扁果枸杞角質(zhì)層蠟質(zhì)合成相關(guān)基因LbCER1的克隆及其表達(dá)特征分析

袁惠君，馬倩國，高 澤，李學(xué)勇，鮑婧婷，王春梅，李虎軍

(1.蘭州理工大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730050；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蘭州畜牧與獸藥研究所，甘肅 蘭州 730050；3.蘭州大學(xué) 草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點實驗室，甘肅 蘭州 730020)

干旱是引起土地荒漠化、農(nóng)業(yè)減產(chǎn)最主要的自然災(zāi)害之一[1-2]。植物在漫長的進(jìn)化過程中形成了多種抵御干旱的機理，其中最有效的抗旱機理之一就是分泌蠟質(zhì)到植物角質(zhì)層，形成一層嚴(yán)密的保水層[3]。植物角質(zhì)層蠟質(zhì)合成途徑已基本清楚，其脂肪族成分是由鏈長C26～C32的超長鏈飽和脂肪酸在表皮細(xì)胞中合成，存在2條基本的合成途徑：?；€原途徑和脫羰基途徑[4-5]。在擬南芥(Arabidopsisthaliana)中，脫羰基途徑產(chǎn)生的蠟質(zhì)成分占其蠟質(zhì)總量的80%以上，是合成植物角質(zhì)層蠟質(zhì)的主要途徑[6]，醛脫羰基酶(ECERIFERUM1 ，CER1)是該途徑的關(guān)鍵酶。對擬南芥cer1突變體的研究表明，其莖表面沒有蠟質(zhì)結(jié)晶，體內(nèi)醛大量積累，而鏈長C29烷烴、C29醇和C29酮含量均下降99%以上[6-7]，表明CER1可能編碼醛脫羰基酶，催化長鏈偶數(shù)碳的醛轉(zhuǎn)化為長鏈奇數(shù)碳的烷烴，與C29烷烴及其衍生物的合成密切相關(guān)。但是上述結(jié)果中，醛也可能只是該途徑的副產(chǎn)物，作為后備物在鏈烷烴合成受干擾時引入到該途徑，因此，醛增加的表型并不能直接證明CERl就是醛脫羰基酶。進(jìn)一步構(gòu)建的CER1基因酵母異源表達(dá)系統(tǒng)沒有得到有效的結(jié)果，可能是因為CER1專一性催化產(chǎn)生鏈長大于C27的烷烴產(chǎn)物，而酵母只能合成鏈長小于C26超長鏈飽和脂肪酸，所以酵母異源表達(dá)系統(tǒng)不適于研究植物CER1基因[6]。CER1基因與植物的抗旱性密切相關(guān)[6,8]。因此，在多種植物中克隆CER1基因并驗證其功能，將為系統(tǒng)理解植物的抗旱適應(yīng)機制，挖掘其相關(guān)功能基因奠定理論基礎(chǔ)，對我國西北干旱地區(qū)生態(tài)環(huán)境建設(shè)和栽培作物的抗旱性遺傳改良具有十分重要的理論意義和實踐價值。

扁果枸杞(Lyciumbarbarumssp. Bianguo)是寧夏枸杞(Lyciumbarbarum)的一個品種，其干燥果實具有較高的營養(yǎng)和藥用價值。對10個寧夏枸杞品種干燥果實的主要營養(yǎng)成分分析表明，扁果枸杞的枸杞多糖和還原型VC含量均最高，分別達(dá)0.11，12.35 mg/g，類胡蘿卜素含量達(dá)0.46 mg/g，甜菜堿含量1.05%，品質(zhì)綜合排名第二，僅次于寧杞0901[9-10]。扁果枸杞也是一種表皮蠟質(zhì)極為發(fā)達(dá)的抗旱耐鹽植物[11]，是研究植物抗逆機理和挖掘抗逆基因資源用于作物遺傳育種的良好材料。

本研究用逆轉(zhuǎn)錄PCR(Reverse transcription PCR，RT-PCR)法和RACE法克隆扁果枸杞CER1基因全長，進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并用熒光實時定量PCR(Real-time fluorescence quantitative PCR ，qRT-PCR)法初步探討了滲透脅迫處理下，扁果枸杞CER1基因的表達(dá)模式，為深入研究CER1基因功能奠定分子基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料與處理

