物科技發(fā)展有限公司。質(zhì)粒提取試劑、膠回收試劑盒，購自上海近岸科技有限公司。蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)購自Thermo Fisher公司。其余常規(guī)試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 TGEV M蛋白親和肽基因的設(shè)計與合成 根據(jù)Zuo等[9]的研究結(jié)果，從10 種可與TGEV M蛋白結(jié)合的十二肽中選取親和力最強(qiáng)的3種，每種親和肽之間用linker(AAAK)連接。根據(jù)設(shè)計好的重組蛋白序列，對其推導(dǎo)的核苷酸序列依據(jù)大腸桿菌偏愛密碼子進(jìn)行優(yōu)化，并交由哈爾濱博仕生物技術(shù)有限公司進(jìn)行合成，合成基因插入到pUC57質(zhì)粒中，該質(zhì)粒命名為pUC57-MQHT。pUC57-MQHT用無菌去離子水進(jìn)行1∶10 000稀釋，作為PCR模板。

1.2.2 M蛋白親和肽基因的亞克隆 根據(jù)合成的基因序列，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計合成1對引物。PU：5′-CGCGGATCCGAATGCATCAAGAT CAAT-3′；PL：5′-GGGCCGCTCGAGTTAATCCGATAT TGG-3′。

上游引物PU插入BamHⅠ酶切位點(diǎn)，下游引物PL插入XhoⅠ的酶切位點(diǎn)(下劃線表示)。該引物由哈爾濱博仕生物技術(shù)有限公司合成。合成后的引物稀釋成50 pmol/μL，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

將2×Taq酶預(yù)混液(包含Buffer，dNTP)12.5 μL，PU 0.5 μL(25 pmoL/μL)，PL 0.5 μL(25 pmol/μL)，模板0.5 μL，ddH2O 10.5 μL，KOFTaq酶0.5 μL，共25 μL。PCR程序設(shè)計為，94 ℃ 1 min 30 s；94 ℃ 30 s，40 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)；72 ℃ 7 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.3 重組表達(dá)載體的構(gòu)建 PCR產(chǎn)物、表達(dá)載體pET-32a和pGEX-6p-1分別用BamHⅠ與XhoⅠ雙酶切。酶切產(chǎn)物經(jīng)膠回收。將回收后的PCR產(chǎn)物與pET-32a或pGEX-6p-1連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布含氨芐青霉素(Amp)100 μg/mL 的LB平板，37 ℃過夜培養(yǎng)。挑取單菌落接種至含有Amp 100 μg/mL的液體LB中，37 ℃過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒。單、雙酶切鑒定質(zhì)粒。將相應(yīng)克隆菌寄送哈爾濱博仕生物科技有限公司進(jìn)行序列測定。測序鑒定正確的重組質(zhì)粒分別命名為pET-32a-MQHT和pGEX-6p-MQHT。

1.2.4 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 將重組質(zhì)粒pET-32a-MQHT和pGEX-6p-MQHT分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta(DE3)，涂布LB平板(Amp，100 μg/mL)。過夜培養(yǎng)，挑取單菌落，獲得重組菌株。重組菌首先接種LB液體培養(yǎng)基(Amp，100 μg/mL)，37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜。再以1%比例轉(zhuǎn)接新鮮的LB液體培養(yǎng)基，37 ℃振蕩培養(yǎng)2～3 h后，測菌液OD600達(dá)0.5～0.6時，加入至終濃度1.0 mmol/L IPTG 37 ℃誘導(dǎo)1～4 h后收獲細(xì)菌，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。重組蛋白分別命名為TRX-MQHT和GST-MQHT。

1.2.5 重組蛋白的純化及鑒定 重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后，用0.3 mol/L 4 ℃預(yù)冷的KCl溶液預(yù)染5 min，切下含目的蛋白的凝膠，碾碎，加入PBS懸起，反復(fù)凍融3 次，10 000 r/min離心5 min，取上清液。采用Bradford檢測法分別對重組蛋白TRX-MQHT和GST-MQHT的含量進(jìn)行測定[10]。純化的重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE后，轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素(NC)膜，5%脫脂乳4 ℃封閉過夜，PBST洗3 遍，浸入1∶100稀釋的HRP標(biāo)記的His標(biāo)簽單克隆抗體或HRP標(biāo)記的GST標(biāo)簽單克隆抗體中，37 ℃作用2 h，PBST洗滌3 次后用4-CN顯色。

