白香丹膠囊對(duì)PMDD肝氣逆證模型大鼠血清抗焦慮樣作用機(jī)制研究

王 帥 郜彥鑫 張 洪 付曉杰 劉金虎 張 浩 王杰瓊 宋春紅

經(jīng)前煩躁障礙癥(premenstrual dysphoric disorder, PMDD)，是指女性月經(jīng)來臨前一周反復(fù)出現(xiàn)的一系列情感、軀體及社會(huì)人際交往方面的綜合癥狀，具有月經(jīng)來臨后癥狀減輕月經(jīng)結(jié)束后癥狀消失的特點(diǎn)，是經(jīng)前期綜合征(premenstrual syndrome, PMS)的嚴(yán)重亞型之一[1]。PMDD肝氣逆證作為PMDD的主要證候之一，除具有PMDD的一般癥狀外，主要表現(xiàn)為急躁易怒、小腹墜脹、焦慮、心煩等癥狀，極大地影響女性的正常經(jīng)期生活[2，3]。近年來，大量國內(nèi)外相關(guān)研究表明，PMDD肝氣逆證的發(fā)生可能與患者體內(nèi)雌、孕激素及抑制性氨基酸神經(jīng)遞質(zhì)γ-氨基丁酸的表達(dá)異常有關(guān)。實(shí)驗(yàn)室前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，白香丹膠囊能提高PMDD肝氣逆證大鼠的行為學(xué)得分，但其作用機(jī)制尚待深入研究[4]。本研究在實(shí)驗(yàn)室前期行為學(xué)評(píng)價(jià)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步檢測(cè)給藥后大鼠血清中孕酮(P)、四氫孕酮(ALLO)、γ-氨基丁酸(GABA)的含量變化，研究白香丹膠囊對(duì)PMDD肝氣逆證模型大鼠血清中P、ALLO、GABA的影響，進(jìn)一步明確白香丹膠囊對(duì)PMDD肝氣逆證在血清中的具體作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用及進(jìn)一步的機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:SPF級(jí)雌性健康未孕Wistar大鼠，體質(zhì)量135±15g，200只，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物合格證編號(hào)：SCXK(京)2018-0001。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)7天，每天正常抓握所有大鼠，每次每只大鼠抓握時(shí)間不少于5min。飼養(yǎng)環(huán)境恒溫23±3℃，恒濕60%±5%RH，晝夜顛倒(12h/12h)每天22:00時(shí)開燈、次日8:00時(shí)關(guān)燈，食物和水正常攝取。所有操作均在≤25lx的暗淡紅色燈光下進(jìn)行。

2.儀器與試劑：電子天平(ZA102R4，德國賽多利斯集團(tuán))；大鼠受孕期分析儀(MK-11，日本Muromachi)；SuperMaze動(dòng)物行為分析系統(tǒng)(上海欣軟信息科技有限公司)；大鼠高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)箱體(上海欣軟信息科技有限公司)；大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)箱體(上海欣軟信息科技有限公司)；水合氯醛(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；青霉素(山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司；批號(hào)：140602)；白香丹膠囊(山東中醫(yī)藥大學(xué)天然藥物實(shí)驗(yàn)室制；批號(hào)：20171030)；鹽酸氟西汀分散片(常州四藥制藥有限公司；批號(hào)H20170462)；孕酮ELISA檢測(cè)試劑盒(武漢華美生物科技有限公司；產(chǎn)品編號(hào)：C013218011)；四氫孕酮ELISA檢測(cè)試劑盒(武漢伊艾博科技有限公司；產(chǎn)品編號(hào)：8A296J)；γ-氨基丁酸ELISA檢測(cè)試劑盒(武漢基因美生物科技有限公司；產(chǎn)品編號(hào)：GR201801-1)。

