GhWRKY48負(fù)調(diào)控棉花對(duì)大麗輪枝菌的抗性

劉建芬，雷 煜，張振楠，胡 廣，唐 葉，張 寧，司懷軍，吳家和

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.中國科學(xué)院 微生物研究所，植物基因組國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100101)

在植物生長發(fā)育過程中，往往會(huì)利用一套復(fù)雜而精致的防衛(wèi)機(jī)理來識(shí)別和應(yīng)答環(huán)境逆境，包括各種生物和非生物脅迫。這里所述的植物防衛(wèi)機(jī)理主要是指通過抗逆基因的轉(zhuǎn)錄激活和抑制來發(fā)揮抗性作用[1]，在此過程中，轉(zhuǎn)錄因子通過與靶基因的順式作用元件特異性結(jié)合來調(diào)控其表達(dá)，從而在植物受到脅迫時(shí)發(fā)揮作用。轉(zhuǎn)錄因子主要包括：NAC、MYB、bZIP、WRKY等；其中WRKY轉(zhuǎn)錄因子是植物所特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，其功能涉及生物和非生物脅迫中的抗性響應(yīng)。

Ishiguro和Nakamura[2]從白薯(IpomoeabatatasL.)中克隆得到第1個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因子SPFl。此后，人們從不同植物中克隆到相應(yīng)的WRKY基因。WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族通常含有1個(gè)或2個(gè)WRKY保守結(jié)構(gòu)域，其N末端含有WRKYGQK保守結(jié)構(gòu)域，C末端有C2H2或C2HC型鋅指結(jié)構(gòu)[3]。根據(jù)所含WRKY結(jié)構(gòu)域的數(shù)量及鋅指結(jié)構(gòu)的不同將WRKY轉(zhuǎn)錄因子分為Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ類；其中，第Ⅱ類根據(jù)其保守結(jié)構(gòu)域的差異，進(jìn)一步被分為：Ⅱa、Ⅱb、Ⅱc、Ⅱd和Ⅱe[4]。目前，許多研究報(bào)道植物WRKY轉(zhuǎn)錄因子參與生物和非生物逆境響應(yīng)。煙草WRKY基因的表達(dá)受到煙草花葉病毒(TMV)、細(xì)菌、真菌、水楊酸和H2O2的誘導(dǎo)[5-7]。在擬南芥中，有很多WRKY轉(zhuǎn)錄因子參與植株的抗病反應(yīng)，如AtWRKY33[8]、AtWRKY40[9]、AtWRKY3[10]、AtWRKY22[11]、AtWRKY48[12]、AtWRKY7[13]等。棉花GhWRKY22表達(dá)受到大麗輪枝菌、水楊酸和茉莉酸誘導(dǎo)，參與棉花的抗病反應(yīng)[14]。然而，新的棉花抗病相關(guān)WRKY轉(zhuǎn)錄因子仍需進(jìn)一步分離和功能鑒定，為棉花抗病育種提供豐富的候選基因。

棉花黃萎病被稱為棉花的癌癥，每年因黃萎病危害造成棉花產(chǎn)量大幅下降，然而，化學(xué)農(nóng)藥和栽培措施很難達(dá)到理想的防治效果。近年來，利用基因工程技術(shù)培育植物抗病品種成為一個(gè)研究方向。本研究從陸地棉(GossypiumhirsutumL.)中分離出1個(gè)與抗病相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子WRKY基因，命名為GhWRKY48。利用基因沉默技術(shù)獲得GhWRKY48沉默植株，對(duì)其進(jìn)行大麗輪枝菌接種試驗(yàn)表明，GhWRKY48基因沉默提高了植株對(duì)大麗輪枝菌的抗性。因此，GhWRKY48是一個(gè)負(fù)調(diào)控抗病的轉(zhuǎn)錄因子，可以作為棉花抗黃萎病育種的候選基因。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

