枯草芽孢桿菌Yz菌株發(fā)酵原粉丸化種衣劑與化學(xué)藥劑復(fù)配劑的研制

羅振亞 林開春 徐淑

摘要[目的]篩選可與枯草芽孢桿菌Yz菌株聯(lián)用的化學(xué)藥劑及復(fù)配比例，以提高枯草芽孢桿菌Yz菌株對(duì)棉花立枯病的防治效果。[方法]采用稀釋平板計(jì)數(shù)法，測(cè)定Yz菌株發(fā)酵原粉中活菌數(shù)，比較不同化學(xué)藥劑與Yz菌的生物相容性;采用盆栽試驗(yàn)，測(cè)定復(fù)配種衣劑對(duì)棉花立枯病的防效以及對(duì)棉花種子發(fā)芽率的影響。[結(jié)果]甲基托布津、撲海因、百菌清、多菌靈對(duì)Yz菌芽孢活性具有保護(hù)作用，活芽孢下降率分別為39.70%、39.99%、46.33%、50.42%，顯著低于對(duì)照;多抗霉素和代森錳鋅對(duì)Yz菌芽孢活性無影響，活芽孢下降率與對(duì)照無顯著差異;可用來與Yz丸化種衣劑進(jìn)行復(fù)配。盆栽試驗(yàn)表明，Yz丸化種衣劑與代森錳鋅、多菌靈、甲基托布津復(fù)配后，棉花種子發(fā)芽率較高，為85.00%～94.98%，對(duì)棉花立枯病的防效也提高，為63.99%～71.37%。其中，甲基托布津以0.3%和0.5%的比例與Yz丸化種衣劑混配效果最好，防效分別為74.42%、76.58%。[結(jié)論]甲基托布津與Yz丸化種衣劑復(fù)配效果較好，以0.3%比例復(fù)配最佳。

關(guān)鍵詞枯草芽孢桿菌;棉花立枯病;丸化種衣劑;復(fù)配;化學(xué)藥劑

中圖分類號(hào)S?435.621文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611（2019）18-0143-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.18.038

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Development of Compound Agents for Seed Pelleting Agent of the Fermentation Powder of Bacillus subtilis Yz Strain and Pesticide

LUO Zhen-ya1，LIN Kai-chun2，XU Shu1 （1.Plant Protection Research Institute，Guangdong Academy of Agricultural Sciences，Guangdong Provincial Key Laboratory of High Technology for Plant Protection，Guangzhou，Guangdong 510640;2.College of Plant Science and Technology，Huazhong Agricultural University，Wuhan，Hubei 430070）

Abstract[Objective]To improve the control effect of the fermentation powder of Bacillus subtilis Yz strain on cotton damping-off by screening out pesticide and ratio combined with bacillus subtilis Yz strain.[Method]The number of viable bacteria in fermentation powder of Yz strain was determined by dilution plate counting method to determine the biocompatibility of pesticide and Yz.Pot experiments was conducted to determine the effect of compound seed coating agent on cotton damping-off and germination rate of cotton seeds.[Result]?The include thiophanate-methyl，iprodione，chlorothalonil，carbendazim had protective effects on the spore activity of Yz bacteria，and the reduction rate of live spore was 39.70%，39.99%，46.33% and 50.42%，respectively，which was significantly lower than that of the control group.Polyoxin and mancozeb had no effect on the spore activity of Yz bacteria，and the reduction rate of live spore was not significantly different from that of the control group.The pesticides stated above can be used to compound with Yz seed coating agent.Pot experiments showed that when pelleting seed-coating agent of Yz was compound with mancozeb，carbendazim，thiophanate-methyl，the cotton had higher germination rate （85.00% to 94.98%） and lower incidence of cotton damping-off （the control effect was 63.99% to 71.37%）.In addition，the mixtures of thiophanate-methyl and Yz pelleting seed-coating agent with the ratio of 0.3% and 0.5% had the best control effect，which was 74.42% and 76.58%，respectively.[Conclusion]The mixture of thiophanate-methyl and Yz pelleting seed-coating agent had the most obvious effect，and the best compound proportion was 0.3%.

