青蘿卜晚抽薹性狀回交轉育及FLC2第1內含子PCR擴增檢測

劉春香，隋 銘，劉春霞，向春玲，曹紅祥，常天利，尹晨霖

(濰坊學院 生物與農業(yè)工程學院，“十三五”山東省高等學校生物化學與分子生物學重點實驗室，山東 濰坊 261061)

濰坊青蘿卜又稱為濰縣青，品質優(yōu)，秋茬栽培的濰縣青作為地理標志名牌產品，深受歡迎。濰縣青蘿卜易于抽薹，早春栽培風險大，在周年供應方面成了限制因素。在晚抽薹育種方面，徐文玲等[1]育成的北選濰青2號是具備濰縣青特點的適合山東各地進行秋冬、冬春設施保護地栽培的改良品種，抽薹率比對照降低23%，但仍有22.7%的抽薹率。目前，選育的早春蘿卜主要是白蘿卜[2]。針對地方品種改良，經典的育種方法就是回交，適合單基因或主效基因控制的性狀[3-4]，或存在標記的數(shù)量性狀[5]，雖然周期長，最終是可以實現(xiàn)育種目標的。

蘿卜抽薹相關基因的調控是復雜的[6]，有報道認為蘿卜抽薹性狀受主基因控制[7]，并且第1對主基因對抽臺時期的控制較高。為了尋找對耐抽薹有影響的基因，張素君[8]在極耐抽薹材料中克隆獲得一個成花座位C基因(Flowering locus C，F(xiàn)LC)的cDNA全長，與早抽薹FLC序列間存在15個堿基的差異。黃丹瓊[9]對多個不同抽薹特性蘿卜品系RsFLC基因序列的分析發(fā)現(xiàn)FLC基因的內含子區(qū)存在變異，其中在內含子1和內含子2中存在與植株材料抽薹特性顯著相關的插入-缺失型差異區(qū)域，與晚抽薹性狀密切相關，但沒有報道序列及序列長度。白菜中鑒定了4個FLC基因[10-11]，在蘿卜中有2個FLC[12]。越來越多的研究證實FLC2成為抽薹開花時期的關鍵基因[12-13]。FLC蛋白不僅會對擬南芥的開花產生抑制作用，而且在其他開花植物成花的過程中也起到關鍵的調控作用[14]。如白菜[15]、花椰菜、油菜[16]中FLC功能也已得到驗證[17]。FLC是成花轉變的樞紐基因[18]，大量的報道認為FLC2是影響抽薹期早晚的首選QTL位點[19-20]。通過FLC過量表達，可使植物晚開花[20]，延長營養(yǎng)生長期。重要的與開花相關的基因FT[21]、FD、SOC、LFY、FLD、VRN等都與FLC存在一定的關系[22]。未春化的植株FT等產物甚至可以通過嫁接春化過的砧木實現(xiàn)開花[23]。

蘿卜自然群體中存在基因多態(tài)性，點突變、插入缺失等可以引發(fā)抽薹期改變，F(xiàn)LC2編碼框的插入引發(fā)的翻譯提前終止可以引發(fā)早花[10, 24]。白菜內含子區(qū)的長插入序列可以引發(fā)晚抽薹[25]。低溫途徑通過抑制FLC2的表達實現(xiàn)成花轉變，該過程中SVP蛋白與FLC互作[26-27]，抑制成花相關基因FT的表達，植物通過了春化才能解除抑制，促進FT表達[28]，向成花轉變。

栽培上的低溫蘿卜很難克服，因此，低溫途徑促進開花需要從基因水平控制。長日照(赤霉素途徑)促進開花，早春栽培正是日照逐漸變長的過程，也很難從栽培上克服。本研究以早春白蘿卜為晚抽薹基因源，從2013年起，將晚抽薹性狀按照質量性狀轉育的方式轉到濰縣青蘿卜上，并研究了FLC2基因第1內含子區(qū)，探索FLC2第1內含子區(qū)是否存在多態(tài)性，以及多態(tài)性與抽薹期的關系。試驗過程意外發(fā)現(xiàn)春化時間對FLC2擴增的影響，本研究在回交轉育蘿卜的過程中，以探索FLC2基因內含子區(qū)PCR檢測的條件及應用為目標，為蘿卜晚抽薹育種提供參考。

