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    卷葉貝母異戊烯基焦磷酸異構(gòu)酶基因(IDI)的克隆與分析

    2019-11-02 13:16:49楊千葉黃可佳張陽李銳
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2019年16期
    關(guān)鍵詞:基因表達(dá)生物信息學(xué)克隆

    楊千葉 黃可佳 張陽 李銳

    摘要:旨在克隆卷葉貝母(Fritillaria cirrhosa D. Don)生物堿合成過程中的關(guān)鍵酶——異戊二烯焦磷酸異構(gòu)酶(isopentenyl diphosphate isomerase,簡(jiǎn)稱IDI),并運(yùn)用生物信息學(xué)和熒光定量方法對(duì)其功能進(jìn)行分析,為卷葉貝母甾類生物堿合成途徑及其調(diào)控機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)。以卷葉貝母再生鱗莖為試驗(yàn)材料,基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果,通過PCR技術(shù)克隆川貝母IDI基因(FcIDI)的開放閱讀框(open reading frame,簡(jiǎn)稱ORF)序列,運(yùn)用生物信息學(xué)方法對(duì)該基因進(jìn)行分析,預(yù)測(cè)其編碼蛋白的結(jié)構(gòu)與功能,并通過熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)FcIDI基因在卷葉貝母根、莖、葉、野生鱗莖、再生鱗莖及愈傷組織中的表達(dá)情況。結(jié)果表明,F(xiàn)cIDI的ORF片段為885 bp,編碼294個(gè)氨基酸,與大豆(Glycine max)、杜仲(Eucommia ulmoides)、番薯(Ipomoea)、廣藿香(Pogostemon cablin)等植物IDI蛋白的相似性達(dá)85%以上;FcIDI蛋白的二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果表明,α-螺旋及不規(guī)則卷曲是其整體蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的主要組成結(jié)構(gòu)元件;qRT-PCR試驗(yàn)結(jié)果表明,F(xiàn)cIDI在野生鱗莖中的表達(dá)量遠(yuǎn)高于根、莖、葉等其他植物組織,再生鱗莖的IDI表達(dá)量高于野生鱗莖,在愈傷組織中的表達(dá)量最高。生物信息學(xué)分析和不同植物組織部位及組培誘導(dǎo)物的IDI相對(duì)表達(dá)量差異結(jié)果顯示,F(xiàn)cIDI是1個(gè)生物堿合成途徑中的關(guān)鍵蛋白質(zhì),并受激素組合誘導(dǎo)表達(dá),研究結(jié)果為提高卷葉貝母中的生物堿含量及深入研究植物IDI的功能奠定了理論基礎(chǔ)。

    關(guān)鍵詞:卷葉貝母;異戊二烯焦磷酸異構(gòu)酶;克隆;生物信息學(xué);基因表達(dá)

    中圖分類號(hào): Q943.2 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A

    文章編號(hào):1002-1302(2019)16-0067-04

    收稿日期:2018-04-27

    基金項(xiàng)目:四川省教育廳自然科學(xué)重點(diǎn)項(xiàng)目(編號(hào):17ZA0078);成都大學(xué)2017年校青年基金(編號(hào):2017XJZ04)。

