中短鏈聚羥基脂肪酸酯的低成本生產(chǎn)與應(yīng)用

魏繼華 劉越 李佳益 楊景辰 劉長莉

摘要：聚羥基脂肪酸酯（PHA）是在不平衡生長條件下由微生物產(chǎn)生的聚酯。由于其單體組成及排列方式的多樣性，PHA不僅具有生產(chǎn)生活中常見塑料材料的優(yōu)良物理性能，同時具有良好的生物相容性、生物可降解性、可加工性等優(yōu)良的生物性能，在眾多領(lǐng)域都有良好的應(yīng)用潛能。但與傳統(tǒng)石化塑料相比，PHA的生產(chǎn)成本較高，使其生產(chǎn)和應(yīng)用受到限制。如何降低PHA的生產(chǎn)成本成為當今研究的熱點話題。本文主要綜述了聚羥基脂肪酸酯的多樣性、低成本生產(chǎn)及其應(yīng)用，以期為今后的相關(guān)研究提供一定參考。

關(guān)鍵詞：聚羥基脂肪酸酯;生產(chǎn)成本;PHA產(chǎn)量;PHA的應(yīng)用

中圖分類號：X172 ?文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）16-0039-06

收稿日期：2018-05-02

基金項目：東北林業(yè)大學大學生科研訓練資助項目（編號：201710225107）。

作者簡介：魏繼華（1997—），男，山東濰坊人，主要研究方向為環(huán)境微生物。

通信作者：劉長莉，博士，副教授，主要研究方向為環(huán)境微生物。

近20多年來迅速發(fā)展起來的聚羥基脂肪酸酯（PHA）是一種由微生物合成的胞內(nèi)聚酯，屬于天然的高分子生物材料。由于PHA具有良好的生物相容性、生物可降解性和塑料的熱加工性能，同時可作為可生物降解的包裝材料、組織工程材料、緩釋材料、電學材料以及醫(yī)療材料，因此其低成本生產(chǎn)已經(jīng)成為近年來生物材料領(lǐng)域最為活躍的研究熱點。本文主要介紹PHA的產(chǎn)量與成本問題以及新型PHA材料開發(fā)與利用的研究進展，并對PHA的現(xiàn)存問題進行總結(jié)與展望。

1 聚羥基脂肪酸酯概述

1.1 PHA的結(jié)構(gòu)與種類

PHA的結(jié)構(gòu)通式如圖1所示，它在生物體內(nèi)主要作為碳源和能源的貯藏性物質(zhì)，在這些碳源和能源物質(zhì)過剩，氮、氧、磷、硫等大量元素被耗盡的情況下，PHA可由不同種微生物合成[1-3]。作為一種從微生物中提取的生物聚酯材料，PHA由300余種單體組合而成，是一種全新的生物塑料[4]。根據(jù)單體結(jié)構(gòu)的規(guī)律性，PHA可以分為PHA均聚物（homopolymers）、PHA嵌段共聚物（block copolymers）或PHA隨機共聚物（random copolymers）等。

由于PHA的單體是手性R型羥基脂肪酸，擁有多種側(cè)鏈、碳鏈長度，因此PHA種類繁多。由圖2可見，不同單體之間的聚合方式、排布方式、分子量等因素也可造成PHA的多樣性[5]。Tripathi等發(fā)現(xiàn)，通過預(yù)定比例的脂肪酸可以預(yù)先控制PHA的單體比例（表1），實現(xiàn)無規(guī)共聚物聚羥基丁酸羥基己酸酯（PHBHHx）或由3-羥基丁酸（3HB）和 3- 羥基己酸（3HHx）組成的嵌段共聚物的制備[6-7]。因此，如果單體比例穩(wěn)定，材料將會顯示出穩(wěn)定的性質(zhì)。而PHA的分子量同時受PHA合成酶濃度（或活性）、鏈轉(zhuǎn)移反應(yīng)的進行、PHA合酶的催化活性以及生物合成期間PHA的降解所影響[8]。因此，可以通過控制PHA分子量來調(diào)控聚合物的物理性質(zhì)。例如在生產(chǎn)過程中向培養(yǎng)基中加入鏈轉(zhuǎn)移劑如聚乙二醇（PEG）、甲醇、乙醇以及異丙醇，可以降低PHA的分子量[9-10]。

