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    HBV相關性腎炎腎組織AIM2水平及其與炎性因子和腎臟炎癥程度的相關性分析

    2019-11-04 10:14:36張席軍李紅莉趙筱娟
    肝臟 2019年10期
    關鍵詞:弱陽性陽性細胞緩沖液

    張席軍 李紅莉 趙筱娟

    乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染引起的肝硬化、肝衰竭或肝癌等疾患對人類健康造成極大危害[1]。HBV感染可引起HBV相關性腎炎(HBV-associated glomerulonephritis,HBV-GN)等多種肝外相關疾病的發(fā)生[2]。黑色素瘤缺乏因子2(absent in melanoma 2,AIM2)是HIN-200蛋白家族的重要成員之一,其主要分布于細胞漿中,并且可為胞漿內(nèi)的雙鏈DNA所識別而激活,使得半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1(cysteinyl aspartate specific proteinase-1,caspase-1)途徑激活,進而可促使多種炎性因子的成熟及釋放,如白細胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)等,可進一步引發(fā)炎癥反應,因此其在機體固有免疫反應而引起的炎癥中發(fā)揮重要作用[3-4]。本研究通過分析HBV-GN患者腎組織中AIM2水平及其與炎性因子和腎臟炎癥程度的相關性,旨在探討AIM2的激活在HBV-GN中的可能致病機制,進而為加深該病發(fā)病機制的認識及治療提供臨床意義。

    資料與方法

    一、一般資料

    收集本院2016年1月至2018年8月62例HBV-GN患者(HBV-GN組)和46例慢性腎小球腎炎(chronic glomerulonephritis,CGN)患者(CGN組)的臨床資料。其中,HBV-GN組男39例,女23例;年齡22~68歲,平均(37.06±8.86)歲。CGN組男28例,女18例;年齡24~70歲,平均為(38.98±9.84)歲。兩組患者性別和年齡等一般資料比較,差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。

    二、腎組織標本的獲取及免疫組織化學檢測

    在10%中性甲醛固定液中取出活檢標本,采用石蠟進行包埋,制備組織塊。用乙醇進行梯度脫水,二甲苯透明30 min,浸蠟60 min。蠟塊包埋后連續(xù)切片,每張切片厚度均為3 μm,將其切片放置在45 ℃溫水中攤片,采用防脫載玻片進行處理,每張載玻片均撈取3塊組織,控干水分,于70 ℃烤片1~2 h后置于切片盒中,于4 ℃環(huán)境下保存?zhèn)溆?。脫蠟,用乙醇進行梯度水化;采用磷酸鹽緩沖液沖洗3次,每次5 min;抗原熱修復后,將切片放置在3%過氧化氫溶液中并在室溫下孵育10 min,再用磷酸鹽緩沖液沖洗3次,每次5 min;將切片的磷酸鹽緩沖液擦干,各切片上滴加山羊血清50 μL,于室溫下封閉5 min,將多余液體甩去。各切片上滴加一抗50 μL,于37 ℃環(huán)境下孵育60 min;用磷酸鹽緩沖液沖洗3次,每次5 min,之后將切片的磷酸鹽緩沖液擦干。在各切片上滴加二步法免疫組織化學檢測試劑50 μL,于37 ℃環(huán)境下孵育20 min;用磷酸鹽緩沖液沖洗3次,每次5 min。各切片滴加新鮮配制的DAB溶液,于顯微鏡下觀察,用蘇木精復染切片,采用乙醇進行梯度脫水后,中性樹膠封片,最后進行鏡檢。

    三、免疫組織化學檢測結(jié)果判讀[5]

    陽性表達定義為于顯微鏡下可見棕黃色顆粒,可根據(jù)棕黃色顆粒顯色強度及密度進行表達程度的劃分。隨機選取腎組織中10個高倍鏡的觀察視野,對其陽性細胞數(shù)進行計數(shù),取其平均值。按照陽性細胞在總細胞數(shù)中的比例進行評分,分為0分:陽性細胞數(shù)的比例≤5%,記為陰性(-);1分:陽性細胞數(shù)的比例為6%~25%,記為弱陽性(+);2分:陽性細胞數(shù)的比例為26%~49%,記為陽性(++);3分:陽性細胞數(shù)的比例≥50%,記為強陽性(+++)。根據(jù)陽性細胞的著色程度進行評分,分為0分:無著色,記為陰性(-);1分:淡棕黃色,記為弱陽性(+);2分:棕黃色,記為陽性(+);3分:深棕黃色,記為強陽性(+++)。將上述陽性細胞數(shù)的評分與著色程度的評分相加,0~1分記為陰性表達(-),2分記為弱陽性(+),3~4分記為陽性(++),5~6分記為強陽性(+++)。其中,陽性表達率=(弱陽性例數(shù)+陽性例數(shù)+強陽性例數(shù))/例數(shù)×100%。

    四、統(tǒng)計學分析

    結(jié) 果

    一、免疫組織化學檢測結(jié)果

    在HBV-GN患者的腎組織中,AIM2主要分布于腎小球細胞漿中的內(nèi)皮細胞和系膜細胞,且部分可見于腎小管及間質(zhì)內(nèi)。見圖1。二、兩組患者腎組織中AIM2表達水平的比較