棉花材料為中棉所35，購自山西農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所種苗公司。大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α、根癌農(nóng)桿菌菌株GV3101和陽性對(duì)照載體pYL-156-PDS均由植物基因組學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。黃萎病菌菌株(大麗輪枝菌，V.dahliae)V991，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所簡(jiǎn)桂良研究員饋贈(zèng)。VIGS技術(shù)所需的病毒表達(dá)載體pYL-156和輔助載體pYL-192由清華大學(xué)劉玉樂教授惠增。

各種限制性內(nèi)切酶、RNA提取試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒分別購自大連寶生物公司、上海生工公司和上海捷瑞公司。PCR反應(yīng)所需要的各種試劑、PCR 純化回收試劑盒、PCR 切膠回收試劑盒、T4DNA連接酶、EasyScript One-Step gDNARemovel and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒、克隆載體pEASY-T1試劑盒和TransStart Top Green qPCR SuperMix試劑盒均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 植物材料的種植 將棉花種子用水浸泡，置于37 ℃浸泡過夜，然后移置到培養(yǎng)盒中，置于25 ℃光照12 h黑暗8 h的光照培養(yǎng)箱中處理48 h，等種子發(fā)芽后移置到含1/8MS營養(yǎng)液的培養(yǎng)盒中或種植到營養(yǎng)土中，放置到培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.2 RNA的提取和cDNA第一鏈的合成 棉花不同樣品RNA的提取參照RNA提取試劑盒說明書進(jìn)行。cDNA第一鏈的合成參照EasyScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒說明進(jìn)行。

1.2.3GhWRKY48基因的克隆及系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建 根據(jù)擬南芥AtWRKY48氨基酸序列在棉花基因組數(shù)據(jù)庫(https://www.cottongen.org/)進(jìn)行直系同源比對(duì)，獲得與AtWRKY48高保守性的直系同源基因，命名為GhWRKY48。根據(jù)GhWRKY48基因序列設(shè)計(jì)引物：GhWRKY48-F：5′-ATGAGATTTTCCGATG AGAATTCGAC-3′；GhWRKY48-R：5′-CACTTGTTCA TTAGCCTCGTTCCTC-3′。以棉株根的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物純化后連接到T載體上進(jìn)行測(cè)序。

在NCBI中選取不同植物WRKY48的氨基酸序列，利用MEGA 5.2進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建。

1.2.4 病毒沉默載體pYL-156-GhWRKY48的構(gòu)建 首先克隆GhWRKY48基因的目的片段，擴(kuò)增所用引物為VGhWRKY48-F：5′-CGGGATCCGCGATGATG AAGAACAAGACAAG-3′；VGhWRKY48-R：5′-GGGG TACCGAGACAATGAAGCATACATATAGGG-3′(下劃線分別表示BamH Ⅰ和KpnⅠ酶切位點(diǎn))。通過PCR獲得該片段，用限制性內(nèi)切酶BamH Ⅰ和KpnⅠ酶切pYL-156載體和擴(kuò)增產(chǎn)物，然后進(jìn)行連接反應(yīng)，將片段插入到pYL-156 載體的BamH Ⅰ和KpnⅠ位點(diǎn)之間構(gòu)建成病毒沉默載體pYL-156-GhWRKY48。將載體pYL-156-GhWRKY48轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后，挑選陽性克隆，進(jìn)行測(cè)序鑒定，結(jié)果表明，所獲得的片段是所要克隆的GhWRKY48基因的目的片段。

1.2.5 工程農(nóng)桿菌的培養(yǎng) 用電擊法將已經(jīng)構(gòu)建正確的病毒沉默載體pYL-156-GhWRKY48、輔助載體pYL-192、陽性對(duì)照載體pYL-156-PDS和陰性對(duì)照載體pYL-156轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌GV3101中，經(jīng)卡那霉素(50 mg/mL)、慶大霉素(50 mg/mL)和利福平(25 mg/mL)篩選，挑選陽性克隆，進(jìn)行PCR和測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果表明，病毒沉默載體pYL-156-GhWRKY48、輔助載體pYL-192、陽性對(duì)照載體pYL-156-PDS和陰性對(duì)照載體pYL-156均已經(jīng)轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101。

