• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    氮肥減施對花生根際土壤固氮微生物多樣性的影響

    2019-11-02 13:16:49吳海寧黃志鵬唐秀梅熊發(fā)前鐘瑞春賀梁瓊韓柱強蔣菁劉菁唐榮華
    江蘇農業(yè)科學 2019年16期
    關鍵詞:多樣性

    吳海寧 黃志鵬 唐秀梅 熊發(fā)前 鐘瑞春 賀梁瓊 韓柱強 蔣菁 劉菁 唐榮華

    摘要:設置施氮N3(64 kg/hm2)、減量施氮N2(51 kg/hm2)、減量施氮N1(34 kg/hm2),不施氮N0共4個施氮水平,對花生單作、玉米花生間作體系中花生根際土壤樣品運用Illumina MiSeq高通量測序技術測序并分析固氮微生物的多樣性。結果表明,在單作花生根際土中固氮微生物的多樣性和豐度隨著氮肥的減施表現(xiàn)出升高的趨勢,而在間作花生根際土中固氮微生物的多樣性和豐度則隨著氮肥的減施出現(xiàn)降低的趨勢。對24個花生根際土壤樣品進行測序分析得到,固氮微生物可操作分類單元(OTUs)在分類學門、科和屬水平上可歸類為8個門、29個科和37個屬,其中在門水平上有3個優(yōu)勢類群,共占所有門的97.7%以上,分別為變形菌門(Proteobacteria)、細菌未分類門(p_unclassified_k_,norank_d_Bacteria)、藍藻門(Cyanobacteria)。氮肥減施條件下固氮微生物群落結構在單作花生根際土壤中比較相似,在間作花生根際土壤差異較大。試驗表明,氮肥減施有利于單作花生根際土壤固氮微生物的生長,增強固氮微生物相對土壤中其他微生物的競爭優(yōu)勢,提高固氮微生物的多樣性和豐度。而氮肥減施不利于間作花生根際土壤固氮微生物的生長繁殖,降低了間作花生根際土壤固氮微生物的多樣性和豐度。

    關鍵詞:氮肥減施;花生根際土;固氮微生物;多樣性

    中圖分類號: S154.3 ?文獻標志碼: A

    文章編號:1002-1302(2019)16-0093-04

    收稿日期:2018-05-07

    基金項目:國家自然科學基金(編號:31660371);廣西科技開發(fā)項目(編號:桂科轉1599004-12);現(xiàn)代農業(yè)產業(yè)技術體系建設專項資金(編號:CARS-13-華南區(qū)栽培);廣西自然科學基金(編號:2017GXNSFAA198144);廣西農業(yè)科學院科技發(fā)展基金(編號:桂農科2017JM18)。

    作者簡介:吳海寧(1986—),男,廣西扶綏人,碩士,助理研究員,主要從事花生栽培與育種研究工作。

    通信作者:唐榮華,博士,研究員,主要從事花生高產高效栽培與育種研究工作。

    氮素是植物不可或缺的營養(yǎng)元素,是提高作物產量的重要限制因子。但是過量施用氮肥會對土壤環(huán)境造成損害,也會對農田土壤微生態(tài)造成影響。近年來人們開始關注氮肥的施用以及土壤養(yǎng)分的轉化和循環(huán)。生物固氮是農田生態(tài)系統(tǒng)中土壤氮素的有效來源之一[1],土壤中的固氮微生物能夠將空氣中的N2還原成NH3供植物根系吸收,是農田生態(tài)系統(tǒng)物質循環(huán)的主要途徑之一[2]。土壤固氮微生物是根際土壤環(huán)境的重要組成部分,其群落多樣性可以反映土壤微生態(tài)的代謝方式和生理功能[3],群落結構組成能影響氮素循環(huán)的平衡與土壤氮素的固定,在土壤氮素循環(huán)中起著重要作用。因此研究氮肥減施和不同種植模式下土壤固氮微生物的群落結構差異,對建立合理的種植模式和土壤氮素循環(huán)利用具有重要意義。

    花生是我國重要的油料作物與經濟作物,是食用油和蛋白質的來源。為滿足消費需求,我國花生的種植面積、規(guī)模、產量持續(xù)增長,同時也消耗了大量的化學肥料,影響土壤微生態(tài)環(huán)境。為可持續(xù)發(fā)展農業(yè),減少對農業(yè)化學氮肥的依賴,花生與禾本科間作體系正越來越受到關注[4]。間作能增加農田生物的多樣性和穩(wěn)定性,提高土壤微生物量,改善農田土壤生態(tài),促進農田生態(tài)系統(tǒng)平衡[5],是農業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要栽培模式。

    土壤固氮微生物含有編碼固氮酶蛋白的nifH基因,該基因與16S rRNA的系統(tǒng)發(fā)育有著顯著的相似性[6],可以作為分子生物學研究土壤固氮微生物的靶標[7]。已有學者利用分子生物學方法對土壤、海洋、河流等生態(tài)環(huán)境進行研究,結果表明,不同的生態(tài)環(huán)境中含有固氮酶nifH基因的微生物群落多樣性和結構具有顯著的差異[8]。目前對單、間作花生在氮肥減施條件下根際土壤固氮微生物的研究鮮有報道。因此,本研究利用Illumina MiSeq高通量測序技術,探討氮肥減施對單、間作花生根際土壤固氮微生物多樣性及群落組成的影響,以期為花生生產中氮肥減施及花生與禾本科間作體系研究提供土壤固氮微生物方面的參考依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 試驗材料

