沙棘組織培養(yǎng)體系建立的研究進(jìn)展

吳彤 趙英 韓曉燕

摘要介紹了沙棘組織培養(yǎng)技術(shù)中無菌系的建立、外植體的選擇、不同部位外植體的培養(yǎng)及生根馴化等方面的研究現(xiàn)狀，總結(jié)出沙棘組織培養(yǎng)的條件和目前存在的問題，并提出今后的展望，為今后沙棘組培快繁技術(shù)及工廠化育苗奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞沙棘;組織培養(yǎng);體系

中圖分類號S?723.1文獻(xiàn)標(biāo)識碼A

文章編號0517-6611（2019）18-0010-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.18.002

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Research Advances on Establishment of Seabuckthorn Tissue Culture System

WU Tong1，ZHAO Ying1，2，HAN Xiao-yan3

（ 1.Xinjiang Agricultural University， Urumqi， Xinjiang 830052; 2.Fruit Office of XinjiangForestry Department，Urumqi，Xinjiang 830000; 3.Altay Berries Research Center，Ataile，Xinjiang 836500）

AbstractThis paper introduced the establishment of aseptic system， selection of explants， cultivation of different parts of explants and rooting and domestication in seabuckthorn tissue culture technology， and summarized the conditions and current problems of seabuckthorn tissue culture. This paper put forward the future prospects， and lay the foundation for the future rapid development of seabuckthorn tissue culture and planting and breeding.

Key wordsSeabuckthorn;Tissue culture;System

沙棘（Hippophae rhamnoides L.）又稱酸刺、醋柳，屬胡頹子科（Elaeagnaceae）多年生灌木、小喬木植物。沙棘有6種12亞種268個品種，且呈逐年擴(kuò)張趨勢[1]。沙棘是雌雄異株植物，單性花，腋生總狀花序，通過風(fēng)媒傳粉。果實為小漿果，呈橢球或球狀，大多為橙色，少橙紅色或紅色[2]。沙棘對生長環(huán)境要求較低，在地表厚度僅5 cm的土壤、pH 9.0以上的強堿地、含鹽量110%以上的鹽地、極寒酷熱等極端環(huán)境條件下均能存活[3]。沙棘分布地帶十分廣泛，主要分布在寒溫帶和歐亞溫帶地區(qū)。在亞洲，沙棘屬植物分布最為廣泛，類群也最為豐富，橫斷山至青藏高原及其邊緣地區(qū)是沙棘屬植物類群最為豐富的地區(qū)[4]。在我國沙棘有6種8亞種，分別為分布在新疆天山以北的蒙古沙棘和天山以南的中亞沙棘、昆侖山脈的中亞沙棘、青藏高原的西藏沙棘和肋果沙棘、西藏東南部的柳葉沙棘、云貴高原等地區(qū)的云南沙棘、青藏高原東部的江孜沙棘[5]。

沙棘的生命力頑強、適應(yīng)性強，具有廣泛的生態(tài)環(huán)境改造作用，是我國建設(shè)“三北防護(hù)林體系工程”林業(yè)生態(tài)工程中的先鋒樹種[6]。沙棘在防止水土流失、荒漠化等綜合治理方面具有重要的生態(tài)效益，每年在防止水土流失量上可達(dá)?740 t/hm2，每年在防風(fēng)固土量上可達(dá)660 t/hm2[7]。另外，沙棘為非豆科類固氮植物，一年生沙棘苗木中有30%以上的根系帶有根瘤組織，沙棘林的根瘤可固氮180 kg/hm2，相當(dāng)于375 kg尿素的肥力[8]。沙棘除具有較高的生態(tài)價值外，還具有很高的營養(yǎng)價值和藥用價值，是聯(lián)合國特用經(jīng)濟(jì)林樹種，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)療、保健等方面[9]。沙棘被稱為第三代果實，在所有水果和蔬菜中，VC和VE含量最高，微量元素含量在所有水果和蔬菜中也居首位。沙棘葉、果實、種子中含有高成分的黃酮，有較高的醫(yī)療價值。沙棘果實和葉片中活性成分已達(dá)200余種[10]，營養(yǎng)豐富，蛋白質(zhì)含量高，也可以作為優(yōu)良的家畜牧草。綜上所述，沙棘是一種集生態(tài)價值、食用價值、藥用價值等于一體的優(yōu)良樹種，具有廣泛的開發(fā)應(yīng)用前景。