1 材料和方法

1.1 回交供體、輪回親本及常規(guī)選育過程

本研究以改良地方品種濰縣青蘿卜的春季抽薹特性為目標，以晚抽薹的西星白玉春蘿卜(由登海種業(yè)鄧永林先生提供)為晚抽薹基因源，于2013年以濰縣蘿卜為父本，進行雜交；2014年進行F1自交，2015年F2花期進行晚抽薹性及皮色、根型的選擇，入選植株以濰縣青蘿卜為輪回父本進行回交，連續(xù)回交3代，至2018年回交3代的蘿卜花期進行自交或姊妹交，選擇晚抽薹性好，其他性狀符合濰縣青蘿卜特點的植株種子為材料，于2018年6月采收種子。

1.2 F2晚抽薹株群FLC2基因的PCR擴增分析

在NCBI上檢索蘿卜FLC2基因序列(在GenBank上的編號： GI: 756809027)，用Primer Premier 5.0分別進行引物設計，命名時基本按照在基因上的位置命名(圖1)。引物對1的序列和名稱如下，上游序列S379：5′-TTCTCCAAACGACGCAGT-3′，下游序列為a1599：5′-GGCTTTAAGATCATCAGCATG-3′；引物對2的上游序列S484：5′-TCTCCAAACG ACGCAGTGGTCTCAT-3′，下游引物a1704：5′-TCAT CAGCATGTTGTTTTCCATATCG-3′。以上述2對引物進行基因組FLC2基因區(qū)間見圖1，擴增的群體主要是晚抽薹入選植株和輪回親本植株。擴增條件：PCR擴增反應采用25 μL體系，其中蘿卜DNA模板濃度平均為30 ng/μL，加1 μL，2×Taq酶混合液(ExTaq酶)12.5 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，混合于1管，加蒸餾水補至25 μL。PCR擴增程序為預變性94 ℃ 10 min；94 ℃ 30 s，退火引物對1是52.8 ℃ 30 s，引物對2是60.5 ℃，延伸72 ℃ 2 min，35個循環(huán)；后延伸72 ℃ 10 min。對擴增產物進行電泳，檢測結果。

圖1 FLC2基因上的引物位置Fig.1 Primer sites on FLC2 gene

1.3 多態(tài)性片段的克隆和測序

對F2中高頻出現(xiàn)的擴增產物長片段和輪回親本的擴增產物短片段進行TA克隆，克隆菌落進行雙向測序和序列拼接(委托上海生工生物技術公司)，對測序結果在NCBI數(shù)據(jù)庫進行Blast比對，分析多態(tài)性的序列特征。并利用DNAStar的序列比對軟件進行兩序列比較。

1.4 將FLC2第1內含子的多態(tài)性作為參考檢測其與抽薹性的關系

按照CTAB法對F2分植株進行基因組DNA提取，PCR擴增采用1.2中的引物對2進行。調查植株抽薹期，以花臺高約2 cm作為抽薹的標準，分析PCR擴增多態(tài)性與抽薹的關系。

1.5 回交群體和部分晚抽薹自交群體經春化處理后FLC2第1內含子的檢測

通過對回交種子和少部分晚抽薹自交種子進行催芽，對幼苗進行12，36 d的4 ℃低溫春化處理，處理后于3月中旬定植到濰坊學院溫室，分別進行抽薹期的調查和FLC2第1內含子多態(tài)性分析，5月初結束抽薹統(tǒng)計。取處理后和抽薹期的植株葉片，采用CTAB法分別進行基因組DNA提取，PCR擴增，擴增方法同上。定植后開始統(tǒng)計各植株的抽薹期。

1.6 春化處理后對FLC2內含子區(qū)擴增的檢測

重新對FLC2第1內含子區(qū)插入序列兩端設計引物，其中引物對3與引物對4上游序列是一致的，為S604，序列: 5′-ACCAGAATGAGGAAGAACA-3′，引物對3下游序列a3為: 5′-AACATCAAGTCTGCG TCA-3′；引物對4的下游序列a4為5′-ATCAATG GCTGCACAAT-3′。用來對試驗材料進行PCR擴增檢測，擴增區(qū)間如圖1所示。同時，對DNA質量進行抽檢，抽檢引物從蘿卜基因組中隨機選擇了一段序列，P1: 5′-TGTGATTTATACAGCTTCCATAT-3′，P2: 5′-AGAACTTGCCTTCCTTGA-3′，擴增產物700 bp左右。