    供試的花生品種為桂花836、玉米品種為桂單0810。供試地點土壤理化性質:全氮、全磷、全鉀含量分別為0.113%、0.053%、0.240%,水解性氮含量為88 mg/kg,有效磷含量為11.4 mg/kg,速效鉀含量為110 mg/kg,有機質含量為 18.5 g/kg,pH值為7.1。

    1.2 試驗方案

    試驗于2017年3月在廣西農業(yè)科學院武鳴里建科學研究基地進行,采用裂區(qū)設計,主區(qū)為種植模式,分別為花生單作、玉米花生間作,副區(qū)為花生施氮總量,共設置4個不同施氮水平,分別為常規(guī)施氮N3(64 kg/hm2),減量施氮N2(51 kg/hm2),減量施氮N1(34 kg/hm2),不施氮N0(對照),共8個處理,3次重復,每個小區(qū)面積為40 m2。每小區(qū)花生還需施用P2O5 67.5 kg/hm2、K2O 67.5 kg/hm2以及鈣鎂磷肥750 kg/hm2,玉米施肥模式為450 kg/hm2復合肥(N ∶P2O5 ∶K2O 含量百分比為15 ∶15 ∶15)作基肥,300 kg/hm2 復合肥和150 kg/hm2尿素(N含量為46%)作追肥。玉米、花生均采用寬窄行種植,規(guī)格相同,大行距55 cm,小行距35 cm,玉米株距為0.2 m,每穴1株,花生穴距為 0.16 m,每穴2株。間作采用4行玉米、6行花生的種植模式。

    1.3 根際土壤樣品的采集

    于花生莢果膨大期采集各處理小區(qū)的花生根際土壤。將處理小區(qū)的花生植株拔起,輕輕抖落根部的表土后,用無菌毛刷將附著在根系表面1~4 mm的土壤刷入無菌離心管中,每小區(qū)取3份根際土壤,混合后作為該小區(qū)的根際土壤樣品,保存于-80°冰箱,用于固氮微生物多樣性的分析。

    1.4 土壤固氮微生物多樣性分析

    1.4.1 土壤總DNA提取及PCR擴增

    取0.5 g土壤樣品,使用MP Bio公司生產的土壤基因組DNA提取試劑盒(FastDNA Spin Kit For Soil)進行土壤樣品總DNA的提取與純化,DNA濃度和純度利用超微量分光光度計(Nano Drop2000)進行檢測,利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質量。

    選用聚合酶鏈式反應(PCR)引物nifHF(5′-AAAGGYGGWATCGGYAARTCCACCAC-3′)和nifHR(5′-TTGTTSGCSGCRTACATSGCCATCAT-3′)對nifH基因進行擴增,體系為DNA聚合酶緩沖液(5×FastPfu)4 μL,2.5 mmol/L dNTPs 2 μL,正反向引物(5 μmol/L)各0.8 μL,F(xiàn)astPfu聚合酶0.4 μL,10 ng DNA模板,補雙蒸水(ddH2O)至20 μL。擴增程序:95 ℃ 預變性3 min;95 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,35個循環(huán);72 ℃延伸10 min(PCR儀為ABI GeneAmp?9700型)。

    1.4.2 Illumina Miseq測序

    使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產物,利用DNA凝膠回收試劑盒進行純化,三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl)緩沖液洗脫,2%瓊脂糖電泳檢測;利用微型熒光計(QuantiFluorTM-ST)進行定量檢測。根據(jù)高通量測序(Illumina MiSeq)平臺標準操作規(guī)程對純化后的擴增片段構建文庫。

    利用Illumina公司的Miseq PE300平臺進行測序(委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司測序)。

    1.4.3 數(shù)據(jù)處理

    原始測序序列使用Trimmomatic軟件進行質控,并用FLASH軟件進行拼接;使用UPARSE軟件(版本:version 7.1,網(wǎng)址:http://drive5.com/uparse/)根據(jù)97%的相似度對序列進行分類單元(OTU)聚類;使用UCHIME軟件剔除嵌合體。利用核糖體數(shù)據(jù)庫項目(RDP)分類器(網(wǎng)址:http://rdp.cme.msu.edu/)對每條序列進行物種分類注釋,與FGR數(shù)據(jù)庫中的固氮酶基因(nifH)進行比對,設置比對閾值為70%;運用I-Sanger生信云平臺(網(wǎng)址:http://www.i-sanger.com/)進行樣本內多樣性(Alpha)和樣本間多樣性(Beta)計算分析。

    2 結果與分析

    2.1 測序結果質量分析

    運用高通量測序技術對24個花生根際土壤樣品里的固氮微生物nifH基因進行測序分析,并對原始測序序列進行過濾、雙端拼接,共獲得優(yōu)化序列347 174條,序列的平均長度為 430.67 bp。將優(yōu)化序列按照97%相似性對非重復序列(不含單序列)進行OTU聚類,在聚類過程中去除嵌合體,共得到OTU的代表序列1 228條,各土壤樣品相關測序數(shù)據(jù)如表1所示。

    稀釋性曲線(rarefaction curve)通過序列數(shù)與物種數(shù)來構建,可以用于驗證測序數(shù)據(jù)量是否足以反映樣品中的物種多樣性,也可以用來說明樣本的測序數(shù)據(jù)量是否足以覆蓋所有類群。從圖1可以看出,各樣品的序列數(shù)據(jù)量達到7 000條時,可操作單元數(shù)基本趨于飽和,表明測序獲得了足夠多的數(shù)據(jù)量,而且從表1可知,各樣品測序覆蓋度都在0.95以上,基本可以反映各土壤樣品中固氮微生物的信息。

