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    菘藍(lán)IiCYP79B2基因的克隆與表達(dá)分析

    2019-11-05 10:03:44胡向陽屈新運(yùn)吳格格秦苗苗高天娥
    華北農(nóng)學(xué)報 2019年5期
    關(guān)鍵詞:芥子油擬南芥克隆

    胡向陽,屈新運(yùn),吳格格,秦苗苗,劉 蕊,高天娥,李 燾

    (西北瀕危藥材資源開發(fā)國家工程實(shí)驗室,藥用資源與天然藥物化學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗室,陜西師范大學(xué),陜西 西安 710119)

    菘藍(lán)(IsatisindigoticaFort.)是十字花科兩年生草本植物,其干燥的根和葉為歷版《中國藥典》所收錄,分別為“板藍(lán)根”和“大青葉”,其化學(xué)成分主要包括靛玉紅、靛藍(lán)、表告依春、芥子油苷、腺苷、色胺酮、棕櫚酸等[1-2],具有抗病毒、抗菌、抗癌和抗內(nèi)毒素等作用[3-5]。

    芥子油苷(Glucosinolate,GS),又稱硫代葡萄糖苷,主要存在于白菜(Brassicapekinensis)、花椰菜(Brassicaoleracea)、菘藍(lán)(Isatisindigotica)等十字花科植物中,參與植物的防衛(wèi)反應(yīng),具有抗癌作用,是一類重要的含氮、硫的植物次生代謝產(chǎn)物[6-8]。芥子油苷(以氨基酸為前體物)根據(jù)氨基酸種類的不同可以分為脂肪族(源于甲硫氨酸等)、吲哚族(源于色氨酸)和芳香族芥子油苷(源于苯丙氨酸等),目前已有200余種不同結(jié)構(gòu)的芥子油苷被確認(rèn)[9-10]。CYP79酶類在芥子油苷合成通路上發(fā)揮重要作用,且具有較強(qiáng)的專一性,CYP79B1、CYP79B2和CYP79B3能夠催化色氨酸進(jìn)入吲哚族芥子油苷合成途徑[11-13];CYP79F1和CYP79F2能夠催化甲硫氨酸(Methionine)、丙氨酸(Alanine)、纈氨酸(Valine)、亮氨酸(Leucine)和異亮氨酸(Isoleucine)并進(jìn)入脂肪族芥子油苷合成途徑[14];CYP79A2則能夠催化丙氨酸或酪氨酸進(jìn)入芳香族芥子油苷合成途徑[15]。Banerjee等[16]用2 kGy γ射線處理白菜后發(fā)現(xiàn)MYB28和CYP79F1的表達(dá)量分別為對照組的3,2倍,脂肪族芥子油苷含量也表現(xiàn)出不同程度的升高;而影響芥子油苷積累的JA信號分子的含量卻沒有顯著變化。Chen等[12]通過敲除擬南芥CYP79F1和CYP79F2獲得相應(yīng)突變體,發(fā)現(xiàn)在CYP79F1缺失突變體中,短鏈脂肪族芥子油苷含量幾乎為零,長鏈脂肪族芥子油苷含量增加;而在CYP79F2缺失突變體中,長鏈脂肪族芥子油苷含量顯著降低,長鏈脂肪族芥子油苷含量水平不受影響。

    CYP79酶類在十字花科植物芥子油苷合成過程中具有重要作用,但其在菘藍(lán)芥子油苷的合成過程中是否發(fā)揮相應(yīng)功能目前還未有報道。本研究首次克隆了菘藍(lán)IiCYP79B2基因,綜合運(yùn)用多種生物學(xué)軟件對其序列特征進(jìn)行分析,并對其表達(dá)模式進(jìn)行了初步的探究,這些結(jié)果也為下一步其功能研究(特別是在芥子油苷生物合成過程的功能)奠定了基礎(chǔ)。

    1 材料和方法

    1.1 試驗材料

    菘藍(lán)種子為西北瀕危藥材資源開發(fā)國家工程實(shí)驗室留存,種植于溫室中。培養(yǎng)條件:溫度(25±2)℃;光照(16 h/d);濕度(60%~80%)。

    1.2 試驗方法

    1.2.1 菘藍(lán)RNA和DNA的提取 取菘藍(lán)嫩葉,置于液氮中速凍。按照植物RNA提取試劑盒說明提取總RNA,用反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA第一鏈;按照植物DNA提取試劑盒說明提取genomic DNA(gDNA)。將菘藍(lán)cDNA和gDNA置-20 ℃保存。