由于沙棘自身高效益、高價值的優(yōu)越性，自1985年以來，我國沙棘種植及相關(guān)系列產(chǎn)品的開發(fā)利用得到迅速發(fā)展，但迄今為止沙棘在種植方面仍存在苗木品種雜亂、雌雄柱分布不均、長勢參差不齊等現(xiàn)象，嚴(yán)重制約了沙棘產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，隨著沙棘生產(chǎn)發(fā)展的加快，對沙棘低產(chǎn)低效林進(jìn)行品種更替改良、加快良種沙棘快速繁殖顯得尤為重要[11]。組織培養(yǎng)技術(shù)是實現(xiàn)沙棘規(guī)?；a(chǎn)有效的技術(shù)手段，也是開展沙棘基因遺傳轉(zhuǎn)化育種、保存種質(zhì)資源、抗寒耐鹽等機(jī)理研究的重要前提[12]。盡管沙棘適應(yīng)性強，分布廣泛，但組織培養(yǎng)技術(shù)可以使沙棘的繁殖不受時間和地域的限制，通過組織培養(yǎng)技術(shù)手段可在較短時間內(nèi)獲得優(yōu)良單株，提高繁殖系數(shù)，實現(xiàn)優(yōu)良品種的快速繁殖，尤其在沙棘定性繁育方面具有很大的發(fā)展前景[13]。筆者對沙棘組織培養(yǎng)技術(shù)中外植體的選擇、無菌系的建立、不同部位外植體的培養(yǎng)及生根馴化等關(guān)鍵技術(shù)的研究現(xiàn)狀進(jìn)行綜述，總結(jié)沙棘組織培養(yǎng)的條件和目前存在的問題，以期為今后沙棘組培快繁技術(shù)及工廠化育苗育奠定基礎(chǔ)。

1外植體的消毒

初代外植體的消毒處理是組織培養(yǎng)建立的一步，也是最關(guān)鍵的一步，選擇合適的消毒試劑、濃度、處理時間對組織培養(yǎng)的初步成功起著重要作用。周松坤等[14]對幾個不同時期不同部位的沙棘外植體設(shè)計了9種消毒方式，發(fā)現(xiàn)9種處理方式均對木質(zhì)化莖段消毒不佳，調(diào)整成分后也未得到改善，而加入冰塊發(fā)現(xiàn)污染率下降，但外植體生長不旺盛;使用升汞和乙醇混合處理后污染率降低，污染率也隨著消毒時間的增加而降低;幾個不同消毒處理對葉片污染率的影響均不大，但隨著消毒時間的增加，成活未污染率明顯加大，最佳方法為使用乙醇處理30～40 s，升汞處理3～4 min。楊麗萍等[15]用0.1%的升汞、次氯酸鈉、雙氧水、乙醇4種消毒試劑，設(shè)計出6種不同消毒處理對4—10月的沙棘莖段消毒，得出使用0.1%升汞加20%乙醇混合處理?5～10 min污染率最低。

由上述研究可知，沙棘初代外植體消毒處理主要使用升汞、次氯酸鈉、雙氧水、乙醇作為消毒試劑，但單獨使用乙醇消毒效果并不好，使用升汞及升汞與乙醇混合處理消毒效果較好。

2外植體的取材時間

由于不同時期外植體的成熟度、活力、細(xì)菌攜帶量、營養(yǎng)成分和內(nèi)源激素水平不同，因此不同采集時期也對外植體初代培養(yǎng)結(jié)果有很大影響。張建全等[16]以當(dāng)年生不同時期的沙棘嫩枝為材料進(jìn)行試驗，發(fā)現(xiàn)5—6月上旬是接種外植體的最佳時期。徐虹等[17]通過1年生水培莖尖為外植體進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果1月的外植體材料分化率最高，且褐化率與污染率低，生長旺盛。鄭子成等[18]采集各個季節(jié)的沙棘腋芽為外植體，發(fā)現(xiàn)在3—4月采集的外植體材料接種后萌發(fā)率最高可達(dá)100%，由此得出此時期為最佳培養(yǎng)時間;5月的外植體材料污染率高，玻璃化高;7—9月外植體褐化嚴(yán)重，9月至次年2月的外植體萌發(fā)率最低、污染率極高。張廣軍等[19]和康冰等[20]也得出類似的結(jié)論，認(rèn)為最適接種時間為3月。呂月玲等[21]對俄羅斯大果沙棘進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)最易培養(yǎng)的是2月末至3月下旬剛接觸休眠的枝條。

由上述研究可知，外植體適宜的采集時期會由于生長環(huán)境、地理位置等而有不同，但總的趨勢是選擇萌動期和發(fā)育早期的外植體。

3外植體的培養(yǎng)