    2.2 各樣品中固氮微生物多樣性指數(shù)分析

    Chao1指數(shù)和Ace指數(shù)常用來衡量樣品中微生物物種豐度即物種數(shù)量的多少,是生態(tài)學中估計物種總數(shù)的常用指數(shù)。Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)常用于衡量樣品中微生物物種多樣性,Shannon指數(shù)值越大,Simpson指數(shù)值越小,則說明樣品中微生物群落多樣性越高。從表2可以看出,單作花生N0、N1處理的Chao1指數(shù)、Ace指數(shù)、Shannon指數(shù)均分別大于N2、N3處理,單作花生N0、N1處理的Simpson指數(shù)均分別小于N2、N3處理,大體上看,單作花生根際土壤固氮微生物的多樣性和豐度隨著氮肥的減施基本上呈現(xiàn)出升高的趨勢;除了Ace指數(shù)外,間作花生N0、N1處理的Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)均分別小于N2、N3處理,間作花生N0、N1處理的Simpson指數(shù)均分別大于N2、N3處理,大體上看,間作花生根際土壤固氮微生物的多樣性和豐度隨著氮肥的減施大致出現(xiàn)降低的趨勢。說明在栽培單作花生時,減施氮肥能提高花生根際土壤的固氮微生物多樣性和豐度,而間作花生則相反。

    2.3 不同花生根際土壤固氮微生物的群落結構分析

    24個花生根際土壤樣品經測序檢測得到,固氮微生物OTUs在分類學門、科和屬水平上可歸類為8個門、29個科和37個屬。其中變形菌門(Proteobacteria)、細菌未分類門(p_unclassified_k_norank_d_Bacteria)、藍藻門(Cyanobacteria)是門水平上的3個優(yōu)勢類群,其占比之和大于97.7%(圖2)。在屬分類水平上平均豐度大于1%的有16個屬,其中主要的優(yōu)勢類群有變形菌門未分類屬(unclassified_p_Proteobacteria)、根瘤菌目未分類屬(unclassified_o_Rhizobiales)、α-變形菌綱未分類屬(unclassified_c_Alphaproteobacteria)、慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium)、細菌未分類屬(unclassified_k_norank_d_Bacteria)、地桿菌屬(Geobacter)、厭氧黏細菌屬(Anaeromyxobacter)、三離藻屬(Trichormus)、產堿菌屬(Azohydromonas)9個,其在所有土壤樣品中平均相對豐度分別為35.4%、13.2%、11.1%、8.7%、7.9%、6.3%、3.6%、3.3%、1.5%(圖3)。

    在單作花生的根際土壤中,變形菌門未分類屬(unclassified_p_Proteobacteria)、厭氧黏細菌屬的相對豐度值隨著氮肥的減施表現(xiàn)出先降低后再升高的趨勢,均在N2水平下達到最低值。α-變形菌綱未分類屬(unclassified_c_Alphaproteobacteria)、地桿菌屬的相對豐度值均隨著氮肥的減施呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢,前者達到最高值時在N2水平,后者則在N1水平。根瘤菌目未分類屬(unclassified_o_Rhizobiales)的相對豐度值無明顯的變化規(guī)律。慢生根瘤菌屬的相對豐度值受氮肥減施影響不大。

    在間作花生的根際土壤中,變形菌門未分類屬(unclassified_p_Proteobacteria)、根瘤菌目未分類屬(unclassified_o_Rhizobiales)、α-變形菌綱未分類屬(unclassified_c_Alphaproteobacteria)、厭氧黏細菌屬的相對豐度值是隨著氮肥的減施均呈現(xiàn)出先降低后再升高的趨勢,且都在N2水平下達到最低值。慢生根瘤菌屬的相對豐度值隨著氮肥的減施總體升高,在N0水平下達到最高值。地桿菌屬、三離藻屬的相對豐度值隨氮肥的減施表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢。

    在單、間作花生根際土壤中變形菌門未分類屬(unclassified_p_Proteobacteria)、厭氧黏細菌屬的相對豐度值隨著氮肥的減施其變化規(guī)律基本一致。氮肥減施對單作花生根際土壤中慢生根瘤菌屬的相對豐度值影響不大,但其能提高間作花生根際土壤慢生根瘤菌屬的相對豐度值。

    2.4 不同土壤樣品固氮微生物的Venn圖分析

    由圖4可知,在單作花生根際土壤中,單作花生N3、單作花生N2、單作花生N1和單作花生N0處理的總操作分類單元(OTU)數(shù)分別為839、767、961、911個,其共同包含的OTU有519個。單作花生N3特有的OTU數(shù)為32個,單作花生N2特有的OTU數(shù)為25個,單作花生N1特有的OTU數(shù)為61個和單作花生N0特有的OTU數(shù)為33個。從結果可以看出,不同施氮水平下的單作花生根際土壤所含的OTU數(shù)單作花生N1和單作花生N0分別大于單作花生N3和單作花生N2,說明單作花生氮肥減施可以提高其根際土壤中的固氮微生物類群數(shù)量。