    1.2.2 引物設(shè)計 根據(jù)本實(shí)驗室的菘藍(lán)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫信息,采用ORF finder在線軟件查找菘藍(lán)CYP79B2序列的ORF,并用Primer 5.0軟件設(shè)計特異性酶切引物序列:F:5′-ATGAATACTTTTACCT CAAAC-3′,R:5′-TCACTTCACCGTCGGGTAAA-3′,引物合成和序列測定由公司完成。

    1.2.3 基因克隆 分別以cDNA和gDNA為模板,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,反應(yīng)程序為:95 ℃預(yù)變性3 min;95 ℃變性30 s, 60 ℃退火30 s,72 ℃延伸2 min,第2~4步33次循環(huán); 72 ℃終延伸10 min;4 ℃保存?;厥占兓瘮U(kuò)增產(chǎn)物片段,用平末端克隆試劑盒說明書方法對已經(jīng)純化的目的片段進(jìn)行連接,而后用E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化,將陽性克隆送至公司測序。

    1.2.4 蛋白質(zhì)序列分析 利用ExPASy預(yù)測蛋白的理化性質(zhì)、跨膜結(jié)構(gòu)域和功能結(jié)構(gòu)域等序列基本特征信息;運(yùn)用SOPMA和Swiss Model預(yù)測蛋白的二、三級結(jié)構(gòu)特征信息;用Psort預(yù)測蛋白可能作用位置;NCBI搜索親緣關(guān)系較近物種的蛋白序列并比對,MEGA 5.1構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

    1.2.5 基因表達(dá)模式分析 分別選取種子萌發(fā)后10 d(萌芽期)、30 d(幼苗期)和90 d(營養(yǎng)生長期)齡以及花期植株進(jìn)行取樣,考察目的基因在菘藍(lán)中不同發(fā)育時期的表達(dá)情況;選取花期植株的根、莖、葉、花和果進(jìn)行取樣,檢測目的基因在不同組織器官中的表達(dá)情況;為檢測不同脅迫條件對目的基因表達(dá)的影響,選取培養(yǎng)至60 d的植株分組分別噴施茉莉酸甲酯(MJ,500 μmol/L)、水楊酸(SA,300 μmol/L)和葡萄糖(Glu,9.0%m/V)溶液于整個葉面,并于0,1,3,6,12,24,48,72 h進(jìn)行取材;低溫樣本為4 ℃處理相同時間后同法取材。各條件取材樣本均于液氮速凍后置-80 ℃,備用。

    按照1.2.1項的方法分別獲得上述材料的cDNA,并設(shè)計目的基因的qRT-PCR引物:F:5′-TGGGCCG TAACCCGAAAGTTTGG-3′,R:5′-ATCGTGGTCAAC GCCGTACCTAGGG-3′。以IiActin(AY870652.1)為內(nèi)參基因,其引序列物為:F3:5′-AGGAATCGCTGA CCGTATG-3′,R3:5′-TGGACCCGACTCATCGTATT-3′。qRT-PCR法分析目的基因的表達(dá)模式。擴(kuò)增條件為: 95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃ 變性10 s,58 ℃退火10 s,72 ℃ 延伸10 s,45次循環(huán);72 ℃終延伸10 min,4 ℃保存,每次循環(huán)第3步進(jìn)行熒光信號采集,采用2-ΔΔCT法對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 IiCYP79B2基因的克隆

    以菘藍(lán)的cDNA和gDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,經(jīng)電泳檢測在1 500~2 000 bp分別獲得1個片段(圖1)。測序結(jié)果顯示:基因組序列全長1 827 bp,只有1個內(nèi)含子(剪切位點(diǎn)為GT-AG,圖2)。去除后ORF全長1 629 bp,編碼542個氨基酸,將其命名為IiCYP79B2,GenBank登錄號為KY774688(圖3)。

    2.2 IiCYP79B2蛋白的分析

    2.2.1 IiCYP79B2蛋白的理化性質(zhì)分析 結(jié)果表明,IiCYP79B2蛋白的理論分子質(zhì)量61.41 ku,分子結(jié)構(gòu)式為C2748H4371N739O781S36,理論等電點(diǎn)(pI)8.80,偏堿性;不穩(wěn)定系數(shù)33.29,相對穩(wěn)定;總平均親水性(GRAVY)-0.188,親水性蛋白;存在2個跨膜結(jié)構(gòu),在氨基酸序列第20-42位和55-74位;預(yù)測亞細(xì)胞定位于葉綠體類囊體膜上(可信度:0.821),無信號肽結(jié)構(gòu);N-端氨基酸為蛋氨酸(Met);IiCYP79B2含有46個蛋白激酶磷酸化位點(diǎn),包括22個Ser位點(diǎn)、22個Thr位點(diǎn)和2個Tyr位點(diǎn),可能受蛋白磷酸激酶的調(diào)控。

    M.DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(DL2000);1.cDNA;2.gDNA。M.DL2000 Marker; 1.cDNA; 2.gDNA.