1.2 PHA的功能特性

PHA由于具有氣體相隔性、壓電性、生物相容性、光學活性等特性[11]，使其在電子科技、航空航天、醫(yī)學藥品、高附加值材料等領(lǐng)域有重要的應(yīng)用價值。與傳統(tǒng)塑料相比，PHA的主要優(yōu)勢在于其生物降解性，傳統(tǒng)塑料的降解需要100年，而用聚-β-羥丁酸（PHB）生產(chǎn)的產(chǎn)品只需要12個月即可分解完全，且釋放出的產(chǎn)物為無污染的水和二氧化碳，而CO2可被植物光合作用吸收、固定為生物質(zhì)能源。由表1可見，部分PHA與聚乙烯等傳統(tǒng)塑料的物化性能有很大不同[12-13]。

2 聚羥基脂肪酸酯的主要研究問題及解決思路

雖然PHA有諸多優(yōu)良特性，但其廣泛應(yīng)用受到高昂生產(chǎn)成本的限制。高成本是由昂貴的碳源、復雜的滅菌步驟、強烈的曝氣操作、碳底物向PHA產(chǎn)物的較低轉(zhuǎn)化率、微生物的緩慢生長、不連續(xù)的發(fā)酵生產(chǎn)過程和昂貴的下游加工成本等高能量需求所導致的[14-15]。因此，如何降低生產(chǎn)成本、開發(fā)廉價的生產(chǎn)工藝是世界各國生物制品領(lǐng)域研究的熱點。以下是針對當前問題所提供的解決思路。

2.1 廉價碳源的選擇

為了降低原料成本，有研究者嘗試采用紙漿、稻稈、山毛櫸殼、活性污泥、食品廢水和工業(yè)廢水來代替精致碳源，且均已有成功的案例。表2展示了利用不同廉價碳源生產(chǎn)PHA的積累率。Povolo等報道，3HB-co-3HV-co-4HB三元共聚物可以直接以乳糖或廢物原料如乳酪、 乳清作為碳源來獲得[16]，可見乳品業(yè)的剩余乳清可以作為碳源合成PHA;Cerrone等發(fā)現(xiàn)，富含甘露醇的青貯草榨汁可作為生產(chǎn)PHA的可再生碳基質(zhì)[17];Ciesielski等認為，可以利用生物燃料的副產(chǎn)品——液相甘油作為原料生產(chǎn)PHA和乳酸，但液相甘油中含有殘余甲醇，可能會對菌株的生長造成影響[18];羅氏真養(yǎng)菌能吸收未過濾的植物油脂廢物以及廢棄的動物油脂，并將其轉(zhuǎn)換成PHA，且產(chǎn)量較高，與以葡萄糖作為碳源得到的產(chǎn)率相近[19];利用活性污泥法生產(chǎn)的PHA在細胞干質(zhì)量（CDW）中的比例達到50%以上[20]，在厭氧-好氧活性污泥工藝中，微生物中儲存的PHA最高可達細胞干質(zhì)量的67%[21]，且該工藝流程不需要進行滅菌操作，從而實現(xiàn)了剩余活性污泥的資源化利用，表3展示了利用不同菌株生產(chǎn)PHB的積累率;另外，微生物還可以以苯系污染物如甲苯為碳源，通過開發(fā)新型的補料系統(tǒng)，實現(xiàn)純菌株的大量穩(wěn)定培養(yǎng)，從而使合成PHA的產(chǎn)能可以達到與使用其他碳源相當?shù)乃絒22]。