    在氮肥減施的間作花生根際土壤中,其共同包含的OTU有447個,間作花生N3、間作花生N2、間作花生N1和間作花生N0處理OTU數(shù)分別為902、857、891和738個。間作花生N3特有的OTU數(shù)為47個,間作花生N2特有的OTU數(shù)為31個,間作花生N1特有的OTU數(shù)為31個和間作花生N0特有的OTU數(shù)為37個。由此可以得出,不同施氮水平的間作花生根際土壤所含的OTU數(shù)間作花生N3和間作花生N2分別大于間作花生N1和間作花生N0,說明間作花生氮肥減施使其根際土壤中的固氮微生物類群數(shù)量減少。

    2.5 不同土壤樣品固氮微生物的群落結構的相似性分析

    采用主坐標分析方法對8個不同處理組的花生根際土壤固氮微生物在屬分類水平上進行分析,評估固氮微生物群落間的差異。從圖5可以看出,主成分1(PC1)和主成分2(PC2)對固氮微生物群落結構變異的解釋量分別為70.70%和12.03%;單作花生根際土壤樣品間的點距離比較近,說明它們的固氮微生物群落結構比較相似;而間作花生的根際土壤樣品點比較分散,樣品間距離較遠,說明其根際土壤間的固氮微生物群落的構成差異較大。

    3 結論與討論

    土壤固氮微生物是農田生態(tài)系統(tǒng)中參與土壤氮素循環(huán)利用的重要功能菌群,其群落結構的多樣性對農田土壤微生態(tài)氮素的固持和循環(huán)利用具有重要的意義[9]。大量研究表明,農田長期施用氮肥會使得土壤固氮微生物的競爭力下降,從而導致其群落結構、組成和多樣性的改變[10-12]。鄭棉海等研究得出,土壤氮素含量變化會對固氮微生物與其他土壤微生物的競爭關系產生影響,同時也指出,在氮素缺乏的土壤中固氮微生物更具有競爭優(yōu)勢[13]。本研究表明,減施氮肥能提高單作花生根際土壤的固氮微生物多樣性和豐度,提高其根際土壤固氮微生物類群數(shù)量,有利于固氮微生物的生長,這與周晶的研究結論相似:土壤施加氮肥會使固氮微生物的數(shù)量顯著降低,并且氮肥水平越高,固氮微生物的數(shù)量越低[14]。而間作花生根際土壤固氮微生物的多樣性和豐度則隨著氮肥減施量的增加呈降低趨勢,使根際土壤固氮微生物類群數(shù)量減少。導致單、間作花生根際土壤固氮微生物多樣性和豐度隨氮肥減施產生相反變化趨勢的原因可能是,間作栽培體系比單作需要更多的氮肥來保證作物正常生長,而氮肥減施會減少土壤固氮微生物生長所需的營養(yǎng),不利于微生物繁殖,同時間作栽培體系也改變了間作花生根際的土壤微生態(tài)環(huán)境,使得間作花生根際土壤溫度、濕度等環(huán)境因子以及固氮微生物可以利用的碳氮營養(yǎng)、礦質元素發(fā)生了變化。

    在本研究中,氮肥減施對單、間作花生根際土壤中的固氮微生物群落結構組成及多樣性的影響并不完全一致。隨著氮肥的減施兩者中的變形菌門未分類屬(unclassified_p_Proteobacteria)、厭氧黏細菌屬的固氮微生物相對豐度值變化規(guī)律基本一致。氮肥減施對單作花生根際土壤中慢生根瘤菌屬的相對豐度值影響不大,但其能提高間作花生根際土壤慢生根瘤菌屬的相對豐度值。與單作花生根際土壤相比,間作花生根際土壤的地桿菌屬(Geobacter)、三離藻屬(Trichormus)、慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium )的平均相對豐度分別提高了7.1%、2.9%、1.9%,變形菌門未分類屬(unclassified_p_Proteobacteria)、α-變形菌綱未分類屬(unclassified_c_Alphaproteobacteria)、根瘤菌目未分類屬(unclassified_o_Rhizobiales)的平均相對豐度分別降低了 5.1%、3.3%、2.3%。

    氮肥減施有利于單作花生根際土壤固氮微生物的生長,能夠提高固氮微生物相對土壤中其他微生物的競爭優(yōu)勢,同時可提高了固氮微生物的多樣性和豐度。而氮肥減施不利于間作花生根際土壤固氮微生物的生長繁殖,降低了間作花生根際土壤固氮微生物的多樣性和豐度。

    參考文獻:

    [1]Zou Y K,Zhang J N,Yang D L,et al. Effects of different land use patterns on nifH genetic diversity of soil nitrogen-fixing microbial communities in Leymus Chinensis steppe[J]. Acta Ecologica Sinica,2011,31(3):150-156.

    [2]馮曉敏,楊 永,任長忠,等. 燕麥/大豆和燕麥/花生間作對根際土壤固氮細菌多樣性與群落結構的影響[J]. 中國農業(yè)大學學報,2016,21(1):22-32.

    [3]彭東海,楊建波,李 健,等. 間作大豆對甘蔗根際土壤細菌及固氮菌多樣性的影響[J]. 植物生態(tài)學報,2014,38(9):959-969.

    [4]楊亞東,馮曉敏,胡躍高,等. 豆科作物間作燕麥對土壤固氮微生物豐度和群落結構的影響[J]. 應用生態(tài)學報,2017,28(3):957-965.

    [5]Zhu Y Y,Chen H R,F(xiàn)an J H,et al.Genetic diversity and disease control in rice[J]. Nature,2000,406:718-722.