3.居住入侵法制備PMDD肝氣逆證模型大鼠：(1)實(shí)驗(yàn)大鼠動(dòng)情周期的確定：根據(jù)大鼠受孕期分析儀來判斷雌性大鼠動(dòng)情周期：陰道電阻值≥3Kohm的雌性大鼠處于接受期(約1天)，陰道電阻值<3Kohm的雌性大鼠處于非接受期(約3天)，動(dòng)情周期規(guī)律的大鼠符合一定的規(guī)律，即一個(gè)動(dòng)情周期(約4天)的電阻值變化為高、低、低、低。將連續(xù)兩個(gè)動(dòng)情周期(約8天)陰道電阻值變化符合上述規(guī)律的雌性大鼠作為動(dòng)情周期規(guī)律大鼠。(2)居住入侵誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)：動(dòng)情周期規(guī)律大鼠作為實(shí)驗(yàn)的居住鼠，動(dòng)情周期不規(guī)律大鼠作為實(shí)驗(yàn)的入侵鼠，并對(duì)入侵鼠行雙側(cè)卵巢摘除手術(shù)，手術(shù)恢復(fù)14天，待其痊愈后，進(jìn)行居住入侵誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)。晝夜顛倒后在14:30～17:30時(shí)大鼠處于夜間興奮狀態(tài)，因此每天實(shí)驗(yàn)時(shí)間均為該時(shí)間段，并在居住鼠飼養(yǎng)環(huán)境中進(jìn)行。對(duì)居住鼠進(jìn)行連續(xù)4天(一個(gè)完整動(dòng)情周期)的居住入侵誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)。待所有居住鼠居住入侵實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，采用盲法對(duì)實(shí)驗(yàn)過程進(jìn)行評(píng)定。

4.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥：居住入侵實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，根據(jù)各居住鼠的行為測(cè)試得分高低排列。將得分前75%的大鼠平均分為3組，即PMDD肝氣逆證模型組(Model)、白香丹膠囊干預(yù)組(BXD)和鹽酸氟西汀分散片干預(yù)組(FXT)，并將得分后25%的大鼠作為空白對(duì)照組(Control)。于每日8：30時(shí)按1ml/100g灌胃給藥，連續(xù)給藥28天。BXD組大鼠給予白香丹膠囊，給藥量為0.2g/(kg·d)；FXT組大鼠給予鹽酸氟西汀分散片，給藥量為2.7mg/(kg·d)；模型組及正常組大鼠給予同等體積的純水。

5.行為學(xué)評(píng)價(jià):行為學(xué)評(píng)價(jià)于非接受期進(jìn)行，末次給藥1h后進(jìn)行攻擊行為測(cè)試、曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)和高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)。采用攻擊行為測(cè)試來評(píng)價(jià)大鼠給藥后激怒行為，采用曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)和高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)來評(píng)價(jià)大鼠的焦慮樣行為。(1)攻擊行為測(cè)試:對(duì)所有的居住鼠進(jìn)行4天(一個(gè)完整動(dòng)情周期)的攻擊行為測(cè)試，具體方法同居住入侵誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)。(2)曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)：于大鼠的夜間進(jìn)行，具體方法為輕捏待測(cè)大鼠頸背部皮膚并將其置于黑色的曠場(chǎng)箱(規(guī)格：50cm×50cm×40cm)的中央，用Supermaze 3.0動(dòng)物行為分析系統(tǒng)記錄、跟蹤待測(cè)大鼠6min內(nèi)的自由活動(dòng)行為。觀察的指標(biāo)包括總路程、中央?yún)^(qū)停留的總時(shí)間。為避免大鼠間氣味的相互干擾，每只大鼠測(cè)定結(jié)束后應(yīng)用乙醇將曠場(chǎng)箱擦拭干凈后，再進(jìn)行下一只老鼠的檢測(cè)。(3)高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)：待測(cè)大鼠跑完曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)后，輕捏其頸背部皮膚并將其放于十字高架迷宮的中央?yún)^(qū)，且保證大鼠頭部朝向任一開臂并允許其自由探索。用Supermaze 3.0動(dòng)物行為分析系統(tǒng)記錄、跟蹤大鼠5min內(nèi)自由活動(dòng)行為。觀察的指標(biāo)包括進(jìn)入兩開臂的次數(shù)(OE)、進(jìn)入兩開臂的時(shí)間(OT)、進(jìn)入兩封臂的次數(shù)(CE)、進(jìn)入兩封臂的時(shí)間(CT)。