2.2 高產(chǎn)菌株的篩選

2.2.1 低成本野生菌

傳統(tǒng)的PHA生產(chǎn)主要通過脂肪酸 β-氧化和脂肪酸從頭合成途徑實現(xiàn)，但這2種途徑各有不足之處，脂肪酸β-氧化途徑以脂肪酸為碳源來合成PHA，但脂肪酸是一種較昂貴的碳源且對微生物細胞有毒害作用，因此利用該途徑大量合成PHA具有很大的限制性;脂肪酸從頭合成途徑雖然是利用碳水化合物為碳源生產(chǎn)PHA，但細胞內(nèi)積累的PHA含量較低?；谏鲜鲈?，需要構(gòu)建一個廉價、高效生產(chǎn)PHA的平臺，而大腸桿菌作為目前合成PHA最常用的底盤菌之一，可以用來構(gòu)建新的合成途徑。Zhuang等在重組大腸桿菌中構(gòu)建了逆向脂肪酸β-氧化循環(huán)中所需酶的過表達質(zhì)粒，試圖直接利用葡萄糖為碳源，通過構(gòu)建逆向脂肪酸β-氧化循環(huán)，合成含有不同單體的中長鏈聚羥基脂肪酸酯（mcl-PHA）共聚物[23]。向單敲除硫酯酶基因菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基中添加30 g/L葡萄糖，發(fā)現(xiàn)敲除硫酯酶基因的菌株合成的mcl-PHA含量最高，約占細胞干質(zhì)量的4.01%[24]。Wu等基于減少發(fā)酵過程中鼓氣能耗的思路，在大腸桿菌中用8個串聯(lián)重復的微氧啟動子來表達PHB合成基因，大大提高了重組大腸桿菌在微氧條件下合成PHB的能力，使PHB積累量達到90%，且有可能在發(fā)酵后期低氧條件下同樣實現(xiàn)高效PHA生產(chǎn)[24]。

Yin等研究發(fā)現(xiàn)，在極端條件下培養(yǎng)的極端微生物對微生物污染更有抵抗力[25]。嗜鹽細菌能夠在高pH值、高鹽濃度的培養(yǎng)基中迅速生長，表明嗜鹽細菌具有高抗污染性，特別是在海水中至少可以生長2個月[26]。因此，采用廉價的農(nóng)業(yè)廢棄物為發(fā)酵材料，結(jié)合極端生存環(huán)境抑制雜菌生長的特性，以及培養(yǎng)基不滅菌、開放式培養(yǎng)的發(fā)酵工藝，可以顯著降低PHA生產(chǎn)過程中的能源動力消耗以及底物、設(shè)備投資，最大程度降低PHA的合成成本[27]。

因此可以將嗜鹽細菌作為底盤菌，通過合成生物學以及代謝工程改造手段，將其應(yīng)用在PHA的合成方面。在用5-氟乳清酸和尿嘧啶作為選擇壓力的前提下，曾有學者將地中海富鹽菌（Haloferax mediterranei）中乳清酸核苷-5-磷酸脫羧酶（pyrF）基因敲除，結(jié)果顯示，該方法可以大大提高基因重組的效率，這種高效的基因敲除技術(shù)可廣泛應(yīng)用于嗜鹽微生物的基因組改造中[28]。

2.2.2 工程菌株的篩選

在產(chǎn)量高、耐高密度發(fā)酵的菌種選育方面，Kahar等篩選的羅氏真養(yǎng)菌（Ralstonia eutro PHAH16）細胞干質(zhì)量可達1.28×105～1.38×105 mg/L，PHB的積累量最高占菌體干質(zhì)量的72%～76%[29]。Lee等研究發(fā)現(xiàn)，Pseudomonas putida在適宜生長條件下，細胞濃度可達?1.73×105 mg/L，降低培養(yǎng)基中的磷濃度后，PHA的積累量可達1.91×103 mg/L[30]。Arora等通過敲除Pseudomonas putida KT2442中的fadA、fadB基因，削弱了β-氧化循環(huán)途徑，增強了該菌株積累3-羥基十二酸單體的能力，在增加產(chǎn)物附加值的同時提高了PHA產(chǎn)量，該工程菌株的PHA產(chǎn)量可達細胞干質(zhì)量的84%，比野生菌株提高5倍左右[31]。