1.2.6 Western Blot鑒定重組蛋白的病毒親和性 純化的重組蛋白TRX-MQHT或GST-MQHT經(jīng)SDS-PAGE后，轉(zhuǎn)印至NC膜上，5%脫脂乳4 ℃封閉過夜，PBST洗3 遍，3 min/次，浸入TGEV H株(1×105TCID50)稀釋液中，37 ℃作用2 h，PBST洗3 遍，3 min/次，浸入PBS稀釋的質(zhì)量濃度為1 mg/mL的重組蛋白GST-MQHT或TRX-MQHT中，室溫作用2 h，PBST洗滌3 遍，3 min/次，浸入1∶1 000稀釋的HRP標(biāo)記GST標(biāo)簽單克隆抗體或His標(biāo)簽單克隆抗體中，室溫作用1 h，PBST洗滌3 遍，3 min/次，用4-CN顯色。

1.2.7 Dot-ELISA鑒定重組蛋白病毒親和性 按照以下步驟進(jìn)行Dot-ELISA操作。在NC膜表面劃4 mm×4 mm小方格，先將NC膜在去離子水中浸泡10 min，取出置于室溫晾干。用微量移液器吸取1 μL 1 mg/mL的重組蛋白TRX-MQHT或GST-MQHT，點(diǎn)于小方格的正中央，置于室溫晾干。將包被的膜片放入5%脫脂乳中，37 ℃封閉作用60 min后取出，PBST洗滌3 次，2 min/次，室溫晾干。將膜片裁剪成小片，點(diǎn)樣面朝上置于96 孔酶標(biāo)板孔內(nèi)，加入100 μL PBS 倍比稀釋的TGEV H株中(1∶100，1∶200，1∶400，1∶800)，37 ℃ 60 min；每孔加入150 μL PBST泡洗3 次，2 min/次，再用PBS洗滌1 遍，2 min；加入100 μL 1 mg/mL的重組蛋白GST-MQHT或TRX-MQHT中，37 ℃ 60 min；棄去重組蛋白，每孔加入150 μL PBST泡洗3 次，2 min/次，再用無磷酸鹽緩沖液洗滌1 遍，2 min；每孔加入100 μL 1∶1 000稀釋的GST標(biāo)簽單克隆抗體或His標(biāo)簽單克隆抗體，37 ℃作用30 min；棄去酶標(biāo)抗體，每孔加入150 μL PBST泡洗2 次，2 min/次，再用PBS洗滌1 遍，2 min；每孔加入100 μL顯色液，37 ℃ 避光顯色，5 min后觀察；棄去顯色液，每孔加入150 μL去離子水泡洗3 次，1 min/次，甩干后取出膜片干燥，拍照。

1.2.8 阻斷試驗(yàn) 將TGEV H株分別與1∶100，1∶200，1∶400，1∶800稀釋的TGEV陽性血清孵育，4 ℃作用過夜，10 000 r/min離心30 min，取上清。Dot-ELISA法檢測阻斷效果。膜片預(yù)處理按前述方法進(jìn)行。按1.2.7中所述的Dot-ELISA方法進(jìn)行檢測，觀察其反應(yīng)情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒pET-32a-MQHT和pGEX-6p-MQHT的酶切鑒定

構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET-32a-MQHT、pGEX-6p-MQHT分別采用BamHⅠ單酶切和BamHⅠ/XhoⅠ雙酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果表明，pET-32a-MQHT經(jīng)BamHⅠ單酶切獲得了6 050 bp的DNA條帶，BamHⅠ/XhoⅠ雙酶切獲得了5 900 bp的載體片段和大小為150 bp的目的條帶；pEGX-6p-MQHT經(jīng)BamHⅠ單酶切獲得了5 140 bp的DNA條帶，BamH Ⅰ/XhoⅠ雙酶切獲得了4 990 bp的載體片段和大小為150 bp的目的條帶(圖1)。上述酶切結(jié)果與預(yù)期一致。測序結(jié)果證明插入位置與閱讀框均正確。

2.2 重組蛋白的表達(dá)

將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET-32a-MQHT和pGEX-6p-MQHT分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta(DE3)，經(jīng)1.0 mmol/L IPTG誘導(dǎo)后1，2，3，4 h取樣，SDS-PAGE檢測全菌體細(xì)胞沉淀，結(jié)果表明，獲得的重組蛋白TRX-MQHT和GST-MQHT大小分別為25，31 ku，與預(yù)期相符(圖2，箭頭所示)。

M1.DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)DL15000；1.pET-32a空載體BamHⅠ單酶切；2.pET-32a-MQHTBamHⅠ單酶切；3.pET-32a-MQHTBamHⅠ/XhoⅠ雙酶切；4.pGEX-6p-1空載體BamHⅠ單酶切；5.pGEX-6p-MQHTBamHⅠ單酶切；6.pGEX-6p-MQHTBamHⅠ/XhoⅠ雙酶切；M2. DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000。

M1.DNA Marker DL15000；1.pET-32a digested byBamHⅠ；2.pET-32a-MQHT digested byBamHⅠ；3.pET-32a-MQHT digested byBamHⅠ/XhoⅠ； 4.pGEX-6p-1 digested byBamHⅠ；5.pGEX-6p-MQHT digested byBamHⅠ；6.pGEX-6p-MQHT digested byBamHⅠ/XhoⅠ；M2. DNA Marker DL2000.