于2018年進行試驗，對照1為西星白玉春，基因型為內含子有插入突變和無插入突變的雜合型，對照2為輪回親本濰縣青，F(xiàn)LC2基因第1內含子為野生型；其他為回交1代后代。蘿卜的處理方式：植株長至兩葉一心時定為春化0 d，此后放在保鮮柜中4 ℃處理12，24 d，處理結束的當天每個單株取少量葉片提取DNA；處理后繼續(xù)低溫至通過春化，之后定植到田間，抽薹開花期取臺?；蚬v皮提取DNA，單株編號，分別提取；提取方法仍為CTAB法，試驗所選樣品為后期晚抽薹的雜合型植株，淘汰早抽薹植株DNA。PCR反應體系同上，引物對3擴增條件為預變性94 ℃ 10 min；94 ℃ 30 s，退火52 ℃，延伸72 ℃ 2 min，35個循環(huán)；后延伸72 ℃ 10 min。DNA質量檢測擴增條件同引物對4，引物對4的擴增條件僅退火溫度降為50 ℃，其他不變。

2 結果與分析

2.1 回交轉育過程的抽薹期分析

盡管蘿卜抽薹期表現(xiàn)為數(shù)量性狀，為了將晚抽薹相關基因轉化到濰縣青蘿卜中，本研究最初采用回交-自交結合的模式進行晚抽薹性狀的轉育，本研究發(fā)現(xiàn)，輪回親本濰縣青蘿卜50%植株抽薹時間為3月5日；供體親本西星白玉春抽薹50%植株抽薹時間為4月6日。2015年F2出現(xiàn)了明顯的性狀分離現(xiàn)象，商品性一般，入選植株晚抽薹性較好，平均抽薹時間為4月14-19日，從圖2可見入選的4株蘿卜在5月2日有2株還沒有開花。說明F2部分晚抽薹植株性狀可優(yōu)于親本西星白玉春，顯著好于輪回親本濰縣青。

按照數(shù)量性狀的轉育方法，如沒有輔助選擇手段，每一代需要富集影響抽薹的各種基因，采用回交后自交或高世代選擇，這樣會延長育種進程。本研究根據(jù)植物開花已有的報道，選擇成花樞紐基因FLC2作為關注的主效基因，對F2及回交世代進行基因型檢測，探索其基因型對抽薹的影響，對以后的回交世代選擇起了一定作用，每次回交后不用再自交。

圖2 F2部分入選晚抽薹植株及對照在5月2日的抽薹開花Fig.2 Part of flowering of selected plants from F2 generation and control plant on May 2nd

2.2 蘿卜FLC2基因外顯子1和外顯子2間基因組擴增結果

通過對蘿卜FLC2基因的部分序列進行擴增，發(fā)現(xiàn)該基因有一定的擴增難度，引物對1不能擴增出理想的結果(S379、a1599)，而引物對2(S484、a1704)能夠有效擴增出產物，且產物的大小不一致，從圖3可以看出，對照濰縣青蘿卜擴增帶1 220 bp，而晚抽薹植株都是擴增出2 848 bp的產物。由此可知，在不同蘿卜基因組DNA上FLC2基因存在序列長短的差異，即多態(tài)性。這種差異需要通過克隆測序才能明確產生的原因。而且需要驗證這種差異是否與抽薹性密切相關。

2.3 蘿卜FLC2擴增多態(tài)性片段的克隆和序列比對分析

通過將目的擴增產物克隆到pMD18-T載體，轉化大腸桿菌，獲得了陽性轉化子，對2個不同的插入片段分別選擇2個陽性轉化子進行測序，測序結果顯示，同一大小的片段間序列是一致的，從圖4可以看出，小片段的FLC2基因內含子與大片段內含子的上游和下游都是一致的，只是在中間從320-1 949位置有一個1 628 bp的插入序列。