    [6]Young J P W,Stacy G,Burris R H,et al.Biological nitrogen fixation phylogenic classification of nitrogen-fixing organisms[M]. New York:Chapman and Hall,1992:43-86.

    [7]Raymond J,Siefert J L,Staples C R,et al.The natural history of nitrogen fixation[J]. Molecular Biology and Evolution,2004,21(3):541-554.

    [8]Zehr J P,Jenkins B D,Short S M,et al . Nitrogenase gene diversity and microbial community structure:a cross-system comparison[J]. Environmental Microbiology,2003,5(7):539-554.

    [9]Dixon R,Kahn D.Genetic regulation of biological nitrogen fixation[J]. Nature Reviews Microbiology,2004(2):621-631.

    [10]Orr C H,James A,Leifert C,et al.Diversity and activity of free-living nitrogen-fixing bacteria and total bacteria in organic and conventionally managed soils[J]. Applied and Environmental Microbiology,2011,77(3):911-919.

    [11]Mirza B S,Potisap C,Nüsslein K,et al.Response of free-living nitrogen-fixing microorganisms to land use change in the Amazon rainforest[J]. Applied and Environmental Microbiology,2014,80(1):281-288.

    [12]Wang J C,Zhang D,Zhang L,et al.Temporal variation of diazotrophic community abundance and structure in surface and subsoil under four fertilization regimes during a wheat growing season[J]. Agriculture Ecosystems & Environment,2016,216:116-124.

    [13]鄭棉海,陳 浩,朱曉敏,等. 礦質養(yǎng)分輸入對森林生物固氮的影響[J]. 生態(tài)學報,2015,35(24):7941-7954.

    [14]周 晶. 長期施氮對東北黑土微生物及主要氮循環(huán)菌群的影響[D]. 北京:中國農業(yè)大學,2017:85-108.

