精血補(bǔ)片HPLC指紋圖譜建立同時(shí)測(cè)定主要成分含量*

寧良琦，鄭艷萍，蔡寶昌，童黃錦

1 安徽亳州市食品藥品檢驗(yàn)中心，亳州 236803；2 南京海昌中藥集團(tuán)有限公司，南京 210061；3 南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，南京 210028；4 江蘇省中醫(yī)藥研究院，南京 210028

精血補(bǔ)片，別名益腦片，由生曬參、紅參、制何首烏、紫河車、五味子、陳皮等6 味中藥配伍組成的非處方中成藥，具有補(bǔ)肝腎、益血?dú)?、養(yǎng)心神的療效，用于神經(jīng)衰弱、精神萎靡、頭暈?zāi)肯摇⑿募率叩劝Y[1]。該品在部頒標(biāo)準(zhǔn)《中藥成方制劑》第六冊(cè)（WS3-B-1268-92）中只規(guī)定了性狀、顯微鑒別、檢查3 項(xiàng)內(nèi)容，并未涉及有效成分含量測(cè)定等重要檢驗(yàn)項(xiàng)目。查閱相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，僅有2 篇報(bào)道精血補(bǔ)片質(zhì)量控制方面的研究[2，3]，涉及了薄層色譜法（TLC）對(duì)復(fù)方制劑中各味中藥進(jìn)行定性鑒別和二苯乙烯苷含量測(cè)定的方法，不能全面反映精血補(bǔ)片復(fù)方制劑多成分共同作用的特征。故制定有效的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)是中藥安全有效的必由之路，可以反映中藥及其制劑中所含化學(xué)成分的種類及數(shù)量。

本文采用HPLC 法對(duì)精血補(bǔ)片進(jìn)行系統(tǒng)研究，建立其指紋圖譜及橙皮苷、二苯乙烯苷、五味子醇甲、大黃素等4 種成分含量測(cè)定方法，為其全面質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。

1 儀器與藥品、試劑

LC-20AD 高效液相色譜儀；BP121S 電子分析天平（Sartorius）。

橙皮苷對(duì)照品（批號(hào)161231），二苯乙烯苷對(duì)照品（批號(hào)160315），五味子醇甲對(duì)照品（批號(hào)161016），大黃素對(duì)照品（批號(hào)130526）均購(gòu)于南京森貝伽生物科技有限公司；精血補(bǔ)片（批號(hào)150902、150601、150901、160401、160301、150903、151101、130301、120303、120301，江蘇海昇藥業(yè)有限公司）；乙腈為色譜純；甲醇等試劑為分析純；水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：YMC-Pack ODS-A（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（B）-0.1%甲酸水溶液（A），梯度洗脫（程序?yàn)?～10 min，5%～10%B；10～50 min，10%～25%B；50～65min，25%～45%B；65～80min，45%～45%B；80～115 min，45%～80%B）；流速：1 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取橙皮苷、二苯乙烯苷、五味子醇甲、大黃素對(duì)照品適量，分別置于10 mL 量瓶中，甲醇溶解、定容，制得濃度分別為7.879、2.930、0.624、0.194mg·mL-1對(duì)照品溶液（Ⅰ）；分別精密量取以上對(duì)照品溶液各1 mL，加至5 mL 量瓶中，混勻后用甲醇定容，配制成含橙皮苷1.576mg·mL-1、二苯乙烯苷0.586mg·mL-1、五味子醇甲0.125 mg·mL-1、大黃素0.039 mg·mL-1的混合對(duì)照品溶液（Ⅱ），過(guò)微孔濾膜，即得。

2.3 供試品溶液的制備

精血補(bǔ)片粉碎過(guò)65 目篩，稱取粉末樣品0.25 g，置50 mL 具塞錐形瓶中，加入石油醚（60 ℃～90 ℃）20 mL，超聲30 min，過(guò)濾，棄去濾液，將固體物蒸干，置于具塞錐形瓶中，量取甲醇20 mL，超聲30 min，過(guò)濾，濾液置水浴鍋上70 ℃蒸干，固體物加甲醇溶解，洗滌定容于2 mL 的量瓶中，搖勻，12 000 r·min-1離心10 min，取上清液，過(guò)微孔濾膜，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精血補(bǔ)片指紋圖譜及含量測(cè)定方法建立對(duì)10 批樣品按“2.3”項(xiàng)制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，其混合對(duì)照品HPLC 色譜圖見圖1-A，樣品HPLC 圖譜見圖1-B。根據(jù)10 批不同批次樣品的液相指紋圖譜分析及數(shù)據(jù)計(jì)算，結(jié)果對(duì)比得出共有峰15 個(gè)，10 批次指紋圖譜比較見圖1-C。