將這個插入序列在https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi上進行比對分析，發(fā)現(xiàn)基本沒有完全一致的已知序列，在甘藍基因組序列中，存在同源性較高(83%)的約900 bp的同源性片段，該片段功能尚未鑒定。其次是歐洲油菜中有約712 bp同源性85%的mRNA序列，而從920-1 500 bp間沒有任何相似的序列。由此可知，這個長內含子是由插入突變引起的，插入位置在第1內含子的中部，并不影響FLC2基因的編碼序列，可導致內含子序列和長度發(fā)生變化，片段應與十字花科植物序列有親緣關系。

圖3 兩對引物FLC外顯子1到外顯子2間基因組擴增結果Fig.3 Genomic amplification results of two pairs of primers on FLC from exon 1 to exon 2

圖中粗線為省略部分，該部分2個序列間是一致的；三角號表示內含子插入序列的起點和終點。The bold dotted lines in the figure are omitted sequences, and the two sequences are consistent； The triangle indicates the beginning and end of insertion sequences on the first intron.

2.4 插入突變基因型與晚抽薹的關系

通過對2015年所有晚抽薹植株的PCR擴增分析得出(表1)：有85.71%的晚抽薹植株含有純合的FLC2插入突變序列(2 848 bp擴增帶)，有92.86%較晚抽薹植株含有雜合或純合的插入突變序列(2 848，1 220 bp共存或純合2 848 bp)。說明晚抽薹株普遍表現(xiàn)出含有插入突變序列的帶型。2015年由于在花期僅存少量入選的晚抽薹植株和濰縣青花粉供體株，樣本量較少，為了進一步確定其作為晚抽薹篩選標記的可靠性，2016年進一步進行晚抽薹性PCR檢測，擴增結果見表2，從表2可以看出，經過花期檢測的基因型為純合插入突變的植株全部是晚抽薹(85.7%)和較晚抽薹(14.3%)的，另有部分植株最終沒有抽薹，PCR檢測結果不清晰，沒有參與統(tǒng)計；純合野生型(濰縣青，擴增產物1 220 bp)沒有晚抽薹植株，全部是早抽薹(81.1%)和較晚抽薹(19.0%)?；蛐蜑殡s合型的主要是較晚抽薹的(78.3%)。說明FLC2的基因型與抽薹早晚關系很密切。值得一提的是這些結果必須基于花期的檢測，苗期和春化未完成時期的檢測有時帶型是不全的。要以這一特征作為抽薹早晚的選擇標記需進一步探索其適用的條件。

表1 2015年插入突變帶型與抽薹統(tǒng)計Tab.1 Statistics of insertion mutation zone type and bolting plants on 2015

表2 2016年蘿卜PCR檢測到的插入突變帶型與抽薹期比例的關系Tab.2 The relationship between insertion mutation by PCR detection and bolting stage ratio on 2016 %

2.5 春化處理對擴增的影響

利用引物對2進行PCR擴增，期望通過不同春化時間處理獲得不同育種材料抽薹期的特征，并檢測抽薹早晚與擴增結果間的關系，進一步明確晚抽薹與FLC2插入突變的關系。從表3可以看出，春化處理36 d對擴增有明顯影響，1 220 bp帶(野生型，WT)多數(shù)植株能夠擴增出來，有部分植株不能得到擴增產物；而春化處理12 d的植株則完全不能擴增出1 220 bp的WT帶型，僅在部分植株中能夠擴增出2 848 bp的帶。說明苗期春化處理對引物對2擴增FLC2基因結果是有明顯影響的，短期春化主要影響野生型FLC2內含子的擴增，長時間春化主要影響插入突變型FLC2的擴增?；ㄆ跀U增則多數(shù)植株都可以得到正常結果，與實際基因型相符，且抽薹期極晚接近5月抽薹的植株100%都是純合插入突變基因型。

表3 蘿卜在2種春化天數(shù)下各基因型的PCR檢測帶型及抽薹早晚Tab.3 The counts and ratio of bolting time and PCR amplification products of radish under two different vernalization days

注： 早春定植后植株依賴自然低溫大部分最后開花，部分植株最終也沒有開花，無法檢測基因型，不參與統(tǒng)計。

Note: Most of the plants depend on natural low temperature to blossom finally after planting in early spring，some plants do not bolting at last so they can not be detected genotypes and can not be counted.