1.2.6GhWRKY48基因沉默植株的培育 上述驗(yàn)證正確的工程農(nóng)桿菌加到含有卡那霉素(50 mg/mL)、慶大霉素(50 mg/mL)和利福平(25 mg/mL)的液體LB 培養(yǎng)基中，于28 ℃，200 r/min培養(yǎng)過夜，培養(yǎng)液經(jīng)離心后收集菌體，用MMA(10 mmol/L MES，10 mmol/L MgCl2，200 mmol/L AS)溶液重懸菌體，調(diào)節(jié)至終濃度OD600為1.2，放到黑暗處靜置2～3 h，然后將含有pYL-156-GhWRKY48、pYL-156-PDS、pYL-156的農(nóng)桿菌懸浮液分別與含pYL-192的農(nóng)桿菌懸浮液等比例混合均勻備用。當(dāng)棉花兩片子葉完全展開后，可用于農(nóng)桿菌注射侵染；先用針頭在子葉背面輕輕劃1個(gè)小的傷口，然后用1 mL去掉針頭的無菌注射器將菌液從子葉背面的傷口處注射進(jìn)去，盡量使整片子葉全部被侵染，將注射后的植株放到黑暗處處理12 h后，放到培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.7 大麗輪枝菌接種棉花 取適量保存于-80 ℃冰箱的大麗輪枝菌涂布于PDA培養(yǎng)基上[15]，25 ℃培養(yǎng)箱黑暗培養(yǎng)4 d，挑取菌塊于查式培養(yǎng)液[16]，28 ℃ 200 r/min 搖床上培養(yǎng)4～5 d后用8層醫(yī)用紗布過濾除去菌絲，然后通過血球計(jì)數(shù)板計(jì)算大麗輪枝菌孢子數(shù)(Spores)，用無菌水將孢子液的濃度調(diào)整為106spores/mL 待用。

接種方法根據(jù)雷煜[14]所述進(jìn)行，對(duì)14 d的棉株主根進(jìn)行統(tǒng)一傷根處理，然后將其根部浸泡到大麗輪枝菌孢子液中50 min，轉(zhuǎn)移到水培盒中繼續(xù)培養(yǎng)，按照相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)取棉株根樣(0，6，12，24，36，48 h)，保存于-80 ℃冰箱待用。

為了驗(yàn)證WRKY48的抗病功能，對(duì)GhWRKY48沉默植株和對(duì)照植株接種大麗輪枝菌，方法如上所述，接菌23 d后，觀察植株抗病表型、統(tǒng)計(jì)抗病指數(shù)和發(fā)病率。

1.2.8 激素處理 激素處理方法按照先前報(bào)道的進(jìn)行[17]。簡(jiǎn)單地說就是將配置好的茉莉酸(JA)和水楊酸(SA)母液分別加到含有Hoaglangs營養(yǎng)液的培養(yǎng)盒中，使其終濃度分別為0.1，2.0 mmol/L，按照相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)取棉株根樣(0，6，12，24，36，48 h)，保存于-80 ℃冰箱待用。

1.2.9 Quantitative Real-time RT-PCR (qPCR)方法 以cDNA為模板，具體配置參照試劑盒說明進(jìn)行。設(shè)計(jì)特異性引物(qGhWRKY48-F：5′-GAAGGCAAA CACACGCATC-3′；qGhWRKY48-R：5′-CATTAGCCT CGTTCCTCGTCT-3′)，以棉花UBQ7作為內(nèi)參基因(UBQ7-F:5′-GAAGGCATTCCACCTGACCAAC-3′；UBQ7-R:5′-CTTGACCTTCTTCTTCTTGTGCTTG-3′)，生物學(xué)試驗(yàn)重復(fù)3次，基因的相對(duì)表達(dá)量通過2-ΔΔCT方法計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 GhWRKY48基因克隆及序列分析