扁果枸杞種子于2014年8月采自甘肅省白銀市景泰縣玉杰枸杞引種基地。幼苗培養(yǎng)方法參考文獻(xiàn)[11]：挑選籽粒飽滿的種子，先用2%次氯酸鈉溶液消毒8～10 min，蒸餾水沖洗后，均勻鋪在濕潤濾紙上，避光培養(yǎng)4～5 d，待種子露白后種在蛭石中并加入1/2 Hoagland營養(yǎng)液，置于晝夜溫度(26±2)℃/(23±2)℃，光照16 h/d，光強約200 μmol/(m2·s)，空氣相對濕度40%～60%的溫室中，每2～3 d換一次營養(yǎng)液。待幼苗長至3周齡，用含有80 mmol/L D-山梨醇的1/2Hoagland營養(yǎng)液滲透處理24 h后，取80～100 mg葉置于液氮中速凍用于基因克?。辉俜謩e用含有0(對照)，80，160 mmol/L D-山梨醇的1/2Hoagland營養(yǎng)液處理幼苗0，6，12 h后，取根、莖、葉提取總RNA用于qRT-PCR分析。每處理3個重復(fù)，每個重復(fù)包括2～3株幼苗。

扁果枸杞總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄參照上海生工UNIQ-10柱式TRIzol總RNA抽提試劑盒說明書和SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒說明書進(jìn)行；PrimeScriptTM Ⅱ第一鏈cDNA合成試劑盒、PCR擴增試劑盒、T-載體PCR產(chǎn)物克隆試劑盒購自TaKaRa公司。DNA Marker購自北京天根生化科技有限公司。瓊脂糖購自Sigma。5′和3′-RACE-ready cDNA用寶生物的SMARTerTMRACE cDNA試劑盒制備；qRT-PCR參照TaKaRaPrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，合成第一鏈cDNA，并根據(jù)SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)試劑盒說明書以第一鏈cDNA為模板在ABI公司的7500 fast系統(tǒng)中建立反應(yīng)體系，所用引物均由北京華大基因合成。

1.2 試驗方法

1.2.1LbCER1基因的克隆 在NCBI中下載擬南芥(Arabidopsisthaliana)、亞麻薺(Camelinasativa)、番茄(Solanumlycopersicum)、煙草(Nicotianatabacum)等植物已知的CER1基因序列，根據(jù)其高度同源的保守區(qū)序列，利用DNAMAN 6.0和Primer 5.0生物軟件設(shè)計1對CER1基因的引物P1、P2(表1)，用于擴增CER1基因核心片段，推測PCR產(chǎn)物長度為828 bp。

根據(jù)已知的LbCER1核心片段序列設(shè)計擴增5′端的特異性引物GSP1、NGSP1和3′端的特異性引物GSP2、NGSP2(表1)。這些引物與SMARTerTMRACE cDNA試劑盒所帶的通用引物UPM、UPMshort共同使用，用于外側(cè)、內(nèi)側(cè)PCR擴增。

根據(jù)上述試驗獲得的序列設(shè)計開放閱讀框引物，擴增后測序驗證，再用DNAMAN軟件進(jìn)行序列拼接，得到LbCER1基因全長。

1.2.2LbCER1基因的生物信息學(xué)分析 用DNAMAN 6.0軟件分析CER1核苷酸和氨基酸序列；用TMHMM在線工具預(yù)測跨膜區(qū)[12]；功能結(jié)構(gòu)域分析用InterPro:Protein sequence analysis & classification在線軟件[13]；基本理化性質(zhì)用Expasy的ProtParam工具[12,14]；親水性/疏水性特征分析用Expasy的ProtScale工具[13]；蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測分別用SOPMA[14]和Swiss-Model軟件[12]；信號肽預(yù)測采用 SignalP 4.0 Server[13]；亞細(xì)胞定位用CELLO[13]和SOPMA在線軟件。用MEGA 5.0軟件基于鄰位相連法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.3LbCER1基因的表達(dá)模式分析 根據(jù)已經(jīng)得到的扁果枸杞肌動蛋白(Actin，ACT) 基因片段的序列和LbCER1的全長序列設(shè)計實時定量引物QC1和QC2(表1)，以不同處理時間和不同強度滲透脅迫處理的扁果枸杞根、莖、葉cDNA為模板，以扁果枸杞ACT基因片段(引物為QA1、QA2)為內(nèi)參，按照SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)試劑盒說明書，建立qRT-PCR體系，然后置于ABI Onestep實時定量PCR儀中進(jìn)行擴增，程序如下：95 ℃預(yù)變性 30 min；95 ℃變性 5 s，60 ℃退火30 s，40個循環(huán)。采用2-ΔΔCT法計算LbCER1的相對表達(dá)量，并用SPSS 17.0和Excel進(jìn)行分析和作圖。

表1 LbCER1克隆和qRT-PCR所用的引物序列Tab.1 Primers for LbCER1 gene cloning and qRT-PCR

2 結(jié)果與分析

2.1 LbCER1基因的克隆

根據(jù)其他植物的CER1序列設(shè)計簡并性引物，采用RT-PCR方法從扁果枸杞葉中克隆到828 bp的CER1基因核心片段序列(圖1-A)。Blast分析表明，該片段與已知的植物CER1的同源性在70%以上。通過5′-RACE和3′-RACE方法，克隆到5′和3′端序列，長度分別為992 bp(圖1-B)和786 bp(圖1-C)，最后通過片段拼接得到長度2 168 bp的LbCER1核苷酸全長序列。該序列包含1 881 bp的開放閱讀框(ORF)，107 bp的5′非翻譯區(qū)(UTR)和180 bp的3′-UTR，將其命名為LbCER1。

A. LbCER1基因核心片段；B.5′-RACE的PCR擴增產(chǎn)物；C.3′-RACE的PCR擴增產(chǎn)物。A.The intermediate fragment of LbCER1; B.5′-RACE fragment; C.3′-RACE fragment.