Lv等使用CRISPRi工程細菌合成PHA，通過編輯真核生物基因組來控制PHA生物合成途徑通量和調(diào)整PHA組成[32]。首先，通過葡萄糖生產(chǎn)聚羥基丁酸酯（P3HB4HB）的途徑構(gòu)建大腸桿菌工程菌株。為了重定向碳通量，先把編碼大腸桿菌琥珀酸半醛脫氫酶的天然基因sad用5個特別設(shè)計的單引導RNA置于CRISPRi的控制之下，該體系可形成由 1 mol%～9 mol% 4HB組成的P3HB4HB。另外，使用選擇的單引導RNA如sucC2、sucD2、sdhB2和sdhA1，通過CRISPRi將由琥珀酰-輔酶A（CoA）合成酶和琥珀酸脫氫酶（分別由sucC、sucD、sdhA和sdhB基因編碼）產(chǎn)生的琥珀酸優(yōu)先引導至4HB前體。P3HB4HB中產(chǎn)生的4HB含量可以從1.4 mol%調(diào)整至18.4 mol%，這取決于下調(diào)基因的表達水平。結(jié)果顯示，CRISPRi法是同時操作多種基因并控制大腸桿菌中代謝流量的可行方法[32]。

綜上所述，與純培養(yǎng)微生物相比，菌群發(fā)酵雖可以降低能耗，但菌群中菌種組成不能保持穩(wěn)定，無法保障PHA單體的種類與含量穩(wěn)定，因此菌群不能用于合成均一、穩(wěn)定的高附加值PHA產(chǎn)品。

2.3 發(fā)酵生產(chǎn)工藝的改進

利用現(xiàn)代科學手段，例如合成生物學、基因工程技術(shù)、代謝路徑的修飾、藍水生物技術(shù)等方法，開發(fā)PHA高產(chǎn)菌株已成為研究領(lǐng)域中的主體思路[4]。在合成聚羥基脂肪酸酯的過程中，對發(fā)酵流程進行改造與優(yōu)化，從而控制培養(yǎng)過程中的相關(guān)條件如溫度、pH值、通氣量（碳氮比）、流加速率、培養(yǎng)周期等，可以使細菌的生長繁殖速率與PHA的生成量達到最大值[33-35]。Li等研究發(fā)現(xiàn)，菌體中的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADPH）水平對PHA的產(chǎn)量影響較大，因此可以通過相應(yīng)的輔酶工程手段提高PHA產(chǎn)量[36]。

Shimizu等通過使用批次和半批次培養(yǎng)方式，在營養(yǎng)物富集和化學成分確定的培養(yǎng)基中研究以乙酸、丙酸和丁酸為碳源，利用嗜堿桿菌產(chǎn)堿菌（Alcaligenes eutrophus）生產(chǎn)PHA的過程，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PHA的形成與細胞生長有關(guān)，高濃度（≥50 mg/L）乙酸會同時抑制細胞的生長和PHA的形成，但毒性效應(yīng)隨細胞質(zhì)量的增加而降低，在無毒濃度范圍內(nèi)，細胞生長和PHA形成均與乙酸濃度成線性比例;通過半間歇培養(yǎng)，丁酸濃度被控制在低水平（20～40 mg/L），且PHA形成速率與丁酸濃度成線性比例，表明丁酸在化學成分確定的培養(yǎng)基中沒有毒性作用，在濃度為80～100 mg/L的銨鹽中，丁酸主要用于PHA的形成;在以丙酸為碳源的培養(yǎng)條件下，富營養(yǎng)化生產(chǎn)共聚物聚（羥基丁酸酯-共-羥基戊酸酯），結(jié)果顯示，含量約為40%[37]。劉一平等對好氧瞬時補料工藝合成聚羥基脂肪酸酯的研究中發(fā)現(xiàn)，生產(chǎn)PHA的最適條件為化學需氧量（COD）6 000 mg/L，pH值8.5，運行周期24 h，此時PHA的細胞干質(zhì)量積累率達到最大值，為31.1%[38]。

2.4 與其他化學品的聯(lián)合生產(chǎn)