圖1 重組表達(dá)載體pET-32a-MQHT和pGEX-6p-MQHT的酶切鑒定
Fig.1 Identification of recombinant expressionvectors by restriction enzyme digestion

A.SDS-PAGE檢測重組蛋白TRX-MQHT的表達(dá)： M.蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.誘導(dǎo)前的pET-32a空載體；2.誘導(dǎo)后4 h的pET-32a空載體；3.未誘導(dǎo)的pET-32a-MQHT/E.coliRosetta(DE3)重組菌；4-7.誘導(dǎo)1～4 h的pET-32a-MQHT/E.coliRosetta(DE3)重組菌。B.SDS-PAGE檢測重組蛋白GST-MQHT的表達(dá)：M.蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.誘導(dǎo)前的pGEX-6p-1空載體；2.誘導(dǎo)后4 h的pGEX-6p-1空載體；3.未誘導(dǎo)的pGEX-6p-MQHT/E.coliRosetta(DE3)重組菌；4-7.誘導(dǎo)1～4 h的pGEX-6p-MQHT/E.coliRosetta(DE3)重組菌。

A.Detection of recombinant protein TRX-MQHT by SDS-PAGE：M.Protein Marker; 1.pET-32a/E.coliRosetta(DE3) before induction; 2.pET-32a/E.coliRosetta(DE3) induced for 4 h;3.pET-32a-MQHT/E.coliRosetta(DE3) before induction; 4-7.pET-32a-MQHT/E.coliRosetta(DE3) induced for 1-4 h. B.Detection of recombinant protein GST-MQHT by SDS-PAGE：M.Protein Marker; 1.pGEX-6p-1/E.coliRosetta(DE3) before induction; 2.pGEX-6p-1/E.coliRosetta(DE3) induced for 4 h;3.pGEX-6p-MQHT/E.coliRosetta(DE3) before induction; 4-7.pGEX-6p-MQHT/E.coliRosetta(DE3) induced for 1-4 h.

圖2 重組蛋白的SDS-PAGE分析
Fig.2 SDS-PAGE analysis of recombinant protein

2.3 重組蛋白的純化及鑒定

重組蛋白TRX-MQHT和GST-MQHT的切膠純化結(jié)果如圖3-A所示。經(jīng)His標(biāo)簽單克隆抗體和GST標(biāo)簽單克隆抗體鑒定的結(jié)果表明，所獲得的表達(dá)蛋白為重組蛋白(圖3-B)。

2.4 Western Blot鑒定重組蛋白的病毒親和性

純化的重組蛋白TRX-MQHT或GST-MQHT轉(zhuǎn)印至NC膜上后，與TGEV病毒粒子孵育，再與重組蛋白GST-MQHT或TRX-MQHT孵育，最后用抗GST或His單抗進(jìn)行檢測，如圖4所示，2種重組蛋白都顯示出陽性印記，而對照TRX或GST標(biāo)簽蛋白無印記。

2.5 Dot-ELISA鑒定重組蛋白病毒親和性

純化的重組蛋白TRX-MQHT或GST-MQHT包被至NC膜上后，與TGEV病毒粒子孵育，再與重組蛋白GST-MQHT或TRX-MQHT孵育，最后用抗GST或His單抗進(jìn)行檢測，如圖5所示，2 種重組蛋白在1×103，5×102，2.5×102TCID50/mL 3 個滴度時都顯示出陽性印記，而在1.25×102TCID50/mL滴度時無可見斑點(diǎn)，2 種重組蛋白檢測TGEV的最低滴度無明顯差異,檢測TGEV的敏感性為2.5×102TCID50/mL。TGEV親和性良好。

A.重組蛋白TRX-MQHT和GST-MQHT純化結(jié)果：M.蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.TRX-MQHT；2.GST-MQHT；3.TRX蛋白；4.GST蛋白。B.重組蛋白TRX-MQHT和GST-SQHT Western Blot鑒定結(jié)果：1.TRX-MQHT；2.TRX蛋白；3.GST蛋白；4.GST-MQHT；5.GST蛋白；6.TRX蛋白。

A.Purification results of recombinant protein TRX-MQHT and GST-MQHT： M.Protein Marker; 1.TRX-MQHT；2.GST-MQHT；3.TRX protein；4.GST protein.B.Identification of recombinant protein TRX-MQHT and GST-SQHT by Western Blot：1.TRX-MQHT；2.TRX protein；3.GST protein；4.GST-MQHT; 5.GST protein; 6.TRX protein.