Key wordsBacillus subtilis;Cotton damping-off;Pill seed coating agent;Compound;Pesticide

棉花立枯病又稱爛根、黑根病，主要由立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）侵染引起[1-2]，以種子和土壤為傳播媒介，在棉花幼苗期發(fā)生普遍，可造成大量爛種、爛根和弱苗以及棉花生長(zhǎng)發(fā)育遲緩，甚至嚴(yán)重影響棉花的產(chǎn)量和品質(zhì)[3-4]。防治棉花立枯病的方法主要有藥劑浸種、藥劑拌種、苗期噴藥、溫湯浸種、深耕冬灌、輪作等[5]，其中藥劑拌種是目前最常用的方法。種衣劑具有保護(hù)種子、提高出苗率、防治病蟲害、促進(jìn)作物生長(zhǎng)、增強(qiáng)抗逆性等作用[6-9]，并可以減少農(nóng)藥的使用，降低病原菌和害蟲產(chǎn)生抗藥性的風(fēng)險(xiǎn)[10]。

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）是防治植物病害的一種有效生防菌，抑菌范圍較廣泛[11-12]，其突出特征為生長(zhǎng)速度快、營(yíng)養(yǎng)簡(jiǎn)單、耐熱抗逆性強(qiáng)且有利于生防菌的加工生產(chǎn)[13-14]。國(guó)外已有多個(gè)菌株獲得商品化生產(chǎn)許可，如GBO3、MBI600、QST713[15]和解淀粉枯草芽孢桿菌變種FZB24[16]，我國(guó)成功開發(fā)的制劑有百抗、麥豐寧、紋曲寧、萎菌凈、亞寶等[17-18]。

生防菌雖低毒、綠色環(huán)保，但易受環(huán)境、氣候、定殖能力等的影響，存在大田防效差、顯效慢等特點(diǎn)。目前，生物與化學(xué)相結(jié)合的病蟲害防治策略既能有效控制病蟲害，又能降低化學(xué)農(nóng)藥使用量，受到各國(guó)植物保護(hù)專家的重視[19]。在前期研究工作中，已從土壤中分離篩選到一株對(duì)棉花苗期病害有抑制活性的枯草芽孢桿菌Yz菌株，并研制出其丸化種衣劑配方，經(jīng)盆栽試驗(yàn)證明其對(duì)棉花立枯病具有較好的防病作用。因此，筆者篩選可與枯草芽孢桿菌Yz菌株聯(lián)用的化學(xué)藥劑并進(jìn)行復(fù)配，以期為生防制劑的開發(fā)提供技術(shù)支持，為棉花立枯病的可持續(xù)防治提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1供試棉花品種。鄂棉23號(hào)（裸種），由武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供;鄂棉23號(hào)（10%拌種靈和福美雙懸浮種衣劑包衣），市售。

1.1.2病原指示菌以及活性菌株。

供試菌株：棉花立枯病原菌（Rhizoctonia solani kuhn），由武漢天惠生物工程有限公司提供。枯草芽孢桿菌Yz菌劑發(fā)酵原粉（Bacillus subtilis），由武漢天惠生物工程有限公司提供。

1.1.3供試藥劑。

枯草芽孢桿菌Yz菌株發(fā)酵原粉丸化種衣劑配方（以下簡(jiǎn)稱Yz丸化種衣劑）：硅藻土：羧甲基纖維素鈉：木質(zhì)素磺酸鈉：Yz=6 g：1.6 g：0.2 g：2 g?；瘜W(xué)藥劑：50%多菌靈超微可濕性粉劑（山西臨汾有機(jī)化工廠）、70%代森錳鋅可濕性粉劑（美國(guó)巨邦農(nóng)資國(guó)際貿(mào)易公司）、75%百菌清可濕性粉劑（利民化工有限責(zé)任公司）、15%三唑酮可濕性粉劑（四川化學(xué)工業(yè)研究設(shè)計(jì)院）、50%撲海因可濕性粉劑（安萬特作物科學(xué)公司）、97%甲基托布津原藥（山東華陽科技股份有限公司）、1.5%多抗霉素可濕性粉劑（吉林延邊春蕾生物藥業(yè)有限公司）。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1化學(xué)殺菌劑的篩選。

將待篩選的化學(xué)殺菌劑與Yz原粉按1∶1（W/W）的比例混合均勻，密封儲(chǔ)藏于（54±2）℃恒溫箱中14 d，以未處理的Yz原粉為對(duì)照，無菌水為空白對(duì)照，采用稀釋平板計(jì)數(shù)法測(cè)定其菌數(shù)，通過測(cè)定菌數(shù)的下降率來判斷化學(xué)殺菌劑對(duì)Yz原粉生物活性的影響。選出對(duì)Yz原粉活性影響較小甚至有保護(hù)作用的化學(xué)殺菌劑，進(jìn)一步通過棉花盆栽試驗(yàn)篩選出與Yz原粉復(fù)配效果最好的化學(xué)藥劑和最佳用量。