    圖2 IiCYP79B2的內(nèi)含子Fig.2 The intron of IiCYP79B2

    圖3 IiCYP79B2核酸及推導(dǎo)氨基酸序列Fig.3 Nucleotide and deduced amino acid sequences of IiCYP79B2

    2.2.2 IiCYP79B2蛋白的結(jié)構(gòu)預(yù)測 結(jié)果表明,IiCYP79B2蛋白在471-480位氨基酸之間有一高度保守的血紅素結(jié)合域:FStGKRGCAA(圖4),具有CYP450基因家族酶系的典型特征。IiCYP79B2蛋白的二級結(jié)構(gòu)α-螺旋(Alphha helix)、無規(guī)則卷曲螺旋(Coiled coils)、延伸鏈(Extended strand)和β-轉(zhuǎn)角(β-turn)分別占比44.28%,31.18%,17.34%和7.20%,以前兩者為主。IiCYP79B2蛋白的三維結(jié)構(gòu)模型與二級結(jié)構(gòu)分析結(jié)果吻合(圖5)。

    圖4 IiCYP79B2的蛋白結(jié)構(gòu)域Fig.4 Functional domain of IiCYP79B2

    圖5 IiCYP79B2的三級結(jié)構(gòu)Fig.5 Three-dimensional structure model of IiCYP79B2

    IiCYP79B2蛋白的同源性及系統(tǒng)進(jìn)化分析 各植物CYP79B2同源序列比對結(jié)果表明:菘藍(lán)IiCYP79B2與其他物種的CYP79B2序列相似,高度同源,都具有Heme-binding motif、PERF motif和K-helix 3種CYP450家族典型結(jié)構(gòu)域或基序,如圖6所示。菘藍(lán)IiCYP79B2的氨基酸序列與芝麻菜(Erucasativa, AGM16417.1)、深山南芥(Arabidopsislyrata, EFH43155.1)和擬南芥(Arabidopsisthaliana, OAO99245.1)CYP79B2序列的相似性分別為96%,95%和95%;系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果表明,菘藍(lán)IiCYP79B2與白芥(Sinapisalba, O81345.1)的親緣關(guān)系最近(圖7)。

    黑色方框.CYP450保守的基序、區(qū)域和結(jié)構(gòu)域;黃色.相同的氨基酸;粉色和藍(lán)色.同源的氨基酸殘基。Black box.CYP450s conserved motifs, regions and domains; The identical amino acid was highlighted in yellow box; The indicate homologous amino acid residues were highlighted in pink and blue box.

    圖7 IiCYP79B2系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.7 Phylogenetic tree of IiCYP79B2

    2.3 IiCYP79B2基因的表達(dá)模式分析

    2.3.1IiCYP79B2在不同發(fā)育時期和組織部位的表達(dá)特性IiCYP79B2基因在菘藍(lán)不同發(fā)育時期均有表達(dá)(圖8-A),各發(fā)育時期表達(dá)量依次為生長期>花期>幼苗期>萌芽期,其中生長期表達(dá)量最高,為萌芽期的14.78倍;此外,該基因在菘藍(lán)的根、莖、葉、花和果中均有表達(dá)(圖8-B),在葉和莖中的表達(dá)量相對較高,其在葉中的表達(dá)量達(dá)到根中的25.21倍,推測該基因可能主要在菘藍(lán)的葉和莖中發(fā)揮表達(dá)調(diào)控作用。

    2.3.2IiCYP79B2在不同誘導(dǎo)子處理條件下的表達(dá)特性 分別考察IiCYP79B2基因在MJ、Glu、SA和低溫脅迫處理條件下的表達(dá)情況,結(jié)果如圖8-C所示,IiCYP79B2的表達(dá)顯著響應(yīng)MJ和 Glu信號的誘導(dǎo),分別在處理6,48 h后達(dá)到峰值,為對照的14.48,7.52倍。同時,IiCYP79B2的表達(dá)受到SA和低溫的明顯抑制,分別在低溫處理1,48 h后下降至對照水平的4.80%和8.32%。此外,IiCYP79B2基因?qū)A和MJ信號的響應(yīng)更為迅速和明顯。持續(xù)的低溫可能會對植株造成一定程度的損害,低溫脅迫處理后,IiCYP79B2基因的表達(dá)水平始終低于對照的表達(dá)水平;而MJ、Glu和SA處理72 h后,IiCYP79B2基因的表達(dá)量則基本都能夠恢復(fù)至與對照水平相當(dāng)。