2.6 春化處理對內含子區(qū)擴增的影響

春化處理會影響FLC2基因的擴增結果，且引物對2擴增難度大，為了降低擴增難度，對已經測序的內含子區(qū)重新設計引物，經過篩選引物對3的擴增效果較好。為了驗證春化對PCR擴增FLC2的影響，需要對DNA質量進行檢測，并對2種基因型未經春化處理植株的引物擴增效率進行檢測，從圖5可知，春化24 d的基因組DNA對擴增蘿卜育性相關基因RSRF是沒有影響的, 都有產物。未經春化處理的蘿卜DNA擴增引物對3可以擴增出CK1(雜合)的2條帶和CK2(純合野生型)的1條帶，由此可以確定引物、酶和DNA都是正?？捎玫?。

圖5 檢驗蘿卜春化24 d DNA質量的RSRF基因擴增結果Fig.5 RSRF gene amplification results of radish after vernalization 24 d for DNA quality detection

通過引物對3對FLC2第1內含子基因型為雜合型的不同春化時期蘿卜單株DNA進行PCR擴增，結果見圖6，從圖6可以看出，春化0 d和抽薹開花期，蘿卜植株基本能夠檢測到雜合型特征，即產物為雙帶，而春化24 d主要影響插入突變內含子序列的擴增，87%的植株無理想擴增結果，有些WT帶的擴增效果也受影響；同樣基因型，在苗期，尤其是抽薹或開花期該有的帶型基本能擴增出來。春化12 d則野生型帶(小帶)擴增效果不好，插入突變型(大帶)也受到一定的影響。經過引物對4擴增以上材料也表現(xiàn)了相似的特征(圖7)，即春化24 d幾乎全部插入突變帶型擴增均受影響，有時會額外出1條小帶；春化12 d有的出2條帶，有的出1條，有的1條也擴增不出來。由此可以看出，引物更換雖然可以改變擴增效率，但不能完全克服春化的影響。

M.DL2000分子質量標準；CK1.未處理的西星白玉春；CK2.未處理的濰縣青；1-15.FLC2的雜合基因型植株。

M.Molecular Marker DL2000;CK1.Uncontrolled Baiyuchun;CK2.Uncontrolled Weixianqing;1-15.Plants with heterozygous genotype onFLC2.

圖6 不同春化時期蘿卜FLC2第1內含子用引物對3的擴增結果
Fig.6 Results of the first intron amplification of radishFLC2by primer pair 3 in different vernalization periods

M.DL2000分子質量標準；1-10.FLC2的雜合基因型植株。M. Molecular Marker DL2000; 1-10. Plants with heterozygous genotype on FLC2.

2.7 FLC2第1內含子多態(tài)性的適宜檢測時期及選種應用

獲得FLC2第1內含子多態(tài)性信息，且該多態(tài)性顯著影響回交材料的抽薹時期，雜合型較晚抽薹，純合突變型晚抽薹，育種上可以結合示意圖(圖8)來進行轉育和篩選。

由于擴增結果的最佳檢測時期是臺花期，苗期淘汰結果有時不夠可靠，不適合苗期篩選。在回交育種中，回交轉育后需要一步自交，有利于基因純合，在選擇自交后代是否基因型為純合時，可以通過擴增檢測純合插入突變基因型，從而確保該等位基因(FLC2內含子區(qū)基因型為純合插入突變)后代不發(fā)生分離，確保晚抽薹穩(wěn)定性。

通過臺花期檢測，可以明確晚抽薹是由FLC2基因第1內含子插入突變引起，還是其他影響抽薹的作用因素引起，從而指導育種上的選擇，實現(xiàn)非等位基因的累加。經過選擇的回交3代植株普遍性狀符合濰縣青蘿卜特征，且早春抽薹期平均比對照晚30 d左右。

3 結論與討論

FLC2基因是成花轉變的樞紐基因[18]，植物通過抑制FLC2基因的表達實現(xiàn)成花轉變[12]，蘿卜與擬南芥在春化途徑上具有相似性[29]。有研究認為，F(xiàn)LC2表達的抑制作用主要在FLC2的啟動子到第1內含子區(qū)[17, 30-31]，因此，本研究也選用該區(qū)域作為檢測對象，并發(fā)現(xiàn)了在FLC2第1內含子區(qū)存在一個長插入突變，長度約1 600 bp，沒有影響內含子的邊界，因此，該插入突變并不影響FLC基因的編碼序列，這種長插入在其他十字花科植物中也有[32]，油菜FLC2上游一個621 bp的插入引發(fā)冬性增強[33]，白菜中有報道發(fā)現(xiàn)了一個5 kb的插入突變，最終導致延遲抽薹開花[25]，與本研究的結果類似，說明在FLC2內含子區(qū)的長插入序列的確有延遲抽薹開花的作用。