1.2.2棉花盆栽試驗(yàn)。

棉種經(jīng)過硫酸脫絨后加稀堿溶液水洗至pH 7左右后，精選飽滿的種子。將化學(xué)藥劑與枯草芽孢桿菌Yz菌株發(fā)酵原粉丸化種衣劑復(fù)配，然后進(jìn)行棉花種子包衣處理?；瘜W(xué)藥劑的量設(shè)置3個(gè)比例，分別為包衣種子重量的0.1%、0.3%、0.5%。棉花種子包衣后播于接入棉花立枯病菌的無菌沙（一根試管斜面病菌菌種接500 g無菌沙）中。無菌沙以塑料小碗分裝，每碗裝土300 g，每碗播15粒種子，放置于華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)藥研究室網(wǎng)室中。每處理4次重復(fù)。并分別設(shè)接種棉花立枯?。úK）和不接種棉花立枯病（空CK）的空白對(duì)照以及鄂棉23號(hào)（市售）處理，出苗后5～?7 d調(diào)查出苗率和棉苗發(fā)病情況。

發(fā)芽率 =（出苗株數(shù)/種子總數(shù)）×100%

病情指數(shù)=（各級(jí)病株數(shù)×各級(jí)代表值）/（調(diào)查總株?數(shù)×9）×100

防治效果=[（空白對(duì)照區(qū)病情指數(shù)-處理區(qū)病情指數(shù)）/空白對(duì)照區(qū)病情指數(shù)]×100%

立枯病病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0級(jí)，全株無病;1級(jí)，根部病斑占整個(gè)根部面積的10%以下;3級(jí)，根部病斑占整個(gè)根部面積的11%～25%;5級(jí)，根部病斑占整個(gè)根部面積的26%～50%;7級(jí)，根部病斑占整個(gè)根部面積的51%～75%;9級(jí)，根部病斑占整個(gè)根部面積的76%以上。

1.3數(shù)據(jù)分析采用Microsoft Excel（2007版）軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和繪圖，平均數(shù)采用Duncan法進(jìn)行多重比較，顯著水平P=0.05。

2結(jié)果與分析

2.1化學(xué)藥劑對(duì)Yz原粉活芽孢的影響

由圖1可知，經(jīng)?54 ℃恒溫處理14 d后，未添加化學(xué)藥劑的Yz原粉活芽孢下降率為68.47%。添加化學(xué)藥劑甲基托布津、多菌靈、代森錳鋅、撲海因、百菌清、多抗霉素、三唑酮后，Yz原粉活芽孢下降率分別為39.70%、50.42%、68.11%、39.99%、46.33%、61.80%、78.43%。添加甲基托布津、撲海因、百菌清、多菌靈的Yz原粉活芽孢下降率顯著低于空白對(duì)照（P>0.05）;添加多抗霉素和代森錳鋅的Yz原粉活芽孢下降率與空白對(duì)照相當(dāng)，無顯著差異（P<0.05）;添加三唑酮的Yz原粉活芽孢下降率顯著高于空白對(duì)照（P>0.05）。

2.2Yz丸化種衣劑與化學(xué)藥劑復(fù)配劑對(duì)棉花種子發(fā)芽率及棉花立枯病防治效果的影響

2.2.1棉花種子發(fā)芽率。

將50%多菌靈、70%代森錳鋅、甲基托布津原藥、75%百菌清、1.5%多抗霉素、50%撲海因6種化學(xué)藥劑分別按一定比例混入Yz丸化種衣劑配方中（各化學(xué)藥劑的量均為包衣種子重量的0.3%）。結(jié)果表明（表1），甲基托布津、多菌靈、代森錳鋅、撲海因、百菌清、多抗霉素6種藥劑與Yz丸化種衣劑混配后，棉花種子發(fā)芽率分別為?88.30%、94.98%、85.00%、?71.68%、81.68%、70.00%。多菌靈+Yz處理的棉花種子發(fā)芽率顯著高于其他幾個(gè)藥劑處理，甲基托布津+Yz、代森錳鋅處理次之，撲海因+Yz和多抗霉素+Yz處理的棉花種子發(fā)芽率顯著低于其他處理。

2.2.2棉花立枯病防治效果。

由表1可知，甲基托布津、多菌靈、代森錳鋅、撲海因、百菌清、多抗霉素6種藥劑與Yz丸化種衣劑混配后，對(duì)棉花立枯病的防治效果分別為?71.37%、66.52%、63.99%、?46.01%、30.45%、28.42%。甲基托布津+Yz處理對(duì)棉花立枯病的防效最高，但與市售的鄂棉23號(hào)和多菌靈+Yz處理的防效均相當(dāng)，無顯著差異;撲海因+Yz與Yz處理對(duì)棉花立枯病的防效相當(dāng)，而百菌清+Yz和多抗霉素+Yz處理對(duì)棉花立枯病的防效相對(duì)較差，顯著低于其他處理。