先前已經(jīng)對(duì)棉花抗病相關(guān)WRKY的功能進(jìn)行初步鑒定和分析，其中GhWRKY48是一個(gè)負(fù)調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子[14]，本研究中對(duì)其抗病功能進(jìn)行進(jìn)一步探討和分析。根據(jù)棉花基因組數(shù)據(jù)庫(https://www.cottongen.org/)已公布的GhWRKY48序列，設(shè)計(jì)特異引物，以棉花根的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物連接到T載體上進(jìn)行測(cè)序。結(jié)果表明，獲得的片段大小與預(yù)期的大小一致，該片段全長882 bp，包含了從ATG到TAG完整的ORF閱讀框，編碼了293個(gè)氨基酸殘基(圖1-A)，DNAMAN分析軟件預(yù)測(cè)分子質(zhì)量為32.68 ku，等電點(diǎn)pI=6.10。

在NCBI中，針對(duì)WRKY48蛋白進(jìn)行搜索，主要獲得5種植物WRKY48的氨基酸序列：擬南芥AtWRKY48 (Arabidopsisthaliana，NP_199763.1)、白菜BrWRKY48(Brassicarapa，NP_001288867.1)、大豆GmWRKY48(Glycinemax，NP_001237221.2)、煙草NaWRKY48(Nicotianaattenuata，XP_019262610.1)。并將其與棉花GhWRKY48構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，由圖1-B可以看出，GhWRKY48與煙草WRKY48蛋白具有較近的親緣關(guān)系。

2.2 GhWRKY48基因組織和激素處理表達(dá)分析

提取棉花根、莖和葉的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用qPCR方法檢測(cè)GhWRKY48在這些組織中的表達(dá)情況，結(jié)果表明，其在根、莖和葉中均表達(dá)，莖中為優(yōu)勢(shì)表達(dá)(圖2-A)。

利用qPCR方法分析 SA和JA對(duì)GhWRKY48轉(zhuǎn)錄水平的影響，結(jié)果表明,SA和JA均能誘導(dǎo)GhWRKY48表達(dá)。JA處理后，在1.5 hGhWRKY48表達(dá)量達(dá)到最大，但在3.0 h表達(dá)量為最低，12.0 h表達(dá)量達(dá)到第2個(gè)高峰值，總體說呈現(xiàn)雙峰趨勢(shì)(圖2-B)。SA處理后，也是在1.5 hGhWRKY48表達(dá)量達(dá)到最大值，此后逐漸下降，除了12.0 h表達(dá)量小于對(duì)照，其他時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量均顯著高于對(duì)照(圖2-C)。結(jié)果說明,GhWRKY48基因?qū)@2種激素都存在著應(yīng)答響應(yīng)。

A．GhWRKY48編碼序列及推導(dǎo)的氨基酸序列；翻譯起始密碼子(ATG)與翻譯終止密碼子(TAG)分別用位于序列的開始和末尾；B.GhWRKY48蛋白與其他植物WRKY48蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析。A．Coding sequence and deduced amino acids of GhWRKY48; The translation start codon (ATG) and stop codon (TAG) were located at the beginning and end of the sequence, respectively; B.Phylogenetic tree analysis on GhWRKY48 protein and WRKY48 protein of other plants.

A.GhWRKY48在棉花不同組織中的表達(dá)分析；B和C. JA 和SA處理后GhWRKY48的表達(dá)分析。不同字母表示差異顯著(P<0.05)。圖3-5同。A. The expression analysis of GhWRKY48 in different tissues of cotton; B and C.The expression analysis of GhWRKY48 under the treatment of JA or SA.The different alphabets stand for significant difference(P<0.05).The same as Fig.3-5.