2.2 LbCER1的生物信息學(xué)分析

根據(jù)核苷酸全長序列分析，LbCER1蛋白包含626個氨基酸殘基(圖2)?？缒^(qū)分析和功能結(jié)構(gòu)域分析表明，該蛋白有4個跨膜區(qū)(圖2、圖3-A)，一個脂肪酸羥化酶結(jié)構(gòu)域(Fatty acid hydroxylase domain，圖3-B)和1個位于C-末端的Wax2結(jié)構(gòu)域(Wax2 domain of C-terminal，圖3-B)。

蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析表明，LbCER1由20種氨基酸組成，其中亮氨酸(Leu)含量最高，達(dá)10.4%，半胱氨酸(Cys) 含量最低，為1.3%；分子質(zhì)量為72.47 ku，等電點為7.40，分子式為C3338H5057N851O902S29；帶正電荷的氨基酸(Arg+Lys)與帶負(fù)電荷的氨基酸(Asp+Glu)等量，均為58個。該蛋白脂肪指數(shù)為91.28，不穩(wěn)定系數(shù)為27.88，表明LbCER1是一種耐高溫，性質(zhì)穩(wěn)定的偏堿性蛋白。

親水性/疏水性分析表明，LbCER1平均親水性(Grand average of hydropathicity, GRAVY) 為-0.070，是一種親水性蛋白，其中第95位的天冬酰胺(Asn)殘基分值最小(-3.433)，是肽鏈中親水性最強的位點；第50位的異亮氨酸(Ile) 殘基分值最大(2.878)，是疏水性最強的位點(圖3-C)。

TM1、TM2、 TM3 和TM4分別表示跨膜區(qū)。TM1, TM2, TM3 and TM4 represents the transmembrane regions respectively.

A.跨膜區(qū)預(yù)測；B.功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測；C.親水/疏水性分析。A.Transmembrane prediction; B.Functional domain prediction; C.Hydrophilicity/hydrophobicity prediction.

對LbCER1蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果表明，LbCER1蛋白中69.65%的氨基酸殘基埋在膜內(nèi)，僅21.88%氨基酸殘基暴露在膜外(圖4-A)，推測該蛋白是一個穩(wěn)定的跨膜蛋白，與跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果相符(圖4-A)。該蛋白中α-螺旋(α-Helix)占44.09%，環(huán)(Loop)占45.21%，延伸鏈(Strand)占10.7%(圖4-A)，與三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果相符(圖4-B)。

信號肽分析表明，LbCER1蛋白無信號肽(圖4-C)，不是分泌蛋白。用CELLO軟件分析亞細(xì)胞定位表明，該蛋白定位在內(nèi)膜上(表2)，SOPMA軟件分析顯示LbCER1定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上(GO term ID:GO:0005789)。

表2 LbCER1的亞細(xì)胞定位分析Tab.2 Subcellular localization analysis of LbCER1 protein

2.3 LbCER1與其他植物CER1氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化分析

系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明， LbCER1與煙草(Nicotianatabacum)、番茄(Solanumlycopersicum)、辣椒(Capsicumannuum)等茄科植物親緣關(guān)系極近，同源性達(dá)100%，與可可(Theobromacacao)、油菜(Brassicanapus)、擬南芥(Arabidopsisthaliana)、亞麻薺(Camelinasativa)等雙子葉植物的同源性也在72%以上，但與小麥(Triticumaestivum)、玉米(Zeamays)等單子葉植物則親緣關(guān)系較遠(yuǎn)(圖5)。

A.二級結(jié)構(gòu)預(yù)測；B.三級結(jié)構(gòu)預(yù)測；C.信號肽預(yù)測。A.The secondary structure prediction; B.The tertiary structure prediction; C.Signal peptide prediction.