    猜你喜歡
    多樣性
    淺議單元導語教學策略
    試論初中體育教學方法多樣性研究
    未來英才(2016年20期)2017-01-03 09:55:11
    論遵循社會規(guī)律與堅持包容性發(fā)展的內在邏輯
    理論導刊(2016年12期)2016-12-27 17:37:25
    淺談小學數(shù)學作業(yè)設計的有效性
    甘肅教育(2016年22期)2016-12-20 22:15:31
    淺析阿拉伯語初級階段聽力教學材料的選擇
    利用網(wǎng)絡教學多樣性 開展有效教學
    求知導刊(2016年30期)2016-12-03 10:48:27
    由古典戲曲看“代言體”在中國的前世今生
    戲劇之家(2016年22期)2016-11-30 15:13:39
    淺談新時期群文輔導工作的特征
    新時期群文輔導工作的特征
    海洋微生物次生代謝的生物合成機制
    科技資訊(2016年19期)2016-11-15 10:39:12
    美女国产视频在线观看| 成人特级av手机在线观看| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 久久久久久人妻| 亚洲丝袜综合中文字幕| 中文资源天堂在线| 久久鲁丝午夜福利片| 不卡视频在线观看欧美| 久久精品国产亚洲av涩爱| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 多毛熟女@视频| 精品久久久久久久久av| 青春草亚洲视频在线观看| 国产高潮美女av| 超碰97精品在线观看| 简卡轻食公司| 日本一二三区视频观看| 卡戴珊不雅视频在线播放| 精品久久久精品久久久| 大香蕉97超碰在线| 热99国产精品久久久久久7| 啦啦啦啦在线视频资源| 午夜视频国产福利| 三级国产精品欧美在线观看| 搡女人真爽免费视频火全软件| 久久久久久久精品精品| 亚洲精品中文字幕在线视频 | 极品少妇高潮喷水抽搐| av.在线天堂| 3wmmmm亚洲av在线观看| 免费观看性生交大片5| 啦啦啦啦在线视频资源| 99re6热这里在线精品视频| 国产亚洲5aaaaa淫片| 亚洲国产欧美在线一区| 99久久精品国产国产毛片| av黄色大香蕉| 天堂中文最新版在线下载| 亚洲精品乱久久久久久| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 少妇的逼水好多| 永久免费av网站大全| xxx大片免费视频| 中文字幕精品免费在线观看视频 | 免费黄频网站在线观看国产| 国产久久久一区二区三区| 97在线人人人人妻| 黄色欧美视频在线观看| 日本欧美视频一区| 精品人妻熟女av久视频| 国产片特级美女逼逼视频| 欧美xxxx性猛交bbbb| 五月天丁香电影| 国产精品久久久久成人av| 最近中文字幕高清免费大全6| 久久韩国三级中文字幕| 晚上一个人看的免费电影| 欧美+日韩+精品| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 国产高清国产精品国产三级 | 哪个播放器可以免费观看大片| 久久综合国产亚洲精品| 亚洲av不卡在线观看| 亚洲无线观看免费| 26uuu在线亚洲综合色| 久久久久精品久久久久真实原创| 久久 成人 亚洲| 香蕉精品网在线| 麻豆成人av视频| 国产精品偷伦视频观看了| 欧美一区二区亚洲| 国产一级毛片在线| 欧美+日韩+精品| 亚洲天堂av无毛| 国产黄片视频在线免费观看| 亚洲美女搞黄在线观看| 亚洲第一区二区三区不卡| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 国产在视频线精品| 欧美97在线视频| 制服丝袜香蕉在线| 国产高清国产精品国产三级 | 亚洲国产精品专区欧美| 老司机影院成人| 美女中出高潮动态图| 国产高潮美女av| 国产精品欧美亚洲77777| 国产人妻一区二区三区在| 联通29元200g的流量卡| 网址你懂的国产日韩在线| 久久亚洲国产成人精品v| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 激情 狠狠 欧美| 成人漫画全彩无遮挡| 国产免费一区二区三区四区乱码| 2021少妇久久久久久久久久久| 久久久久国产精品人妻一区二区| 啦啦啦啦在线视频资源| 国产大屁股一区二区在线视频| 另类亚洲欧美激情| 欧美激情国产日韩精品一区| 精品国产一区二区三区久久久樱花 | 国产av码专区亚洲av| 国产成人91sexporn| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 午夜福利在线观看免费完整高清在| av又黄又爽大尺度在线免费看| 女性被躁到高潮视频| 成年女人在线观看亚洲视频| 黄片无遮挡物在线观看| 欧美日韩国产mv在线观看视频 | 国产精品一区二区在线不卡| 国产69精品久久久久777片| 亚洲在久久综合| 亚洲美女视频黄频| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 男人添女人高潮全过程视频| 亚洲美女黄色视频免费看| av在线播放精品| 亚洲美女搞黄在线观看| 欧美精品一区二区大全| 一级毛片电影观看| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 色网站视频免费| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91 | 精品视频人人做人人爽| 亚洲av中文av极速乱| 久久综合国产亚洲精品| 最近最新中文字幕大全电影3| 亚洲第一区二区三区不卡| 亚洲欧洲日产国产| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 国产高清不卡午夜福利| 欧美国产精品一级二级三级 | 在线精品无人区一区二区三 | 一级毛片aaaaaa免费看小| 亚洲精品亚洲一区二区| 卡戴珊不雅视频在线播放| 免费黄频网站在线观看国产| 中文欧美无线码| 91精品国产国语对白视频| 亚洲精品一区蜜桃| 亚洲精品视频女| 青青草视频在线视频观看| 亚洲av不卡在线观看| 国产有黄有色有爽视频| 久久影院123| 国产v大片淫在线免费观看| 亚洲经典国产精华液单| 国产精品免费大片| 晚上一个人看的免费电影| 99视频精品全部免费 在线| 午夜激情久久久久久久| 国产69精品久久久久777片| 女性生殖器流出的白浆| a级毛片免费高清观看在线播放| 国产一级毛片在线| 欧美xxⅹ黑人| 99九九线精品视频在线观看视频| 中文在线观看免费www的网站| av网站免费在线观看视频| 久久综合国产亚洲精品| 国产成人a区在线观看| 亚洲一区二区三区欧美精品| 精品久久久久久久末码| 97超碰精品成人国产| 男女下面进入的视频免费午夜| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 精品一品国产午夜福利视频| 男女下面进入的视频免费午夜| 大香蕉97超碰在线| 久久av网站| www.