    HBV-GN組AIM2的陽性表達率為79.03%,較CGN組的32.61%明顯升高(P<0.05),見表1。

    表1 兩組患者腎組織中AIM2表達水平的比較

    三、HBV-GN患者腎組織中AIM2的表達與IL-1β、caspase-1均表達的相關性

    采用Spearman相關性分析可發(fā)現(xiàn),HBV-GN患者腎組織中AIM2的水平與IL-1β、caspase-1均存在正相關關系(r=0.58、0.68,均P<0.01)。見表2。

    表2 HBV-GN患者腎組織中AIM2的表達與IL-1β、caspase-1均表達的相關性(例)

    討 論

    HBV感染程度的不同可導致肝臟出現(xiàn)不同程度的病變,且可導致多種不同程度的肝外表現(xiàn),而HBV-GN是其中的一種常見病,也是繼發(fā)性腎小球腎炎的常見病因。既往研究報道,在我國各種GN患者中,HBV-GN發(fā)病率為16.6%~32%[6]。目前,有關HBV-GN的具體發(fā)病機制仍未完全定論,但普遍觀點認為該病與免疫反應密切相關[7]。因HBV感染后,抗原成分與抗體產(chǎn)生免疫復合物,并沉積于腎小球血管壁,可進一步引發(fā)機體Ⅲ型變態(tài)免疫反應,使腎小球基底膜受損,紅細胞和蛋白漏出,導致腎臟損傷,最終誘發(fā)HBV-GN的發(fā)生[8]。IL-1β是重要的炎性因子之一,其在CGN的發(fā)生及發(fā)展的病理過程中起到重要作用[9]。作為模式識別受體之一,AIM2具有特異性識別抗原信號的作用,可通過感受細菌或病毒感染時釋放至細胞漿的雙鏈DNA,并通過結(jié)合接頭蛋白ASC,生成炎性復合體——AIM2炎性小體,可進一步促使caspase-1活化,使之裂解IL-18、IL-1β等多種炎癥因子[10]。HBV-GN患者中腎組織的固有細胞內(nèi)存在乙型肝炎病毒樣顆粒和HBV DNA復制,而作為胞漿內(nèi)DNA識別受體之一,AIM2可能在肝細胞中通過識別HBV DNA,促使caspase-1途徑激活,并進一步促進IL-1β等炎性因子釋放,最終導致肝炎的發(fā)生[11]。另有研究認為,DNA識別受體具有識別pg RNA或HBV DNA的作用并可誘導固有免疫反應,這可能是HBV引起肝臟炎癥的一種重要機制,而AIM2與HBV引起肝炎發(fā)生和發(fā)展機制過程中的重要DNA識別受體[12]。

    圖1 AIM2在HBV-GN患者腎組織中的表達(HE染色,×400)A:陰性(-),B:弱陽性(+),C:陽性(++),D:強陽性(+++)

    本研究發(fā)現(xiàn),HBV-GN組AIM2的陽性表達率為79.03%,較CGN組的32.61%明顯升高。提示胞漿內(nèi)HBV DNA的發(fā)生可能促使AIM2的表達激活,繼而促使下游炎性復合體激活,引發(fā)固有免疫反應,因此在HBV-GN的炎性過程中發(fā)揮重要作用。并且,本研究經(jīng)Spearman相關性分析發(fā)現(xiàn),HBV-GN患者腎組織中AIM2水平與IL-1β、caspase-1均存在正相關關系(r=0.58、0.68,P<0.01)。提示AIM2的表達水平可能與HBV-GN患者炎癥進展程度存在一定關系。由此推斷,AIM2可能通過識別且結(jié)合HBV DNA后被激活,使caspase-1活化而產(chǎn)生炎性復合體,促進IL-1β等致前炎性因子成熟、釋放及排泄,從而導致HBV-GN患者腎損傷加重,提示AIM2在HBV-GN腎小球細胞炎性損傷的過程中可能起到重要作用。另外,本研究62例HBV-GN患者中,13例患者出現(xiàn)AIM2表達陰性的原因可能與以下幾點密切相關:①腎臟細胞質(zhì)內(nèi)并無完整的HBV DNA;②腎臟細胞質(zhì)內(nèi)其他雙鏈DNA可感應蛋白質(zhì),可通過感知HBV DNA而導致炎性損傷;DNA依賴的干擾素調(diào)節(jié)因子激活物可直接結(jié)合胞質(zhì)內(nèi)雙鏈DNA,促使干擾素調(diào)節(jié)因子3轉(zhuǎn)錄因子的激活,增強TANK2結(jié)合激酶1的活性,可進一步引發(fā)固有免疫反應而造成炎癥的發(fā)生;③通過結(jié)合干擾素誘導蛋白16等其他HIN-200家族蛋白,誘導免疫損傷。

    綜上所述,HBV-GN患者腎組織AIM2表達水平明顯升高,且與IL-1β、caspase-1等多種炎性因子水平和腎臟炎癥程度存在密切關系。

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