2.3Yz丸化種衣劑復(fù)配化學(xué)藥劑的篩選與優(yōu)化

根據(jù)以上試驗(yàn)結(jié)果，選擇甲基托布津、多菌靈和代森錳鋅與Yz丸化種衣劑進(jìn)行復(fù)配。3種藥劑與Yz丸化種衣劑復(fù)配的用量見表2。結(jié)果表明，3種藥劑不同劑量與Yz丸化種衣劑復(fù)配后，棉花種子發(fā)芽率可達(dá)83.33%～93.35%，與對(duì)照無顯著差異。多菌靈含量為?0.1%、0.3%和0.5% 3個(gè)處理對(duì)棉花立枯病的防治效果分別為66.17%、71.80%、72.69%;代森錳鋅含量為?0.1%、0.3%和0.5%3個(gè)處理對(duì)棉花立枯病的防治效果分別為53.82%、68.37%、68.28%;甲基托布津含量為0.1%、0.3%和?0.5%3個(gè)處理對(duì)棉花立枯病的防治效果分別為?57.02%、?74.42%、76.58%。甲基托布津含量為?0.3%和0.5%的處理對(duì)棉花立枯病的防效較高，其次為多菌靈含量為0.3%和0.5%的處理，接著為代森錳鋅含量為0.3%和0.5%的處理以及多菌靈含量為0.1%的處理，而代森錳鋅含量為0.1%、甲基托布津含量為0.1%處理的防效則較差（表3）。

綜合以上結(jié)果，甲基托布津原藥（0.3%和0.5%）與Yz丸化種衣劑的混配效果最佳，從環(huán)保和防效綜合因素考慮選擇甲基托布津原藥0.3%的處理。最終配方為硅藻土：羧甲基纖維素鈉∶木質(zhì)素磺酸鈉∶Yz∶甲基托布津原藥=6 g∶1.6 g∶?0.2 g∶2 g∶0.092 g。

3結(jié)論與討論

生防微生物和化學(xué)藥劑協(xié)同防治植物病害是進(jìn)行安全無害化、環(huán)境友好型防治的重要舉措[20]。通過該舉措，可達(dá)到防效提高、化學(xué)藥劑用量減少、優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)等效果。廣東省植物保護(hù)新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自主研制的枯草芽孢桿菌Yz菌株丸化種衣劑對(duì)盆栽苗棉花立枯病具有較好的防效，但在田間其防效則較不穩(wěn)定。該研究篩選了幾種可與Yz菌株丸化種衣劑聯(lián)用的化學(xué)藥劑，并進(jìn)行復(fù)配。結(jié)果表明，甲基托布津、撲海因、百菌清、多菌靈對(duì)Yz菌株原粉芽孢活性具有保護(hù)作用，多抗霉素和代森錳鋅對(duì)Yz原粉芽孢活性無影響，而三唑酮對(duì)Yz原粉芽孢活性則有明顯的抑制作用。因此，甲基托布津、撲海因、百菌清、多菌靈、多抗霉素和代森錳鋅與Yz菌的相容性較好，可用來與Yz丸化種衣劑進(jìn)行復(fù)配。盆栽試驗(yàn)結(jié)果表明，撲海因、百菌清和多抗霉素添加到Y(jié)z丸化種衣劑后，棉苗的發(fā)芽率相對(duì)較低，而棉花立枯病的發(fā)病率則相對(duì)較高。因此最終選擇甲基托布津、多菌靈和代森錳鋅與Yz丸化種衣劑進(jìn)行復(fù)配。

化學(xué)藥劑有助于生防微生物能夠順利地在各種土壤生態(tài)環(huán)境中定殖、繁殖，并形成優(yōu)勢(shì)種群，從而更好地發(fā)揮生物防治作用[21-24]。該研究結(jié)果表明，將甲基托布津、多菌靈和代森錳鋅與Yz丸化種衣劑進(jìn)行復(fù)配后，棉花種子發(fā)芽率為85.00%～94.98%，與對(duì)照無顯著差異;復(fù)配劑對(duì)棉花立枯病的抑制有明顯的增效作用，其中甲基托布津按0.3%和0.5%的比例與Yz丸化種衣劑復(fù)配時(shí)增效作用最明顯，防效分別為74.42%、76.58%，顯著高于對(duì)照，可選用甲基托布津與Yz菌株丸化種衣劑按0.3：100的比例復(fù)配進(jìn)一步進(jìn)行田間防病試驗(yàn)，確定防治效果。

生防菌和化學(xué)藥劑協(xié)同防治綜合了生防菌和化學(xué)殺菌劑的優(yōu)點(diǎn)，可彌補(bǔ)生防菌抑菌效果慢、田間防效不穩(wěn)定的缺點(diǎn)，從而為菌劑更好的開發(fā)利用提供指導(dǎo)作用[25]。該研究也證實(shí)了這一點(diǎn)，但關(guān)于枯草芽孢桿菌Yz菌株與化學(xué)藥劑甲基托布津的協(xié)同增效作用機(jī)制，枯草芽孢桿菌Yz菌株在棉苗中的殘留消解動(dòng)態(tài)，質(zhì)保期及使用規(guī)范還有待于進(jìn)一步研究。

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