色视频.com| 精品一区二区三区视频在线| 国产在线免费精品| 欧美国产精品一级二级三级 | 色综合色国产| 九色成人免费人妻av| 99热这里只有是精品在线观看| 五月开心婷婷网| 免费少妇av软件| 在线天堂最新版资源| 亚洲内射少妇av| 秋霞在线观看毛片| 国产精品一区二区在线观看99| 日韩三级伦理在线观看| 国产精品熟女久久久久浪| 国产精品久久久久久精品古装| 2018国产大陆天天弄谢| 国产精品国产av在线观看| 九草在线视频观看| 国产精品一区二区性色av| 亚洲成人中文字幕在线播放| 精品午夜福利在线看| 性色avwww在线观看| 精品亚洲成国产av| 欧美日韩综合久久久久久| 18+在线观看网站| 亚洲三级黄色毛片| 国产欧美亚洲国产| 日韩一本色道免费dvd| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 日韩强制内射视频| 嫩草影院新地址| 久久国内精品自在自线图片| 久久久久国产精品人妻一区二区| 99热这里只有是精品50| 国产成人精品福利久久| 哪个播放器可以免费观看大片| 久久久久人妻精品一区果冻| 女性被躁到高潮视频| 国产久久久一区二区三区| 国产精品久久久久久久电影| 国产精品三级大全| 国产深夜福利视频在线观看| 22中文网久久字幕| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 午夜视频国产福利| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 国产中年淑女户外野战色| 欧美变态另类bdsm刘玥| 观看免费一级毛片| 亚洲成人一二三区av| 国产在线一区二区三区精| 久久鲁丝午夜福利片| 日韩av不卡免费在线播放| 国产乱人视频| 91久久精品国产一区二区三区| 狂野欧美激情性bbbbbb| 夜夜爽夜夜爽视频| 亚洲中文av在线| 久久精品国产自在天天线| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 国产欧美日韩一区二区三区在线 | 噜噜噜噜噜久久久久久91| 日本黄色片子视频| 亚洲最大成人中文| 成人国产麻豆网| 婷婷色综合www| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 观看免费一级毛片| 日韩一本色道免费dvd| 国产男人的电影天堂91| 在现免费观看毛片| 熟女av电影| 久久精品国产自在天天线| 国产精品一区二区在线不卡| av女优亚洲男人天堂| 久久精品国产亚洲av天美| 女性生殖器流出的白浆| 在线观看一区二区三区| a级毛片免费高清观看在线播放| 国产乱来视频区| 老女人水多毛片| 成人亚洲欧美一区二区av| 日韩精品有码人妻一区| 卡戴珊不雅视频在线播放| 热re99久久精品国产66热6| 青春草视频在线免费观看| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 国产日韩欧美在线精品| 国产精品一区二区在线观看99| 中国三级夫妇交换| 一级毛片我不卡| 国产色婷婷99| 永久网站在线| 中国国产av一级| 中文在线观看免费www的网站| 91久久精品电影网| 少妇的逼好多水| 亚洲国产色片| 国产在线一区二区三区精| 高清午夜精品一区二区三区| 久久久久久久久大av| 国产精品久久久久成人av| 黄色欧美视频在线观看| 男的添女的下面高潮视频| 一级毛片电影观看| 午夜激情福利司机影院| 欧美高清成人免费视频www| 2022亚洲国产成人精品| 成人漫画全彩无遮挡| 青春草国产在线视频| 亚洲,欧美,日韩| 亚洲欧美精品专区久久| av国产精品久久久久影院| 亚洲av在线观看美女高潮| 免费av不卡在线播放| 国产精品av视频在线免费观看| videossex国产| 午夜免费观看性视频| 亚洲美女黄色视频免费看| 99久久精品国产国产毛片| 国产伦精品一区二区三区四那| 精品国产三级普通话版| 亚洲欧美清纯卡通| 国产又色又爽无遮挡免| 深夜a级毛片| 日日摸夜夜添夜夜爱| 高清毛片免费看| 亚洲第一区二区三区不卡| 日韩大片免费观看网站| 高清欧美精品videossex| 在线观看免费视频网站a站| 日韩一本色道免费dvd| 九色成人免费人妻av| 久久久久国产精品人妻一区二区| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 国产高潮美女av| 亚洲天堂av无毛| 久久久精品94久久精品| 免费黄色在线免费观看| 女人久久www免费人成看片| 国产精品无大码| 久久综合国产亚洲精品| 成人二区视频| 看十八女毛片水多多多| 2022亚洲国产成人精品| 午夜免费鲁丝| 熟妇人妻不卡中文字幕| 欧美区成人在线视频| 精品国产乱码久久久久久小说| 国产精品三级大全| 日韩免费高清中文字幕av| 亚洲美女搞黄在线观看| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 视频区图区小说| 99久国产av精品国产电影| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 国产黄片美女视频| 日韩不卡一区二区三区视频在线| av国产精品久久久久影院| 在线 av 中文字幕| 联通29元200g的流量卡| 免费观看av网站的网址| 黑人猛操日本美女一级片| 婷婷色av中文字幕| 久久精品国产亚洲av涩爱| 男人舔奶头视频| 777米奇影视久久| 精品一区二区三区视频在线| 黄色欧美视频在线观看| av在线蜜桃| 国产亚洲91精品色在线| 欧美xxxx性猛交bbbb| 99国产精品免费福利视频| 五月伊人婷婷丁香| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 成人毛片a级毛片在线播放| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 免费观看在线日韩| 午夜福利在线在线| 国产免费一区二区三区四区乱码| 99久久精品一区二区三区| 国产精品偷伦视频观看了| 在线观看免费高清a一片| 精品亚洲成国产av| 亚洲精品aⅴ在线观看| 久久久久人妻精品一区果冻| 精品亚洲成国产av| 成人亚洲欧美一区二区av| 日韩av免费高清视频| 亚洲精品第二区| 日韩,欧美,国产一区二区三区| av又黄又爽大尺度在线免费看| 国产乱来视频区| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 久久国产精品男人的天堂亚洲 | 各种免费的搞黄视频| 免费黄色在线免费观看| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 亚洲av男天堂| 五月天丁香电影| 久久av网站| 爱豆传媒免费全集在线观看| 免费黄色在线免费观看| 国产毛片在线视频| 男女下面进入的视频免费午夜| 美女内射精品一级片tv| 老女人水多毛片| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 国产高清有码在线观看视频| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 黑丝袜美女国产一区| 97在线视频观看| 亚洲图色成人| 免费高清在线观看视频在线观看| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 成人综合一区亚洲| 精品久久久久久久久亚洲| 在线 av 中文字幕| 女性生殖器流出的白浆| 成人影院久久| 亚洲av在线观看美女高潮| 这个男人来自地球电影免费观看 | 亚洲伊人久久精品综合| 一区二区三区四区激情视频| 老女人水多毛片| 亚洲精品自拍成人| 免费观看性生交大片5| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 男的添女的下面高潮视频| 男男h啪啪无遮挡| 少妇的逼水好多| 久久久成人免费电影| 一级黄片播放器| 永久免费av网站大全| 亚洲高清免费不卡视频| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 五月天丁香电影| 在线观看av片永久免费下载| 干丝袜人妻中文字幕| 最黄视频免费看| 亚洲av在线观看美女高潮| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 国产日韩欧美在线精品| 麻豆国产97在线/欧美| 国产又色又爽无遮挡免| 日本爱情动作片www.