眾所周知，能夠同時積累多種產(chǎn)品的工程微生物在生產(chǎn)實際中具有強大的經(jīng)濟吸引力。Li等通過采用聯(lián)合生產(chǎn)的方法，在合成PHA的同時生產(chǎn)出了氨基酸、蛋白質(zhì)、醇、氫、生物表面活性劑、胞外多糖等有價值的化學品，通過這個方法可以降低PHA生產(chǎn)成本[39]。除降低成本外，聯(lián)合生產(chǎn)還可以解決部分廢棄物問題，使得細胞和上清液乃至沼氣都有用。以麻風樹生物柴油廢棄物為例，利用“廢物”可生產(chǎn)3-羥基丁酸-co-3-羥基戊酸共聚物（PHBV）和 ε-聚賴氨酸[40]。Kang等證實了PHA和琥珀酸鹽可進行聯(lián)合生產(chǎn)[41]。Li等發(fā)現(xiàn)，用Halomonas sp.TD01進行5-氨基乙酰丙酸（ALA，一種增值光動力抗癌藥物）與PHA的聯(lián)合生產(chǎn)，可以顯著降低2種產(chǎn)品的相關(guān)生產(chǎn)成本[42]。Licciardello等通過研究地中海假單胞菌中藻酸鹽與mcl-PHA的聯(lián)合生產(chǎn)發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)48 h后，細胞干質(zhì)量（CDM）達到2.89 g/L，粗制mcl-PHA累積量為0.52 g/L，更為有利的是在發(fā)酵過程中發(fā)現(xiàn)大量的alg基因被激活，導致藻酸鹽大量合成[43]，藻酸鹽常被作為化妝品原料，且可在食品和醫(yī)療領(lǐng)域中用作穩(wěn)定劑和膠凝劑。綜上所述，在聯(lián)合生產(chǎn)模式下，設(shè)計合理的伴生產(chǎn)品在降低制造成本和提高原材料利用率等方面具有巨大潛力。

3 聚羥基脂肪酸酯的應(yīng)用

3.1 PHA的生物醫(yī)藥化應(yīng)用

PHA具有良好的生物可降解性、生物相容性和可加工性能，可以作為高端生物醫(yī)用材料[44]。其中中等長度PHA（mcl-PHA）因其良好的壓電性、相容性等特性而被成功應(yīng)用，且已被證明在血管組織工程[45]、軟骨組織工程[46]和人造神經(jīng)導管[47]等領(lǐng)域有良好的應(yīng)用前景。Sodian等在小鼠肺部位置中接種使用3-羥基己酸酯和3-羥基辛酸酯的共聚酯[P（3HHx-co-3HO）]為主要材料制成的心臟瓣膜后發(fā)現(xiàn)，其功能持續(xù)性較好，可達120 d，無血栓形成和輕度狹窄[48]，且該共聚酯與其他聚合物混合可以改善PHA心臟瓣膜的性能。在PHA血管組織工程研究的早期，使用了靈活的mcl-PHA，包括聚3-羥基辛酸酯（PHO）和聚-4-羥基丁酸酯（P4HB）。在科技不斷發(fā)展的過程中，常利用P4HB構(gòu)建P4HB/低聚半乳糖醛酸（PGA）組織工程血管貼片。Chen等發(fā)現(xiàn)，寡聚-羥基脂肪酸酯（HA）可以被身體轉(zhuǎn)化成可以加入生物系統(tǒng)的具有代謝功能或調(diào)節(jié)功能的單體[49]。

除此之外，鑒于PHA微球表面易被修飾改造的特性，越來越多的功能蛋白通過與PHA微球表面蛋白（PHAC或PHAP）的融合表達，呈遞在了PHA微球表面，使PHA微球成為一種廉價、高效的蛋白固定技術(shù)[50]。

3.2 PHA的工業(yè)化應(yīng)用

目前工業(yè)化的應(yīng)用主要是可降解塑料，用來解決傳統(tǒng)塑料的白色污染問題，而未被修飾過的原始PHA無法滿足工業(yè)化要求，因此，常常通過改變其物理性能來提高其機械性能。美國Metabolix公司將PHA作為一種新型環(huán)保的增塑劑對聚氯乙烯（PVC）進行了改性，拓展了PHA在塑料添加劑方面的應(yīng)用[51]。Sudesh等研究發(fā)現(xiàn)，PHA具有明顯的吸油效果，可能在化妝品和護膚品領(lǐng)域具有應(yīng)用市場[52]，同時可被用于處理污水，吸附污水中的有機物[53]。