2.3 大麗輪枝菌入侵對(duì)棉花GhWRKY48誘導(dǎo)表達(dá)分析

為了分析GhWRKY48基因是否參與棉花的抗病性，利用qPCR方法分析GhWRKY48基因?qū)Υ篼愝喼捻憫?yīng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其表達(dá)量呈現(xiàn)出先降低后增加的趨勢(shì)，接菌誘導(dǎo)后6 h其表達(dá)量顯著下降，但在12 h后又呈現(xiàn)大幅度的上升，接菌36 h表達(dá)量與對(duì)照相似，然而在48 h時(shí)GhWRKY48表達(dá)量顯著上升(圖3)，結(jié)果表明，該GhWRKY48基因受到大麗輪枝菌的強(qiáng)烈誘導(dǎo)，暗示GhWRKY48參與棉花對(duì)病原菌的抗性。

2.4 GhWRKY48基因沉默植株的培育

為了進(jìn)一步分析GhWRKY48基因的抗病功能，先利用VIGS技術(shù)培育GhWRKY48基因沉默植株，進(jìn)而對(duì)其抗病功能進(jìn)行鑒定。首先利用PCR技術(shù)克隆GhWRKY48基因的特異片段，該片段大小為423 bp(圖4-A)，將片段插入到pYL-156 載體中構(gòu)建成病毒沉默載體pYL-156-GhWRKY48(圖4-B)。將含pYL-156-PDS、pYL-156和pYL-156-GhWRKY48的農(nóng)桿菌與含pYL-192的農(nóng)桿菌1∶1混合注射到棉花子葉中。農(nóng)桿菌侵染植株12 d后，陽性對(duì)照PDS基因被沉默的植株葉片出現(xiàn)失綠表型，表明TRV病毒在棉花植株中已經(jīng)成功地進(jìn)行系統(tǒng)感染，暗示目的基因已經(jīng)被沉默；而注射空載體(pYL-156)陰性對(duì)照植株的葉片仍為綠色(圖4-C)。此時(shí)，利用qPCR技術(shù)檢測(cè)GhWRKY48基因在沉默植株和對(duì)照植株中的表達(dá)情況，結(jié)果表明，沉默植株中該基因的表達(dá)水平下降了約90%(圖4-D)。

圖3 大麗輪枝菌對(duì)GhWRKY48的誘導(dǎo)表達(dá)分析Fig.3 The expression analysis of GhWRKY48 under V. dahliae infection

A.PCR擴(kuò)增的GhWRKY48目的片段；B. pYL-156-GhWRKY48載體的構(gòu)建示意圖；C.GhPDS沉默植株的葉片白化表型；D.沉默植株中GhWRKY48表達(dá)量分析。A.GhWRKY48 fragment by PCR amplification; B.Sketch map of pYL-156-GhWRKY48 vector; C.Blenching leaves of GhPDS-silenced plants; D.The expression analysis of GhWRKY48 in silenced plants.

2.5 GhWRKY48沉默提高棉花植株對(duì)大麗輪枝菌的抗性

選取沉默效果較好的植株進(jìn)行大麗輪枝菌接菌處理，接菌23 d后，對(duì)照植株表現(xiàn)出明顯的葉片黃化，萎蔫脫落等發(fā)病癥狀，而GhWRKY48沉默植株表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗病性，與對(duì)照植株相比葉片黃化和落葉等發(fā)病癥狀較輕(圖5-A)。GhWRKY48沉默植株的發(fā)病率和病情指數(shù)分別與對(duì)照植株大約低18百分點(diǎn)(圖5-B-左)和17(圖5-B-右)，結(jié)果表明，GhWRKY48沉默植株對(duì)大麗輪枝菌具有更強(qiáng)的抗性。說明GhWRKY48負(fù)調(diào)控棉花對(duì)大麗輪枝菌的抗病性。

A. GhWRKY48沉默植株發(fā)病情況分析；B.GhWRKY48沉默植株發(fā)病率(左)和病情指數(shù)(右)分析。A. The disease symptom analysis of GhWRKY48-silenced plants under the treatment of V. dahliae; B. The analyses of rate of diseased plants (left panel) and disease index (right panel) on GhWRKY48-silenced plants.