    作者簡(jiǎn)介:楊千葉(1994—),女,河南沈丘人,碩士,主要從事藥用植物生物化學(xué)與分子生物學(xué)方面的研究。

    通信作者:李 銳,博士,講師,主要從事藥用植物生物化學(xué)與分子生物學(xué)方面的研究。

    卷葉貝母(Fritillaria cirrhosa D. Don)又稱川貝母,為百合科多年生草本植物,是一種主產(chǎn)于四川的高原瀕危藥材。干燥鱗莖作為其主要藥用部位,含有生物堿、有機(jī)酸、皂苷、氨基酸等13種化學(xué)物質(zhì)[1]。在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)上,卷葉貝母主要用于治療肺熱燥咳、痰多胸悶、咯痰帶血等癥[2]。近期研究表明,川貝母的干燥鱗莖富含川貝堿、西貝堿、貝母素乙和貝母素甲等甾類生物堿[3],此外還具有十分廣泛的生物學(xué)活性,如降壓、抗菌、消炎、抗腫瘤等[4-7]。目前,卷葉貝母的市場(chǎng)需求量大但產(chǎn)量低,供需矛盾日益突出,并且其野生資源遭受大肆采挖[8]。面對(duì)卷葉貝母資源日益匱乏的現(xiàn)狀,要從根本上解決卷葉貝母資源問題,就要對(duì)其藥效成分的生物合成機(jī)制進(jìn)行研究,以便運(yùn)用基因工程手段進(jìn)行分子育種,進(jìn)而提高藥效成分含量。

    甾類生物堿的生物合成很復(fù)雜,許多研究表明,其生物合成途徑與三萜類化合物相似,目前植物萜類合成的上游途徑已基本明確,異戊烯基焦磷酸(IPP)是所有萜類化合物合成的中心前體,在植物中有2條合成途徑,即2-甲基-D-赤鮮糖醇-4-磷酸(MEP)途徑和甲羥戊酸(MVA)途徑[9],在這2種途徑中均存在異戊二烯焦磷酸異構(gòu)酶(IDI)催化異戊烯焦磷酸(IPP)異構(gòu)化形成二甲丙烯焦磷酸(DMADP)的過程。IDI作為萜類生物合成過程中的一個(gè)重要調(diào)節(jié)因子,其過量表達(dá)有利于促進(jìn)下游產(chǎn)物的生物合成[10]。研究表明,在大腸桿菌中過表達(dá)番茄SlIDI基因、酵母ScIDI基因、靈芝GlIDI基因和喜樹CaIDI基因,均能導(dǎo)致類胡蘿卜素的生物合成和累積[11-14]。在杜仲中,過表達(dá)EuIDI基因能增加反式聚異戊二烯的生物合成[15]。目前已有許多植物中的IDI基因被克隆,如喜樹、山榛、柴胡和丹參等[11,16-22]。然而迄今,關(guān)于卷葉貝母異戊烯基焦磷酸異構(gòu)酶基因(FcIDI)的克隆卻鮮有報(bào)道。

    為了探究卷葉貝母IDI基因是否參與萜類合成、甾類生物堿合成等代謝過程,為甾類、三萜類化合物代謝途徑提供優(yōu)質(zhì)基因資源,本研究基于筆者前期研究得到的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)克隆卷葉貝母的IDI基因,并對(duì)其進(jìn)行序列分析和組織特異性表達(dá)分析,以期為闡明卷葉貝母的甾類生物堿合成途徑及其調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    卷葉貝母野生材料來自四川省康定折多山川貝母野生撫育基地,愈傷組織、再生鱗莖由筆者所在實(shí)驗(yàn)室經(jīng)組織培養(yǎng)獲得。基因克隆所用材料為卷葉貝母的再生鱗莖,基因組織特異性表達(dá)分析所用野生材料為3年生卷葉貝母的根、莖、葉,采樣日期為2016年7月12日。

    大腸桿菌菌株,由筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存;總RNA提取試劑盒,購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司;熒光定量試劑盒(SsoFasttm EvaGreen?Sapermix),購(gòu)自BIO-RAD公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Prime-Script RT reagent Kit)、Pfu高保真酶、pMD19-T載體,購(gòu)自TaKaRa公司;引物合成及基因測(cè)序由北京六合華大基因科技有限公司完成。

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1 總RNA的提取與cDNA的合成 使用植物總RNA提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]提取卷葉貝母再生鱗莖總RNA,按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa公司)說明書合成cDNA第1鏈,將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物保存于-80 ℃,用于后續(xù)基因克隆試驗(yàn)。