6.取材并檢測(cè)：生殖內(nèi)分泌激素的測(cè)定于待測(cè)大鼠全部完成行為學(xué)評(píng)價(jià)后(確保待測(cè)大鼠此時(shí)仍處于非接受期)，10%水合氯醛(35mg/kg)腹腔麻醉，大鼠腹主動(dòng)脈取血，血樣靜置30min后3500r/min離心10min，將離心后的上層血清轉(zhuǎn)移至EP管中。采用ELISA法分別測(cè)定各組大鼠血清中P、ALLO、GABA的含量，操作按試劑盒說明書進(jìn)行。

結(jié) 果

1.攻擊行為測(cè)試:與正常組大鼠比較，模型組大鼠攻擊行為明顯增加(P<0.01)；與模型組大鼠比較，F(xiàn)XT組大鼠和BXD組大鼠的攻擊行為均明顯減小(P<0.01)，詳見圖1。

圖1 各組大鼠攻擊行為測(cè)試得分與正常組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.01

2.曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)：與正常組比較，模型組大鼠總路程增加(P<0.01)，而在中央?yún)^(qū)停留的總時(shí)間減少(P<0.01)；與模型組比較，F(xiàn)XT組和BXD組大鼠總路程均明顯減少(P<0.01)，而在中央?yún)^(qū)停留的總時(shí)間均明顯增加(P<0.01)；與FXT組比較，BXD組大鼠總路程稍有增加，在中央?yún)^(qū)停留的總時(shí)間也稍有增加，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，詳見圖2。

圖2 各組大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)得分與正常組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.01

3.高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)：與正常組比較，模型組大鼠進(jìn)入開放臂的次數(shù)百分比和時(shí)間百分比均明顯減少(P<0.01)；與模型組比較，F(xiàn)XT組和BXD組大鼠進(jìn)入開放臂的次數(shù)百分比和時(shí)間百分比均明顯增加(P<0.01)；與FXT組比較，BXD組大鼠進(jìn)入開放臂的次數(shù)百分比和時(shí)間百分比均略有增加，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，詳見圖 3。

4.血清中指標(biāo)檢測(cè):與正常組比較，模型組大鼠血清中P水平顯著下降(P<0.05)，ALLO水平顯著下降(P<0.05)，GABA水平顯著下降(P<0.05)；與模型組比較，F(xiàn)XT組和BXD組大鼠血清中P水平均顯著上升(P<0.05)，ALLO水平均顯著上升(P<0.05)，GABA水平顯著上升(P<0.05)；與FXT組比較，BXD組大鼠血清中P水平略有上升，ALLO水平略有下降，GABA水平略有下降，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，詳見圖4及表1。

圖3 各組大鼠高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)得分與正常組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.01

圖4 各組大鼠血清指標(biāo)水平與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

組別n給藥量孕酮(ng/ml)四氫孕酮(ng/ml)γ-氨基丁酸(ng/ml)正常組12相等劑量47.11±3.2268.975±0.525147.11±3.226模型組12相等劑量19.56±2.359?6.497±0.1135?19.56±2.359?氟西汀組122.7mg/(kg·d)34.28±2.840#8.130±0.1895#34.28±2.840#白香丹組120.2g/(kg·d)38.14±4.029#7.863±0.3330#38.14±4.029#

與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

討 論

PMDD肝氣逆證作為PMDD的亞型之一，突出表現(xiàn)為急躁易怒、心煩、焦慮、小腹墜脹等癥狀，嚴(yán)重?fù)p害了女性的身心健康，給社會(huì)帶來了沉重負(fù)擔(dān)。近年來有關(guān)PMDD肝氣逆證的發(fā)病機(jī)制研究逐漸深入，越來越多的研究表明該疾病的發(fā)病機(jī)制與機(jī)體某些調(diào)節(jié)激素及神經(jīng)遞質(zhì)的水平異常有關(guān)。