3.3 研發(fā)新型PHA，提高附加值

近年來，新型PHA材料的生產(chǎn)受到相關(guān)研究領(lǐng)域的關(guān)注，部分原因是目前市場上只有PHB和PHBV實現(xiàn)了半商業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)，而通常研究的是PHA、聚羥基丁酸酯和聚羥基丁酸酯-共-羥基戊酸酯（PHB-V），其中PHB-V比PHA具有更堅韌、更不脆弱的優(yōu)點，因此可以通過遺傳修飾和培養(yǎng)條件優(yōu)化等方式，使其發(fā)揮更大的作用。

4 總結(jié)與展望

利用農(nóng)業(yè)原料、工業(yè)副產(chǎn)品、廢水等生產(chǎn)PHA既可以降低PHA生產(chǎn)成本又有利于環(huán)境保護;利用野生和突變菌株的低成本底物研究可以提高PHA生產(chǎn)過程的經(jīng)濟性。

PHA通常由簡單的碳源如糖（葡萄糖或蔗糖等）生產(chǎn)得到。然而，這些原料的高價格成本占PHA總生產(chǎn)成本的50%。因此，在過去幾年中，植物油作為廉價碳源代表已被作為PHA生產(chǎn)的最佳候選者。由于它們在中鏈和長鏈脂肪酸單元中的組成不同，含油底物可以作為不同類型PHA的前體，具有特定的性質(zhì)，導致最終產(chǎn)品有了新的應(yīng)用。植物油因此具有廣闊的發(fā)展空間。而作為植物油中的一種，橄欖油餾出物是橄欖油精煉工業(yè)的低市場價值（0.24～0.39美元/kg）副產(chǎn)品，占總加工油的0.05%～0.10%，主要由游離脂肪酸組成，該副產(chǎn)品對PHA生產(chǎn)的潛力尚未被調(diào)查。因此以橄欖油餾出物為唯一碳源，分別接種已經(jīng)篩選好的食樹脂假單胞菌（Pseudomonas resinovorans）和鉤蟲貪銅菌（Cupriavidus necator）用于mcl-PHA和scl-PHA生產(chǎn)，可獲得較高產(chǎn)量。因此，橄欖油餾出物是PHA生產(chǎn)的最佳候選底物，由于它能夠提供高聚合物產(chǎn)量并允許通過選擇適當?shù)木旰铣刹煌木酆衔铮╯cl-或mcl-PHA），因此是PHA生產(chǎn)的最佳候選底物。

眾所周知，我國是一個人口大國，每年對肉類的消費非常龐大，產(chǎn)生的屠宰場廢棄物或食用副產(chǎn)品、不再可食用的動物產(chǎn)品或食堂垃圾數(shù)量同樣非常可觀。這些廢棄動物脂肪的處理難度較大，極易影響環(huán)境衛(wèi)生，造成健康隱患。選擇以牛脂為基礎(chǔ)的生物柴油作為一種重要的碳源，接種綠針假單胞菌（Pseudomonas chlororaphis），采用連續(xù)補料分批模式合成 mcl-PHA 的體積生產(chǎn)率為138 mg/（L·h）。除此之外，從生物技術(shù)的角度來看，未來生物反應(yīng)器的規(guī)模試驗必須關(guān)注細胞內(nèi)mcl-PHA含量的增加。這可以通過調(diào)節(jié)除氮源之外的其他生長限制因素來完成，如限制性磷酸鹽供應(yīng)等。另外，從敲除基因工程角度來看，可以通過敲除PHA解聚酶基因來防止已經(jīng)積聚的mcl-PHA降解;同時還可以通過增加合酶的基因拷貝數(shù)或引入可提高聚合酶水平的誘導型啟動子來獲得更高的mcl-PHA產(chǎn)量。

作為具有良好生物性能和物化特性的新型材料，PHA具有深遠的開發(fā)潛力，但是高額的生產(chǎn)成本限制了其大規(guī)模應(yīng)用，如何更加有效地降低生產(chǎn)費用是當下亟需完善的問題，經(jīng)過多年的研究，PHA產(chǎn)量已經(jīng)逐步得到提升。隨著研究的不斷深入，PHA將在更多的領(lǐng)域有更好的應(yīng)用前景。

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