圖1 HPLC 色譜圖譜

2.4.2 線性關(guān)系考察 取“2.2”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液（Ⅱ）50、100、200、500、1 000 μL 置1 mL 量瓶中，用甲醇定容，制成不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)品，將稀釋的混合標(biāo)準(zhǔn)品，按“2.1”項(xiàng)色譜條件檢測(cè)，以進(jìn)樣量X 為橫坐標(biāo)，以峰面積Y 為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程及對(duì)照品溶液線性范圍等，見表1。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4.3 進(jìn)樣精密度試驗(yàn) 取樣品（批號(hào)160301）按“2.3”項(xiàng)配制供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6 次，每次進(jìn)樣量10μL，按“2.1”色譜條件檢測(cè)，測(cè)定其HPLC 色譜圖，以橙皮苷為參考峰，對(duì)色譜圖中15 個(gè)共有指紋峰進(jìn)行考察，結(jié)果表明，共有指紋峰的保留時(shí)間RSD 均＜0.4%，共有峰峰面積RSD 均＜1.8%，說(shuō)明儀器精密度較好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取樣品（批號(hào)160301）按“2.3”項(xiàng)配制供試品溶液，分別于0、4、8、16、24 h 重復(fù)進(jìn)樣，每次進(jìn)樣量10 μL，按“2.1”項(xiàng)色譜條件檢測(cè)，測(cè)定其HPLC 色譜圖，以橙皮苷為參考峰，對(duì)色譜圖中的15 個(gè)共有指紋峰進(jìn)行考察，結(jié)果表明，共有指紋峰的保留時(shí)間RSD 均＜0.8%，共有峰峰面積RSD均＜1.7%，說(shuō)明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.4.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取樣品（批號(hào)160301），按“2.3”項(xiàng)制備供試品溶液共6 份，按“2.1”項(xiàng)色譜條件檢測(cè)，測(cè)定其HPLC 色譜圖，以橙皮苷為參考峰，對(duì)色譜圖中的15 個(gè)共有指紋峰進(jìn)行考察，結(jié)果表明，共有指紋峰的保留時(shí)間RSD 均＜0.7%，共有峰峰面積RSD 均＜2.5%，說(shuō)明方法重復(fù)性良好。

2.4.6 加樣回收率試驗(yàn) 取樣品（批號(hào)160301）粉末，精密稱取0.125 g 9 份，置于50 mL 具塞錐形瓶中，按“2.3”項(xiàng)制備供試品溶液，在最后固體物中依次加入混合對(duì)照品溶液0.57、0.57、0.57、0.71、0.71、0.71、0.86、0.86、0.86 mL 后，再用甲醇定容至2 mL，按“2.1”項(xiàng)色譜條件檢測(cè)，測(cè)定其HPLC 色譜圖，分別記錄4 種成分的峰面積，根據(jù)“2.4.2”的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算橙皮苷、二苯乙烯苷、五味子醇甲、大黃素的含量和加樣回收率，其平均回收率分別為100.01%（RSD 1.27%）、100.49%（RSD 1.53%）、100.32%（RSD 1.41%）、99.67%（RSD 1.42%）。

2.4.7 含量測(cè)定 取10 批樣品，按“2.3”項(xiàng)制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件檢測(cè)4 種成分的含量，結(jié)果見表2。

表2 樣品4 種成分含量測(cè)定結(jié)果（mg·g-1，n=3）

2.4.8 精血補(bǔ)片指紋圖譜相似度分析 取10 批樣品制成供試品溶液，分別精密量取10 μL，依次注入高效液相色譜儀中，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖。將10 批樣品的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A 版”軟件，以中位數(shù)法對(duì)樣品的指紋圖譜進(jìn)行峰點(diǎn)校正，數(shù)據(jù)匹配分析，生成共有模式圖，10 批樣品溶液匹配色譜見圖1-C，相似度評(píng)價(jià)結(jié)果見表3。

表3 10 批精血補(bǔ)片供試品溶液相似度評(píng)價(jià)結(jié)果

3 討論

樣品處理：比較了水浴加熱回流和超聲兩種方式，結(jié)果顯示超聲分離效果較好；80%甲醇和100%甲醇超聲處理，區(qū)別不大；而采用石油醚進(jìn)行脫脂，可去除一些小極性的化學(xué)成分。

對(duì)供試品溶液進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描：分別以234 nm、284 nm 作為檢測(cè)波長(zhǎng)時(shí)，色譜圖或基線漂移較明顯或色譜峰數(shù)較少；以254 nm 作為檢測(cè)波長(zhǎng)時(shí)，色譜峰數(shù)目較多且分離度較好，基線平穩(wěn)，峰形對(duì)稱。

對(duì)流動(dòng)相選擇時(shí)發(fā)現(xiàn)：甲醇-水洗脫出的峰分離度不好，且峰形欠佳；乙腈-水洗脫出的峰數(shù)目較多、分離度較高，個(gè)別峰形不佳，可在水相中加入少量甲酸改變峰形，故選擇乙腈-0.1%甲酸水為流動(dòng)相。

中藥指紋圖譜技術(shù)采用宏觀分析方法，能基本反映中藥的化學(xué)成分及其含量分布狀況，可以用來(lái)作為鑒別中藥真?zhèn)蝺?yōu)劣的依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)在建立精血補(bǔ)片的HPLC 指紋圖譜的基礎(chǔ)上，實(shí)現(xiàn)了通過(guò)相似度分析對(duì)不同批次精血補(bǔ)片質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)，可解決本品以單一化學(xué)成分作為質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)的局限性問(wèn)題，也為精血補(bǔ)片的質(zhì)量控制提供了新的參考。