3 結(jié)論與討論

棉花是一種人類種植的重要經(jīng)濟(jì)作物，是人們美好生活的重要物質(zhì)保證。然而，棉花的生產(chǎn)受到各種生物和非生物逆境的脅迫，其中棉花黃萎病嚴(yán)重制約著棉花的產(chǎn)量和品質(zhì)。目前，缺少棉花黃萎病抗病種質(zhì)資源，所以常規(guī)棉花抗病育種停滯不前[18]。為了解決當(dāng)前這個(gè)棘手的問題，利用基因工程技術(shù)培育抗病新品種是一個(gè)經(jīng)濟(jì)有效的方法。本研究從陸地棉中分離了1個(gè)棉花抗病相關(guān)基因GhWRKY48，沉默該基因后植株的抗病性增強(qiáng)，暗示其為負(fù)調(diào)控抗病基因。

WRKY轉(zhuǎn)錄因子在植物防衛(wèi)反應(yīng)中起著重要作用。在水稻中，OsWRKY13和OsWRKY45的過表達(dá)提高了植株對(duì)病原菌的抗性[19-20]。在棉花中，GbWRKY1的過表達(dá)降低了植株對(duì)灰霉菌和大麗輪枝菌的抗性，結(jié)果表明，GbWRKY1對(duì)灰霉菌和大麗輪枝菌起負(fù)調(diào)控作用[21]。在擬南芥中，WRKY48的突變體通過增加PR1基因的表達(dá)增強(qiáng)了對(duì)細(xì)菌病原體的抗性；同時(shí)過表達(dá)WRKY48能夠降低PR基因的表達(dá)，從而降低了植株對(duì)細(xì)菌病原體的抗性，表明WRKY48是一個(gè)負(fù)調(diào)控因子[12]。由此可見，WRKY轉(zhuǎn)錄因子可以作為正調(diào)控因子或負(fù)調(diào)控因子參與植物的防衛(wèi)反應(yīng)。本研究中，通過VIGS反向遺傳學(xué)方法證明GhWRKY48負(fù)調(diào)控棉花對(duì)大麗輪枝菌的抗病性，是一個(gè)負(fù)調(diào)控因子，與上述的研究結(jié)果一致。

本研究表明，GhWRKY48基因的表達(dá)受到大麗輪枝菌及JA和SA的誘導(dǎo)，是植物防衛(wèi)途徑中一個(gè)重要的負(fù)調(diào)控蛋白，可能調(diào)控下游抗病基因(如抗病相關(guān)基因，PR)表達(dá)，參與棉花對(duì)大麗輪枝菌的抗性。先前研究表明，WRKY轉(zhuǎn)錄因子通過調(diào)節(jié)PR基因的表達(dá)參與植物防衛(wèi)反應(yīng)。如AtWRKY62超表達(dá)植株通過降低PR1的表達(dá)量，降低了植株對(duì)丁香假單胞菌的抗性[22]。AtWRKY33過表達(dá)株系通過降低PR1基因的表達(dá)量增強(qiáng)了植株對(duì)細(xì)菌病原體的易感性[8]。GhWRKY40過表達(dá)植株對(duì)細(xì)菌病原體敏感性的增強(qiáng)與PRa、PR2和PR4的表達(dá)量有關(guān)[23]。因此，GhWRKY48可能和上述的WRKY蛋白一樣通過調(diào)節(jié)抗病相關(guān)基因表達(dá)，參與棉花對(duì)大麗輪枝菌的抗性。