大量研究發(fā)現(xiàn)，性激素水平改變與女性情緒密切相關(guān)[5]。PMDD與卵巢黃體分泌的孕酮關(guān)系密切[6]。喬明琦等[7]研究證實(shí)PMDD肝氣逆證患者E2、P卵泡期分泌峰的低水平與黃體期分泌峰的闕如，推測(cè)其是 PMDD 肝氣逆證微觀機(jī)制之一，這與筆者研究結(jié)果一致，PMDD肝氣逆證模型大鼠血清中P含量明顯降低，藥物干預(yù)后明顯增加，行為學(xué)癥狀得以改善，血清中P含量明顯增加。表明模型大鼠體內(nèi)P含量的紊亂是誘發(fā)PMDD肝氣逆證發(fā)生的重要機(jī)制，白香丹膠囊可以通過提高模型大鼠體內(nèi)P的含量來發(fā)揮作用。ALLO作為另一類重要的神經(jīng)類固醇，被認(rèn)為是強(qiáng)效GABAA受體激動(dòng)劑，其血清水平能夠反映月經(jīng)周期的孕酮變化[8，9]。

Schüle等[10]研究表明，減少ALLO在外周血或腦脊液水平與焦慮癥、嚴(yán)重抑郁癥、經(jīng)前焦慮障礙或攻擊行為密切相關(guān)，ALLO降低會(huì)誘發(fā)焦慮癥狀的出現(xiàn)，癥狀改善后其含量會(huì)有所增加，這與本研究結(jié)果一致，模型大鼠血清中ALLO含量呈現(xiàn)大致相同的變化，模型組大鼠與對(duì)照組比較，ALLO水平顯著性下降，經(jīng)過白香丹膠囊治療后，其ALLO水平顯著增加。也與ALLO在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物身上體現(xiàn)出麻醉和抗焦慮特性的研究一致[11，12]。但也有研究證明ALLO水平降低對(duì)個(gè)體是有益的，可能是因?yàn)锳LLO在杏仁核反應(yīng)中存在雙峰效應(yīng)有關(guān)[13]。對(duì)于PMDD患者與正常對(duì)照組ALLO血清水平存在一定差異的結(jié)論，有待于進(jìn)一步研究[14]。

γ-氨基丁酸(GABA)是已知重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，有抑制攻擊性行為的作用。調(diào)查顯示有攻擊性傾向的人，外周血與攻擊性史呈負(fù)相關(guān)[15]。研究證實(shí)，GABA可以有效抑制HPA軸功能亢進(jìn)，進(jìn)行負(fù)反饋調(diào)節(jié)，改善情緒障礙類疾病，當(dāng)焦慮癥狀出現(xiàn)時(shí)GABA含量顯著性下降[16]。本研究中模型大鼠血清中GABA含量顯著性下降，給予白香丹膠囊后，血清中GABA含量明顯增加，與對(duì)照組GABA水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。馮玉等[17]研究證實(shí)，白香丹膠囊通過提高GABA的水平而對(duì)PMS肝氣逆證大鼠血清和大腦皮質(zhì)神經(jīng)中樞有一定的抑制作用?？芍狦ABA水平異常是PMDD 肝氣逆證的重要病理機(jī)制，也是白香丹膠囊的重要作用靶點(diǎn)。

綜上所述，本研究證實(shí)白香丹膠囊可提高PMDD肝氣逆證模型大鼠血清中P、ALLO、GABA水平，為探究PMDD肝氣逆證模型大鼠腦區(qū)發(fā)病機(jī)制的研究奠定了基礎(chǔ)。由此推測(cè)PMDD肝氣逆證的發(fā)病可能與機(jī)體中樞系統(tǒng)中上述指標(biāo)的含量下降有關(guān)，而白香丹膠囊可以通過提升P、GABA、ALLO的水平發(fā)揮治療作用。由于技術(shù)水平有限，本研究未能深入探討其在腦區(qū)的水平差異，有待于在今后開展的研究中證實(shí)。