斜體表示必需進行檢測，非斜體表示可以檢測?！帘硎咎蕴硎咀越?。 Italics font indicates that it must be detected, and non-italics font indicates that it can be detected. ×denotes elimination, and denotes self-bred.

FLC2基因內含子區(qū)的長度差異是本研究育種材料的主要差異，因此，圍繞長短內含子的檢測可以預知材料是否含有導致晚抽薹的序列存在。黃丹瓊[9]也報道了FLC2基因擴增長度的差異，并認為與抽薹早晚關系密切，可以將FLC2作為分子標記[18]，與本研究基本一致；本研究雖與其采用的育種資源不同，但效果是相似的，重要的是在利用FLC2基因內含子長度作為標記進行篩選時遇到了困難。通過進一步的春化處理研究，發(fā)現(xiàn)僅通過改進引物是很難實現(xiàn)理想擴增的，本研究為了對該內含子區(qū)進行擴增，設計了多對引物，通過引物對3在苗期和開花期基本可以實現(xiàn)正常擴增。然而，春化階段則受到明顯影響，說明春化階段模板DNA的狀態(tài)較為復雜。有研究認為，F(xiàn)LC2基因的抑制是通過對啟動子到第1內含子區(qū)進行大量的修飾，包括組蛋白甲基化[34-36]、非編碼RNA結合[37]、DNA甲基化[38]、組蛋白去乙?；痆28,39]、蛋白復合體結合等多種作用，期間涉及了FT[21-22,40]、FLD[14,40]、VIN等多種蛋白及蛋白復合體的作用[41]。這些修飾蛋白或結合蛋白可能通過苯酚-氯仿抽提并不能去除干凈，也可能其間有作用力較強的鍵難以通過有機溶劑變性分開。2017年Kim等[42]報道發(fā)現(xiàn)FLC基因所在染色體在春化階段會因長鏈非編碼RNA作用而成環(huán)，成環(huán)會影響DNA作為模板的功能。具體是什么機理導致PCR擴增困難有待進一步研究。

本研究發(fā)現(xiàn)，同樣一株蘿卜的DNA，在不同階段FLC2第1內含子擴增難度不同，對引物對2，春化12 d野生型的擴增困難，而春化36 d插入突變擴增難度較大，推測短期春化，DNA上的修飾作用主要發(fā)生在野生型FLC2第1內含子上，而較長時間的春化可能引發(fā)了插入突變型內含子區(qū)的大量修飾。然而，前人并未報道模板修飾會對DNA擴增產生影響，因此，本研究采用了不同年度不同批次的多次試驗，每次都能發(fā)現(xiàn)春化對擴增的不良影響。最容易擴增的時間段為抽薹開花期，2種內含子都能較好地實現(xiàn)擴增，可能與抽薹開花期FLC2的正常表達(修飾作用被解除)有關[15,43]。苗期擴增需要引物合適，引物不適合苗期擴增結果也不夠可靠。如果復雜的修飾影響PCR擴增效率，通過擴增效率反過來估計模板DNA的修飾狀態(tài)可能也是值得探索的問題。

晚抽薹的影響因素較多[7,20]，本研究所采用的親本基因源較為單一，采用回交轉育轉有插入突變的FLC2基因型，抽薹這一數(shù)量性狀的轉育因而可以按照質量性狀的轉育方法進行[4]，到回交的最后一代，需要對有FLC2內含子插入突變的基因型進行純合，這時，標記檢測可以明確預知后代的基因型，從而避免后代發(fā)生性狀分離。如果進一步加強晚抽薹性育種，可以通過檢測插入突變等位基因是否純合判斷其對晚抽薹的貢獻，從而衡量其他基因的貢獻力，實現(xiàn)對晚抽薹有貢獻的其他基因的累積。