圖3 重組蛋白的純化及鑒定
Fig.3 Purification and identification of recombinant protein

1.TRX-MQHT；2.TRX標(biāo)簽蛋白；3.GST-MQHT；4.GST標(biāo)簽蛋白。1.TRX-MQHT; 2.TRX;3.GST-MQHT; 4.GST.

A.TRX-MQHT；B.GST-MQHT：1.1×103 TCID50/mL；2.5×102 TCID50/mL；3.2.5×102 TCID50/mL；4.1.25×102 TCID50/mL。

2.6 阻斷試驗(yàn)

以重組蛋白TRX-MQHT或GST-MQHT為包被物，以不同濃度稀釋(1∶100，1∶200，1∶400，1∶800)的TGEV陽性血清預(yù)先處理的TGEV H株為捕獲對象，最后以重組蛋白GST-MQHT或TRX-MQHT為二次親和物，進(jìn)行Dot-ELISA檢測。檢測結(jié)果表明(圖6)，1∶100或1∶200稀釋的TGEV陽性血清可完全阻斷TGEV H株(1×105TCID50/mL)與2 種親和肽的結(jié)合。2 種親和肽檢測特異性良好。

A. 包被TRX-MQHT；B. 包被GST-MQHT。1-4. TGEV H株分別與1∶800，1∶400，1∶200，1∶100稀釋的TGEV陽性血清作用。A. TRX-MQHT; B. GST-MQHT.1-4. TGEV H strain co-cultivated with 1∶800, 1∶400, 1∶200, 1∶100 diluted anti-TGEV serum, respectively.

3 結(jié)論與討論

準(zhǔn)確的診斷對于TGE的防控至關(guān)重要。TGE的初步診斷可根據(jù)當(dāng)?shù)氐牧餍胁W(xué)以及疑似病豬的臨床癥狀來進(jìn)行[11]。但由于TGE與豬的其他腹瀉性疾病癥狀相似，因此，TGE的確診必須進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室診斷[12]。目前，已經(jīng)建立了多種TGEV檢測方法，如病毒分離、免疫熒光檢測[13]、電鏡檢測，RT-PCR、納米顆粒輔助RT-PCR[14]、實(shí)時熒光定量RT-PCR[15]、雙抗體夾心ELISA[16]、免疫過氧化物酶單層細(xì)胞試驗(yàn)(IPMA)[17]和DNA芯片[18]等。用于TGEV檢測的RT-LAMP測定法反應(yīng)時間在60 min以內(nèi)，較為省時，可通過瓊脂糖凝膠電泳直接觀察試驗(yàn)結(jié)果[19-20]。M蛋白是TGEV囊膜中豐度較高的結(jié)構(gòu)蛋白，保守性高，其也成為建立各種TGEV檢測方法的候選蛋白。張小波[21]以原核表達(dá)的重組M蛋白作為包被抗原，建立了檢測TGEV抗體的間接ELISA方法，并確定了間接ELISA的最佳工作條件。針對M蛋白制備的單克隆抗體和多克隆抗體亦具有良好的應(yīng)用前景[22-23]。Rodák等[24]制備了針對TGEV N蛋白和M蛋白的單克隆抗體，并建立了競爭-阻斷ELISA檢測方法，敏感性為1×103TCID50/mL。

病毒親和肽在病毒性疾病檢測方面也具有良好的應(yīng)用價值[8]。Zou等[9]以篩選出TGEV M蛋白親和肽中結(jié)合力最高的3 個噬菌體建立了噬菌體ELISA，可以檢測到最低的病毒量為0.02 μg。Suo等[25]采用相似的方法篩選TGEV Spike蛋白親和肽，并以結(jié)合力最高的4 個噬菌體建立了噬菌體ELISA，結(jié)果顯示可以檢測到最低的病毒量為0.1 μg，略優(yōu)于常規(guī)ELISA(最低病毒檢測量為0.6 μg)。本研究表達(dá)的重組M蛋白親和肽與重組的S蛋白親和肽的TGEV親和性是否也有相似的差異，需要進(jìn)一步的試驗(yàn)來確定。本研究初步建立的Dot-ELISA檢測TGEV的敏感性為2.5×102TCID50/mL，繼續(xù)優(yōu)化該Dot-ELISA反應(yīng)條件后，其敏感性可能會有一定程度的提高。原核表達(dá)重組蛋白步驟簡單，操作性強(qiáng)，試劑均為實(shí)驗(yàn)室常用藥品不需要很高的費(fèi)用[26]，以重組表達(dá)的M蛋白親和肽建立的檢測方法有望應(yīng)用到TGEV的臨床診斷中。