    1.2.2 FcIDI基因的克隆與生物信息學(xué)分析 根據(jù)筆者所在實(shí)驗(yàn)室得到的卷葉貝母轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)庫,用primer premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)FcIDI基因的特異性引物,并命名為FcIDIF和FcIDIR(表1)。以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板,進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將所得產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離并切膠回收后克隆到pMD19-T載體上,轉(zhuǎn)化大腸桿菌(Escherichia coli)Top10感受態(tài)細(xì)胞。菌落經(jīng)PCR驗(yàn)證后,挑取陽性克隆送至北京六合華大基因科技有限公司進(jìn)行測(cè)序分析,獲得重組質(zhì)粒pMD19-FcIDI。

    將克隆的FcIDI基因編碼區(qū)翻譯成氨基酸序列,用美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information,簡(jiǎn)稱NCBI)網(wǎng)站的BLASTp工具(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進(jìn)行蛋白質(zhì)同源性搜索;用DNAMAN 6.0軟件對(duì)目前已經(jīng)克隆IDI的代表性植物進(jìn)行氨基酸序列同源性比對(duì);用MEGA 5.1軟件構(gòu)建分子進(jìn)化樹;用ExPASy在線服務(wù)器的ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)對(duì)FcIDI蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)進(jìn)行基本理化性質(zhì)分析;分別采用SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)和SWISS-MODE(http://swissmodel.expasy.org/)在線分析軟件對(duì)FcIDI蛋白的二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。

    1.2.3 卷葉貝母IDI基因表達(dá)量分析 分別取3年生卷葉貝母的根、莖、葉、鱗莖以及由筆者所在實(shí)驗(yàn)室通過組織培養(yǎng)獲得的愈傷組織和再生鱗莖,提取總RNA。參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書,合成cDNA第1鏈,以卷葉貝母18S基因(AY616727.1)為內(nèi)參,利用primer primier 5.0軟件設(shè)計(jì) qRT-PCR擴(kuò)增引物,分別命名為qFcIDIF和qFcIDIR,序列見表1;將合成的各樣品cDNA稀釋50倍后作為模板,用SsoFasttm EvaGreen?Sapermix試劑盒進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè),每組樣品設(shè)3個(gè)平行重復(fù),并進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)試驗(yàn)。反應(yīng)在ABI7000熒光定量PCR儀(Applied Biosystems)上進(jìn)行擴(kuò)增,擴(kuò)增曲線、溶解曲線、標(biāo)準(zhǔn)曲線由軟件自動(dòng)生成。所得數(shù)據(jù)用內(nèi)參基因校準(zhǔn)后使用CT(2-ΔΔCT)法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 FcIDI基因的克隆與生物信息學(xué)分析

    以卷葉貝母再生鱗莖cDNA為模板,使用表1的FcIDI基因特異性引物,通過PCR技術(shù)擴(kuò)增得到約900 bp的片段(圖1),經(jīng)測(cè)序鑒定結(jié)合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析得出,F(xiàn)cIDI基因的開放閱讀框(ORF)序列長(zhǎng)885 bp,編碼蛋白含有294個(gè)氨基酸殘基,其基本理化性質(zhì)如下:總原子數(shù)為4 721個(gè),原分子組成為C1 500H2 370N406O435S10,帶負(fù)電的氨基酸有45個(gè)[天冬氨酸(Asp)+谷氨酸(Glu)],帶正電的氨基酸有36個(gè)[精氨酸(Arg)+賴氨酸(Lys)],其理論分子量為33.3 ku,理論等電點(diǎn)(pI值)為 5.61,不穩(wěn)定指數(shù)為37.85,屬于穩(wěn)定蛋白;脂肪指數(shù)為99.83,總平均疏水性(GRAVY)為-0.198,為親水蛋白。將由FcIDI基因推測(cè)的氨基酸序列在NCBI上進(jìn)行BLASTp檢索發(fā)現(xiàn),F(xiàn)cIDI推測(cè)蛋白與大豆(Glycine max)、杜仲(Eucommia ulmoides)、番薯肯尼亞屬(Ipomoea Kenyan)、廣藿香(Pogostemon cablin)等植物IDI蛋白的相似性達(dá)85%以上。