在线观看| 女人久久www免费人成看片| 欧美成人一区二区免费高清观看| 成年美女黄网站色视频大全免费 | 91久久精品电影网| 国产精品一区二区在线不卡| 久久人人爽av亚洲精品天堂 | 毛片女人毛片| 亚洲精品一区蜜桃| .国产精品久久| 在线观看国产h片| 亚洲人成网站在线观看播放| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91 | 国产乱人偷精品视频| 男女下面进入的视频免费午夜| 国产精品一二三区在线看| 高清黄色对白视频在线免费看 | 在现免费观看毛片| 免费av不卡在线播放| 在线观看美女被高潮喷水网站| 久久精品国产亚洲av天美| 在线看a的网站| 一级片'在线观看视频| 纯流量卡能插随身wifi吗| 2022亚洲国产成人精品| 久久国内精品自在自线图片| 中文资源天堂在线| 大码成人一级视频| 纯流量卡能插随身wifi吗| 2022亚洲国产成人精品| 亚洲精品日本国产第一区| 成人亚洲欧美一区二区av| 亚洲色图综合在线观看| 国产精品人妻久久久久久| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 免费少妇av软件| 日日撸夜夜添| 亚洲图色成人| 亚洲欧洲国产日韩| 久热久热在线精品观看| 黄片无遮挡物在线观看| 国产爽快片一区二区三区| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 秋霞伦理黄片| 视频中文字幕在线观看| 国产男女超爽视频在线观看| a 毛片基地| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 在线亚洲精品国产二区图片欧美 | 在线天堂最新版资源| a 毛片基地| 黄片无遮挡物在线观看| av在线app专区| 日韩中文字幕视频在线看片 | 亚洲熟女精品中文字幕| 亚洲av成人精品一二三区| 少妇熟女欧美另类| 成人毛片60女人毛片免费| 美女内射精品一级片tv| 免费大片黄手机在线观看| 综合色丁香网| 国产成人一区二区在线| 青春草亚洲视频在线观看| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 国产亚洲欧美精品永久| 国产色爽女视频免费观看| 久久久久久久久大av| 新久久久久国产一级毛片| 久久久久久伊人网av| 高清在线视频一区二区三区| 日韩av免费高清视频| 99re6热这里在线精品视频| 丰满少妇做爰视频| 午夜日本视频在线| 久热久热在线精品观看| 亚洲自偷自拍三级| 国产免费又黄又爽又色| 最近最新中文字幕免费大全7| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 美女主播在线视频| 天堂俺去俺来也www色官网| 一区二区三区精品91| 人妻系列 视频| 国产高潮美女av| 久久久色成人| 制服丝袜香蕉在线| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 免费观看在线日韩| 老司机影院成人| 欧美人与善性xxx| 国产黄频视频在线观看| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 国产乱人视频| 啦啦啦啦在线视频资源| 看非洲黑人一级黄片| 午夜激情福利司机影院| av在线蜜桃| 51国产日韩欧美| 国产精品福利在线免费观看| 99热这里只有是精品在线观看| 欧美日韩视频精品一区| 亚洲精品中文字幕在线视频 | 美女cb高潮喷水在线观看| 成年女人在线观看亚洲视频| 夫妻午夜视频| 精品视频人人做人人爽| 精品久久久久久久久av| 国产在线男女| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图 | 青青草视频在线视频观看| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 久久久久久久精品精品| 色网站视频免费| 国产精品久久久久久精品电影小说 | 婷婷色综合大香蕉| 人妻少妇偷人精品九色| 国产黄频视频在线观看| 九九爱精品视频在线观看| 国产 一区精品| 久久久久久久大尺度免费视频| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 国产亚洲一区二区精品| 观看av在线不卡| 内地一区二区视频在线| 色婷婷av一区二区三区视频| 国产乱来视频区| 97在线人人人人妻| 亚洲精品乱久久久久久| 久热这里只有精品99| 久久综合国产亚洲精品| 久久久久国产网址| 丰满少妇做爰视频| 制服丝袜香蕉在线| 国产中年淑女户外野战色| 免费观看a级毛片全部| 直男gayav资源| 五月玫瑰六月丁香| 久久这里有精品视频免费| 国产精品精品国产色婷婷| 国产成人精品福利久久| av国产久精品久网站免费入址| 亚洲欧美精品自产自拍| 久久精品夜色国产| 街头女战士在线观看网站| 嘟嘟电影网在线观看| 91aial.com中文字幕在线观看| 久久久久久人妻| 久久久久视频综合| 午夜视频国产福利| 国产精品女同一区二区软件| 看十八女毛片水多多多| 2021少妇久久久久久久久久久| av在线蜜桃| 51国产日韩欧美| 只有这里有精品99| 亚洲精品第二区| 精品久久久久久久久亚洲| 午夜精品国产一区二区电影| 七月丁香在线播放| 日韩视频在线欧美| 国产精品一区二区在线不卡| 久久久久国产网址| 一区二区三区乱码不卡18| 国产高潮美女av| 久久精品久久久久久久性| 99热国产这里只有精品6| 一个人免费看片子| 免费av中文字幕在线| 日韩国内少妇激情av| 一区二区三区免费毛片| 日本黄大片高清| 欧美成人精品欧美一级黄| 黑人猛操日本美女一级片| 91久久精品电影网| 欧美高清性xxxxhd video| 国产精品爽爽va在线观看网站| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 美女视频免费永久观看网站| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 国产高清不卡午夜福利| 妹子高潮喷水视频| 大片电影免费在线观看免费| 亚洲av二区三区四区| 成年免费大片在线观看| 国产成人精品婷婷| .国产精品久久| 妹子高潮喷水视频| 亚洲欧洲日产国产| 国产有黄有色有爽视频| 国产精品蜜桃在线观看| 91久久精品国产一区二区三区| 日本-黄色视频高清免费观看| 99热这里只有精品一区| 久久影院123| 日本黄大片高清|