抗病毒治療對(duì)慢性乙型肝炎患者外周血HBV特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的影響及其臨床意義*

黃金華 崔顯念 姜 宜 黃 敏 余 冰

1.恩施州中心醫(yī)院中醫(yī)部檢驗(yàn)科(湖北 恩施， 445000) 2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院

慢性乙型肝炎(CHB)感染屬于傳染科常見疾病，臨床主要表現(xiàn)為全身乏力、腹脹、肝區(qū)疼痛及惡心等，若未及時(shí)發(fā)現(xiàn)并采取有效治療，隨著疾病進(jìn)展，患者可能出現(xiàn)慢性肝病面容、肝功能異常及脾大等現(xiàn)象，嚴(yán)重者甚至轉(zhuǎn)變?yōu)楦伟┗蛘吒斡不?，直接威脅其生命安全，降低生活質(zhì)量，因此臨床盡早診斷、準(zhǔn)確評(píng)估預(yù)后成為關(guān)鍵[1～4]。因此筆者展開研究，探討CHB患者抗病毒治療前后外周血HBV特異性CTL變化及其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇我院2016年7月至2018年1月收治的90例慢性HBV感染患者作為A組，51例非病毒性肝病患者作為B組，另選擇同一時(shí)間體檢的80例健康者作為C組。A組男47例，女43例，年齡32～58歲，平均年齡(43.58±1.25)歲，均符合《病毒性肝炎防治方案》中CHB的診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]。B組男28例，女23例，年齡33～58歲，平均年齡(43.17±1.19)歲。C組男41例，女39例，年齡33～58歲，平均年齡(43.27±1.20)歲。3組人員一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 方法

1.2.1 治療方式：給予A組患者抗病毒治療。全面了解具體病情，選擇合適的藥物進(jìn)行治療，藥物包括干擾素、阿德福韋、拉米夫定、恩替卡韋、替比夫定等。

1.2.2 HLA-A2等位型：清晨收集所有患者空腹靜脈血(100μl)，采取肝素鈉進(jìn)行抗凝，經(jīng)溶血、洗滌、固定后分別在檢測試管及對(duì)照試管中添加抗人HLA-A2單克隆抗體及對(duì)照品(10μl)，置于16～27℃下避光孵育30min，利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，若HLA-A2+表達(dá)率超出90%為陽性[6]。

1.2.3 HBV特異性CTL：將CD8+五聚體+T淋巴細(xì)胞作為HBV特異性CTL,其陽性率=五聚體+CD8+/CD8+×100.00%[7]。每例患者均設(shè)置CD8-五聚體-、五聚體-CD8+與五聚體-CD8+細(xì)胞對(duì)照，均放入肝素鈉抗凝全血(100μl)，添加MHC-五聚體(1μl)、抗CD8單克隆抗體(10μl)及對(duì)照品，搖晃均勻，避光冰浴30min。放入2ml 1×FACS裂解液，室溫下存放10min，PBS液洗滌，1%多聚甲醛固定，流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.4 HBV DNA檢測：煮沸法提取血清DNA，收集50μl復(fù)融后血清標(biāo)本，放入濃縮液50μl，13000r/min離心10min，取上層血清，加入裂解液50μl，搖晃均勻后置于100℃金屬浴中10min，13000r/min離心10min，取上層清液作為PCR模板。常規(guī)套式PCR擴(kuò)增，其產(chǎn)物采取30g/L瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察，存在513bp條帶判定為陽性。

1.2.5 ALT檢測：清晨收集所有患者空腹靜脈血，分離血清，采取7150生化分析儀器及配套試劑進(jìn)行檢測，參考范圍為5～40U/L[8]。

2 結(jié)果

2.1 3組人員HLA-A2等位型檢測結(jié)果 見表1。

2.2 3組人員HBV特異性CTL檢測結(jié)果見表2。

表1 HLA-A2等位型檢測結(jié)果 [n(%)]

與A組治療前比較，*P<0.05；與A組治療后比較，#P<0.05

表2 HBV特異性CTL檢測結(jié)果(%)

與A組治療前比較，*P<0.05；與A組治療后比較，較#P<0.05；與HLA-A2+比較，&P<0.05

2.3 3組人員HBV DNA及ALT檢測結(jié)果 見表3。

3 討論

我國是CHB高發(fā)國家之一，多數(shù)患者病程較長，隨著疾病發(fā)展，可能并發(fā)其他疾病，加重健康負(fù)擔(dān)，給患者帶來沉重的心理負(fù)擔(dān)，降低生活質(zhì)量，嚴(yán)重者甚至轉(zhuǎn)變成為肝硬化或者肝癌，直接危及生命[9～11]。

相關(guān)報(bào)道中曾指出[12]，機(jī)體中是否能夠出現(xiàn)針對(duì)HBV表面蛋白的輔助性T細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞反應(yīng)是穩(wěn)定HBV感染的關(guān)鍵。但CTL活化與生物學(xué)效應(yīng)均受到HLA-I的影響，具有一定局限性，因此不同HLA-1等位型可能存在不同的抗原表位，若能夠針對(duì)HLA-A2等位型進(jìn)行有效判斷，可為HBV特異CTL水平的體現(xiàn)提供保障[13，14]。本研究提示A組患者治療前后HLA-A2陽性率存在較大差異，與B、C組相比也存在一定差異，說明該指標(biāo)能夠成為判斷疾病、評(píng)估治療效果的主要指標(biāo)，為治療方案的更換及預(yù)后提供保障。既往報(bào)道顯示[15]，細(xì)胞免疫在HBV感染中具有重要意義。其中CTL能夠分泌各種細(xì)胞因子參與免疫作用，并有效殺滅病毒，作為主要的效應(yīng)細(xì)胞與其病毒清除及肝細(xì)胞受損存在密切相關(guān)性。本研究結(jié)果中A組HLA-A2+患者的特異性CTL陽性率較HLA-A2-者低，說明HLA-A2在HBV特異性CTL中具有一定抑制效果。而HBV DNA、ALT屬于肝臟損傷的主要標(biāo)志物，A組經(jīng)過治療后HBV特異性CTL陽性率明顯升高，HBV DNA、ALT水平有所減少，說明及時(shí)采取有效治療可降低對(duì)肝臟的損害，同時(shí)控制病毒傳染。

表3 3組人員HBV DNA及ALT檢測結(jié)果

與A組治療前比較，*P<0.05；與A組治療后比較，#P<0.05；與同組HLA-A2+比較，&P<0.05

綜上所述，外周血HBV特異性CTL在CHB中具有重要作用，可以作為判斷病情、療效評(píng)估及預(yù)后評(píng)估指標(biāo)。