莖尖組織在沙棘組織培養(yǎng)中應(yīng)用最為廣泛，其優(yōu)點在于其幼嫩、易消毒、對基本培養(yǎng)基和激素適應(yīng)性廣、接種后生長迅速、發(fā)芽能力強。呂月玲等[21]研究發(fā)現(xiàn)莖尖外植體的萌發(fā)率在1/2B5+6-BA 0.5～1.0 mg/L+IAA 0.3～0.5 mg/L培養(yǎng)基中均達(dá)到90%以上。孫蘭英[22]研究發(fā)現(xiàn)莖尖外植體在培養(yǎng)基1/2MS+KT 0.3～0.5 mg/L+NAA 0.03～?0.05 mg/L中，腋芽誘導(dǎo)率達(dá)85%，使用BA替代KT發(fā)現(xiàn)腋芽誘導(dǎo)率降低。郭春華等[23]研究表明在頂端分生組織的培養(yǎng)中不需要過高的激素，低濃度的BA配合IBA有利于沙棘莖尖組織的分化。董敬超[24]研究發(fā)現(xiàn)，在使用1/2MS基本培養(yǎng)基的情況下，BA濃度在0.10～0.25 mg/L時莖尖分化率較高。霍川等[25]研究發(fā)現(xiàn)沙棘品種深秋紅的莖尖組織在培養(yǎng)基1/2MS+6-BA 0.5 mg/L中誘導(dǎo)良好，分化芽數(shù)達(dá)?2.53。宋維秀等[26]對西藏沙棘莖尖進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在1/2MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L時，苗高均值達(dá)?2.82 cm。

莖段也是沙棘組織培養(yǎng)的重要材料，莖段營養(yǎng)成分含量較高，可直接供腋芽吸收利用，誘導(dǎo)出的芽生長旺盛，但作為初代外植體材料進(jìn)行培養(yǎng)時會出現(xiàn)消毒不徹底、褐化嚴(yán)重的現(xiàn)象。董敬超[27]通過對幾個沙棘品種的莖段進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)實優(yōu)莖段部位的最佳培養(yǎng)基為1/3MS+?6-BA 0.75 mg/L+IAA 0.3 mg/L，深秋紅和狀元黃莖段最佳培養(yǎng)基為1/3MS+?6-BA 0.5 mg/L+IAA 0.05 mg/L。韓德偉[28]研究發(fā)現(xiàn)我國沙棘莖段的最佳培養(yǎng)基為B5+BA 0.5 mg/L+IBA 0.05 mg/L。于亞軍等[29]以莖段為材料進(jìn)行研究，結(jié)果表明，當(dāng)使用1/2 B5作為基本培養(yǎng)基時，0.2 mg/L 6-BA有利于莖段的增殖，濃度太高，易出現(xiàn)玻璃化苗;周潔等[30]研究發(fā)現(xiàn)，使用1/2MS基本培養(yǎng)基單獨添加6-BA或NAA時，腋芽誘導(dǎo)率較低，當(dāng)6-BA配合NAA時，誘導(dǎo)率顯著增加。劉洪濤[31]將無菌莖段接種在1/2MS+6-BA 0.5～1.0 mg/L+IAA 0.5 mg/L中繁殖系數(shù)達(dá)2.9。

愈傷組織培養(yǎng)在植物組織培養(yǎng)中占有重要地位，通過對外植體進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，誘導(dǎo)的愈傷組織可分化出不定芽，大大提升繁殖系數(shù)。劉杰[32]以沙棘無菌苗的子葉為外植體培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，在1/2MS基本培養(yǎng)基下添加BA ?0.3 mg/L+NAA 0.02 mg/L子葉誘導(dǎo)良好，芽生長正常。李師翁等[33]研究發(fā)現(xiàn)，激素TDZ配合NAA有利于幼嫩葉片的誘導(dǎo)，分化芽數(shù)最高可達(dá)18個。周松坤[34]研究發(fā)現(xiàn)無菌葉片和莖段愈傷組織在培養(yǎng)基WPM+BA 0.5 mg/L+2，4-D 0.5 mg/L中分化良好，愈傷組織分化形成大量綠色不定芽點最終培養(yǎng)出一定高度的健壯新梢。劉志紅等[35]研究發(fā)現(xiàn)最適合中國沙棘和蒙古沙棘愈傷組織誘導(dǎo)的培養(yǎng)基為?1/3MS+6-BA 0.5 mg/L+IBA 1.0 mg/L，誘導(dǎo)率可達(dá)75.9%。

由上述研究可知，沙棘的各部位培養(yǎng)多選擇以較低濃度的無機(jī)鹽1/2MS、1/2B5為基本培養(yǎng)基，添加一定量的細(xì)胞分裂素和生長素。生長素多以IAA、IBA、NAA為主，濃度大多控制在0.1～0.5 mg/L。細(xì)胞分裂素多以BA、6-BA、KT為主，濃度大多在0.2～1.0 mg/L。但不宜添加過量生長素和細(xì)胞分裂素，過量的生長素易引發(fā)褐化現(xiàn)象，而過量的細(xì)胞分裂素則易導(dǎo)致植株玻璃化。