    用DNAMAN 6.0軟件進(jìn)行同源比對(duì),從圖2可以看出,F(xiàn)cIDI蛋白具有植物IDI蛋白的高度保守性。在BLASTp分析的基礎(chǔ)上,根據(jù)8種植物IDI基因的氨基酸序列同源性,使用MEGA 5.1軟件作出系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。由圖3可見,F(xiàn)cIDI與同屬于單子葉的中國(guó)蓮的NnIDI蛋白處于同一進(jìn)化枝,表明二者的親緣關(guān)系較近。

    分別采用SOPMA和SWISS-MODE在線分析軟件對(duì)FcIDI氨基酸序列的二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。圖4結(jié)果表明,F(xiàn)cIDI蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋(H)占45.24%,無規(guī)則卷曲(C)占41.25%,延伸帶(E)占13.27%。表明α-螺旋及不規(guī)則卷曲是其整體蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的主要結(jié)構(gòu)組成元件;此外,β-轉(zhuǎn)角和延伸鏈散布于整個(gè)蛋白質(zhì)中。通過SWISS-MODE進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)的同源建模,找到FcIDI的同源模型PDB:2i6k.1.A,其三維結(jié)構(gòu)通過X射線(X-ray)被測(cè)定出來。經(jīng)過比對(duì),F(xiàn)cIDI和2i6k.1.A的氨基酸序列一致性高達(dá)52.42%。

    2.2 FcIDI基因表達(dá)量的變化分析

    以2016年7月12日采集的卷葉貝母根、莖、葉、鱗莖及由該鱗莖培養(yǎng)誘導(dǎo)的愈傷組織和再生鱗莖為材料,采用熒光定量PCR方法檢測(cè)FcIDI基因在不同組織中的表達(dá)差異水平。如圖5所示,F(xiàn)cIDI基因在所檢測(cè)的組織中均有表達(dá),在愈傷組織中的表達(dá)量最高,達(dá)到根的15.9倍,其次為再生鱗莖中,根中的表達(dá)量最低,葉、莖中的表達(dá)量較高,分別是根的3.3、3.7倍。

    3 討論

    FcIDI基因克隆是以卷葉貝母再生鱗莖為材料、以轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果為基礎(chǔ),通過PCR技術(shù)克隆獲得其ORF序列。經(jīng)生物信息學(xué)結(jié)構(gòu)分析表明,卷葉貝母IDI蛋白與其他植物的IDI蛋白具有較高的同源性,IDI為卷葉貝母生物堿合成途徑中的關(guān)鍵酶,F(xiàn)cIDI的表達(dá)為下游卷葉貝母總生物堿的合成提供了前體物質(zhì),因此FcIDI的研究尤為重要。

    本研究通過檢測(cè)卷葉貝母不同植物組織部位IDI的相對(duì)表達(dá)量,發(fā)現(xiàn)經(jīng)過組織培養(yǎng)技術(shù)獲得的愈傷組織和再生鱗莖中IDI的相對(duì)表達(dá)量較野生貝母各組織的高,進(jìn)一步證實(shí),通過組織培養(yǎng)技術(shù)獲得的貝母愈傷組織和再生鱗莖能夠有效提高其生物堿含量[23-24]。因此,本研究推測(cè),組織培養(yǎng)物中可能存在生物堿高效積累的機(jī)制。

    本研究為卷葉貝母的分子生物學(xué)研究提供了基因資源,并為后續(xù)FcIDI的研究奠定了基礎(chǔ)。筆者所在課題組后續(xù)將對(duì)FcIDI蛋白進(jìn)行純化和酶活性檢測(cè)分析,進(jìn)一步研究FcIDI基因的功能,從而為卷葉貝母甾類生物堿合成途徑的闡明奠定基礎(chǔ)。

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