圖5 LbCER1與其他植物CER1氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.5 Phylogenetic analysis of LbCER1 and CER1 from other plants

2.4 LbCER1在滲透脅迫下的表達(dá)特征分析

qRT-PCR分析表明，LbCER1基因在葉、莖、根中均表達(dá)(圖6)。與對照相比，160 mmol/L山梨醇滲透脅迫處理6 h時，LbCER1基因在葉中的相對表達(dá)量達(dá)到最高，比對照增加1.8倍，處理12 h時增加1倍；在莖中，LbCER1的相對表達(dá)量有波動，6 h時表達(dá)量增加21%，12 h時降低14%；在根中，160 mmol/L山梨醇滲透脅迫處理6，12 h時，LbCER1的相對表達(dá)量達(dá)分別增加1.1倍和32%。80 mmol/L山梨醇滲透脅迫處理6 h時，LbCER1基因在葉中的相對表達(dá)量增加66%，而12 h時降低61%；在莖中，80 mmol/L山梨醇滲透脅迫處理12 h時LbCER1表達(dá)量降低42%；在根中，80 mmol/L山梨醇滲透脅迫處理6 h時LbCER1表達(dá)量降低32%(圖6)。這些結(jié)果表明，LbCER1的表達(dá)受滲透脅迫的誘導(dǎo)。

不同處理間不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。Different treatments with different lowercase mean significant difference at 0.05 level (P<0.05).

3 結(jié)論與討論

高等植物中編碼醛脫羰基酶的CER1基因功能研究最早由Aarts等[15]在擬南芥中進(jìn)行，隨后在千里光(SenecioscandensBuch.-Ham. ex D. Don)[16]、辣椒[17]、亞麻薺[18]、可可[19]、油菜[20]、小麥[21]、玉米[22]等多種植物中被報道。本研究從表皮蠟質(zhì)發(fā)達(dá)的旱生植物扁果枸杞中克隆得到編碼醛脫羰基酶的基因LbCER1，該基因包含1 881 bp的開放閱讀框(ORF)，編碼626個氨基酸，與千里光CER1的ORF框大小相似[16]。序列結(jié)構(gòu)分析表明，擬南芥AtCER1[15]和扁果枸杞蛋白LbCER1均存在多個跨膜區(qū)和一個脂肪酸羥化酶保守區(qū)；在序列相似性上，LbCER1與茄科植物親緣關(guān)系最近，其次與油菜、亞麻薺等雙子葉植物親緣關(guān)系葉達(dá)72%以上，但與小麥、玉米等單子葉植物關(guān)系較遠(yuǎn)，符合植物進(jìn)化的一般趨勢[23]，上述特征均說明CER1蛋白序列在進(jìn)化上相對保守。

擬南芥AtCER1蛋白定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上[24]，由CER1編碼的醛脫羰基酶和由CER3/WAX2/YRE編碼的醛合成酶及一種細(xì)胞色素b6亞型(Cytochrome b6 isoforms ，CYTB5s)催化構(gòu)成一個多酶復(fù)合物催化兩步反應(yīng)，將長鏈脂酰-CoA轉(zhuǎn)化成長鏈烷烴[5]。對扁果枸杞LbCER1的亞細(xì)胞定位分析與表明，LbCER也定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，且扁果枸杞LbCER1 蛋白的C-端包含Wax2結(jié)構(gòu)域，可能該結(jié)構(gòu)域與蛋白的催化功能密切相關(guān)。

擬南芥AtCER1基因只在幼苗、莖、葉、花及莢果的表皮專一性表達(dá)，在根中不表達(dá)[6]。但本研究表明，LbCER1基因在葉、莖、根中均表達(dá)。AtCER1對干旱脅迫十分敏感，低濕條件下處理3 h，AtCER1表達(dá)豐度達(dá)到最大，為對照組的40倍[6]。水稻Glossyl(GL1) 基因與AtCER1基因同源，其表達(dá)也受滲透脅迫的誘導(dǎo)[8]。本研究中，LbCER1受一定強度滲透脅迫的誘導(dǎo)而上調(diào)，表明該基因可能與植物抗逆響應(yīng)密切相關(guān)。

在擬南芥中，WAXINDUCER1/SHINE1(WIN1/SHN1)是第一個被報道的能在干旱處理下通過上調(diào)蠟質(zhì)合成相關(guān)基因KCS1、CER1和CER2促進(jìn)表皮蠟質(zhì)合成的轉(zhuǎn)錄因子[25]。降低蠟質(zhì)合成基因(Decrease wax biosynthesis,DEWAX)是目前發(fā)現(xiàn)的唯一在黑暗誘導(dǎo)下通過調(diào)控蠟質(zhì)合成相關(guān)基因CER1、FAR6、LACS2、ACLA2和ECR抑制表皮蠟質(zhì)沉積的轉(zhuǎn)錄因子[25]。旱生植物中影響表皮蠟質(zhì)沉積及LbCER1基因表達(dá)的上下游調(diào)控因子還需進(jìn)一步鑒定，進(jìn)而深入研究LbCER1功能及其調(diào)控機制，以期為作物的抗旱育種奠定分子基礎(chǔ)。