4生根誘導(dǎo)

生根誘導(dǎo)是植物組織培養(yǎng)中重要的一步，生根誘導(dǎo)分為瓶內(nèi)生根與瓶外生根2種方式，瓶內(nèi)生根是沙棘組培主要生根形式?？当萚20]使用6-BA配合NAA在無根苗基部的愈傷組織中成功誘導(dǎo)出不定根。周松坤等[14]研究發(fā)現(xiàn)無根苗在1/2 B5+6-BA 0.1 mg/L+IBA 0.4 mg/L培養(yǎng)基中生根率達(dá)83.8%。徐虹等[17]對無根苗基部進(jìn)行生根劑處理15 min后，再接至培養(yǎng)基后生根率明顯提高。田新華等[36]對沙棘品種深-雜進(jìn)行生根培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)在1/4MS+6-BA 0.3 mg/L+IBA ?0.5 mg/L 的培養(yǎng)基中生根率達(dá)87.5%，基部生根，根系粗壯。王莉等[37]通過使用添加適量IBA的培養(yǎng)基，成功誘導(dǎo)出根系，根長達(dá)2.5 cm，生根數(shù)在6～8條。

瓶外生根是將無菌無根苗的生根誘導(dǎo)與生根苗的移植馴化結(jié)合起來的生根技術(shù)，瓶外生根簡化了瓶內(nèi)生根的再馴化和移植過程，節(jié)約成本，提高了出苗時間。在沙棘組織培養(yǎng)中主要還是以瓶內(nèi)生根為主，瓶外生根技術(shù)的研究不多。郭春華等[23]將沙棘無根苗浸于50 mg/kg的IBA中處理18 h后，成功誘導(dǎo)出根系，根長在2 cm左右。陳宗禮等[38]研究認(rèn)為蛭石是瓶外生根的良好基質(zhì)，可以提高沙棘無根苗的生根率及生根質(zhì)量。徐航等[39]在瓶外生根試驗中，發(fā)現(xiàn)沙棘繼代無根苗在IBA中浸泡處理10 min后，生根率可達(dá)95%，且生根苗長勢良好。

由上述研究可知，在生根培養(yǎng)的研究中大多是通過高濃度生長素類來誘導(dǎo)無根苗生根，其中生長激素大多以IBA為主，瓶內(nèi)生根需要配合一定量的細(xì)胞分裂素來完成。

5馴化移栽

生根苗的馴化移植是組織培養(yǎng)中試管苗離體快繁體系最后的關(guān)鍵步驟。周潔等[30]先將生根苗置于河沙中，15 d后移到河沙與腐殖質(zhì)混合的基質(zhì)中，30 d后再移栽至土壤中，成活率達(dá)60%以上。張端偉[40]將組培生根苗置入珍珠巖和草炭2∶3混合基質(zhì)中，發(fā)現(xiàn)成活率達(dá)66.67%。YAO[41]在組培生根苗的移栽試驗中成功獲得了根瘤，經(jīng)過40 d的培養(yǎng)后幼苗可長高30 cm。趙曉翠[42]將生根苗置于溫度?20～?25 ℃、濕度60%～70%的大棚中，經(jīng)過煉苗和營養(yǎng)供給后，大部分移栽成活。

由上述研究可見，馴化移植中生根苗基質(zhì)需具有一定的透氣性。另外無根苗的存活程度不僅在于基質(zhì)的選擇，還與生根苗的狀態(tài)、高度、根系的數(shù)量和外界影響情況有關(guān)。

6展望

國內(nèi)近年來對沙棘組織培養(yǎng)方面的研究獲得了一些成效，大大推進(jìn)了沙棘良種產(chǎn)業(yè)化的進(jìn)程。但至今為止沙棘在組織培養(yǎng)方面的研究結(jié)果仍差異較大，其原因可能是地區(qū)差異、使用不同的組培方法以及不同來源的沙棘品種對培養(yǎng)基各激素成分的耐受程度不同而引起，總體而言，目前沙棘在組織培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)用中仍處于快繁體系完善階段，為了更好地推進(jìn)沙棘的開發(fā)利用和生態(tài)建設(shè)的發(fā)展，建議以后研究中可根據(jù)當(dāng)?shù)厣臣奶匦?，因地制宜地篩選出不同來源、不同品種的最適培養(yǎng)條件，更好地完善沙棘的組織培養(yǎng)繁殖體系。

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