    3 結(jié)論與討論

    芥子油苷參與十字花科植物與環(huán)境相互作用的過程,輔助植物適應(yīng)各種復(fù)雜環(huán)境,抵御各種生物與非生物脅迫,是該科植物中十分重要的一類次生代謝產(chǎn)物[8]。在芥子油苷的生物合成過程中,CYP79和CYP83家族發(fā)揮了重要的生物學(xué)功能[12,17]。本研究首次克隆得到了菘藍(lán)IiCYP79B2基因,其編碼蛋白含有1個高度保守的血紅素結(jié)合域:FStGKRGCAA,屬于細(xì)胞色素P450家族;與芝麻菜(Erucasativa, AGM16417.1)、深山擬南芥(Arabidopsislyrata, EFH43155.1)和擬南芥(Arabidopsisthaliana, OAO99245.1)的氨基酸序列較為相似。IiCYP79B2在菘藍(lán)各組織部位中均有表達(dá),且在葉中表達(dá)量最高,表現(xiàn)出一定的組織特異性。與擬南芥的CYP79B2基因在根中表達(dá)最高[18],薺菜BjuCYP83A1基因在莖中表達(dá)量最高等研究結(jié)果存在不同[19]。此外,IiCYP79B2在萌芽期表達(dá)量較低,而后明顯上升,并在生長期表達(dá)量達(dá)到最高,提示該基因的表達(dá)與菘藍(lán)的生長發(fā)育過程存在一定的相關(guān)性,可能在菘藍(lán)的生長期發(fā)揮重要的生物學(xué)功能。由此可見,IiCYP79B2基因具有時空特異性,在不同的發(fā)育時期和組織部位的表達(dá)水平存在不同。

    A.不同發(fā)育時期;B.不同組織部位;C.不同誘導(dǎo)子處理。不同小寫字母代表相對表達(dá)量在0.05水平上差異顯著。

    A.Different developmental stages;B.Different tissues; C.Different elicitors treatments.Different lowercase letters indicate significant differences for the relative expression at 0.05 levels.

    圖8IiCYP79B2基因表達(dá)模式的研究
    Fig.8 Study on expression pattern ofIiCYP79B2gene

    本研究還進(jìn)一步探討了IiCYP79B2基因受不同脅迫處理后表達(dá)模式的變化情況,研究結(jié)果顯示,該基因的表達(dá)顯著響應(yīng)茉莉酸甲酯(MJ)和葡萄糖(Glu)信號的誘導(dǎo),而受到水楊酸(SA)和低溫(4 ℃)脅迫的抑制。Mikkelsen等[20]用MJ處理擬南芥葉片后發(fā)現(xiàn)CYP79B2和CYP79B3的表達(dá)量分別增高了1.5,3.5倍,吲哚族芥子油苷的含量提高到原來的3~4倍,其中N-甲氧基吲哚-3-甲基芥子油苷的積累量更是達(dá)到對照組的10倍之多;同時還發(fā)現(xiàn)MJ和SA在此過程中存在一定的拮抗作用。類似地,西蘭花中蘿卜硫素合成相關(guān)基因BoCYP83A1經(jīng)MJ處理后表達(dá)量升高了1.9倍,而SA處理后表達(dá)量則下降至對照的10%[21]。在本研究中MJ和SA同樣對菘藍(lán)IiCYP79B2基因的表達(dá)具有極為顯著的影響作用,且二者的作用也截然相反,這也與擬南芥中的研究結(jié)果較為一致[20],二者之間是否存在拮抗作用還有待進(jìn)一步探討。此外,本研究還發(fā)現(xiàn)低溫處理能夠明顯降低IiCYP79B2的表達(dá)量,這也與杜海等[22]研究發(fā)現(xiàn)擬南芥在低溫處理后芥子油苷合成相關(guān)基因CYP79B2、CYP79B3、CYP83B1的表達(dá)量顯著降低的研究結(jié)果較為一致。由此可知,菘藍(lán)IiCYP79B2基因的表達(dá)顯著響應(yīng)MJ、Glu信號的誘導(dǎo),而受到SA和低溫處理的抑制,相關(guān)研究結(jié)果與擬南芥、西蘭花中相應(yīng)基因的表達(dá)模式存在一定的相似之處,但也存在具體響應(yīng)模式的不同。

    綜上,本研究首次克隆了菘藍(lán)IiCYP79B2基因,運(yùn)用各種在線軟件進(jìn)行了生物信息學(xué)分析,并對其表達(dá)模式進(jìn)行了初步的探究。這些結(jié)果為進(jìn)一步探究該基因的生物學(xué)功能,深入解析菘藍(lán)中芥子油苷的合成和調(diào)控機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。

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