體外多酶分子機(jī)器的現(xiàn)狀和最新進(jìn)展

魏欣蕾，游淳

體外多酶分子機(jī)器的現(xiàn)狀和最新進(jìn)展

魏欣蕾，游淳

中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津 300308

體外多酶分子機(jī)器遵循所設(shè)計(jì)的多酶催化路徑，將若干種純化或部分純化的酶元件進(jìn)行合理的優(yōu)化與適配，高效地在體外將特定的底物轉(zhuǎn)化為目標(biāo)化合物。體外多酶分子機(jī)器反應(yīng)系統(tǒng)呈現(xiàn)元件化和模塊化的特點(diǎn)，在設(shè)計(jì)、組裝和調(diào)控方面具有較高的自由度。近年來，體外多酶分子機(jī)器在實(shí)現(xiàn)反應(yīng)過程的精準(zhǔn)調(diào)控和提高產(chǎn)品得率方面的優(yōu)勢(shì)逐漸體現(xiàn)，展示了其在生物制造領(lǐng)域重要的應(yīng)用潛力。對(duì)體外多酶分子機(jī)器的相關(guān)研究已成為合成生物學(xué)的一個(gè)重要分支領(lǐng)域，日益受到廣泛的關(guān)注。文中系統(tǒng)地綜述了基于酶元件/模塊的體外多酶分子機(jī)器的構(gòu)建策略，以及改善該分子機(jī)器中酶元件/模塊之間適配性的研究進(jìn)展，并分析了該生物制造平臺(tái)的發(fā)展前景與挑戰(zhàn)。

生物元件，反應(yīng)模塊，輔酶，人工多酶復(fù)合體，適配性，體外酶生物合成系統(tǒng)，體外合成生物學(xué)，生物制造

體外多酶分子機(jī)器是遵循所設(shè)計(jì)的多酶催化路徑，由若干生物酶元件構(gòu)成，在體外將特定的底物轉(zhuǎn)化為目標(biāo)化合物的生物催化系統(tǒng)。與目前主流的微生物細(xì)胞催化系統(tǒng)相比，體外多酶分子機(jī)器具有很多優(yōu)勢(shì)，例如副反應(yīng)少[1]、產(chǎn)品得率高[2-3]、反應(yīng)速度快[4-5]、產(chǎn)品易分離[6-7]、可耐受有毒的環(huán)境[1]、系統(tǒng)可操作性強(qiáng)[1]等，在生物制造領(lǐng)域展現(xiàn)出日益增強(qiáng)的競(jìng)爭(zhēng)力。

體外多酶分子機(jī)器的構(gòu)建流程通常包括下列步驟：1) 確定初始底物和目標(biāo)產(chǎn)物，設(shè)計(jì)反應(yīng)路徑，從熱力學(xué)角度對(duì)反應(yīng)路徑進(jìn)行可行性分析；2) 尋找合適的酶元件的來源，對(duì)酶元件進(jìn)行制備和酶學(xué)性質(zhì)表征；3) 進(jìn)行概念實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)產(chǎn)物的生成；4) 確認(rèn)反應(yīng)系統(tǒng)的物質(zhì)流瓶頸，優(yōu)化反應(yīng)條件以解決系統(tǒng)的適配問題。早期的體外多酶分子機(jī)器普遍存在酶元件選擇少、酶穩(wěn)定性差、需要添加昂貴輔酶等問題，在多數(shù)情況下僅限于高值化學(xué)品的生產(chǎn)[8-9]。近年來，隨著相關(guān)研究的不斷發(fā)展，上述問題均得到了一定程度的改善，科研人員設(shè)計(jì)并構(gòu)建了多種更為復(fù)雜的體外多酶分子機(jī)器，以經(jīng)濟(jì)易得的底物實(shí)現(xiàn)了許多大宗化學(xué)品的高效合成[3,10-14]。

隨著系統(tǒng)的復(fù)雜化，體外多酶分子機(jī)器逐漸呈現(xiàn)出模塊化的特點(diǎn)[14-17]。每個(gè)反應(yīng)模塊由1種或幾種酶元件 (以及輔酶等非酶元件) 構(gòu)成。元件、模塊的自由組合使體外多酶分子機(jī)器的催化功能得到了極大的拓展。然而如何在含有大量元件和模塊的體外多酶分子機(jī)器中實(shí)現(xiàn)各組分的有效適配是當(dāng)前研究面臨的關(guān)鍵問題。此外，與細(xì)胞工廠不同的是，體外多酶分子機(jī)器中的酶元件/模塊具有不可再生性，因此對(duì)反應(yīng)系統(tǒng)的穩(wěn)定性提出了更高的要求。

本文結(jié)合國(guó)內(nèi)外已開展的相關(guān)研究，介紹體外多酶分子機(jī)器中反應(yīng)模塊的設(shè)計(jì)、構(gòu)建與應(yīng)用，并詳細(xì)闡述各個(gè)反應(yīng)模塊的有效適配方法，最后討論了該分子機(jī)器在生物制造領(lǐng)域的發(fā)展前景和面臨的挑戰(zhàn)。

1 反應(yīng)模塊的設(shè)計(jì)、構(gòu)建與應(yīng)用

體外多酶分子機(jī)器通常包含酶和非酶元件，非酶元件包括輔酶元件和用于構(gòu)建人工多酶復(fù)合體的支架元件、卯榫元件等。在體外多酶分子機(jī)器中，完成一些特定功能所需的酶元件或非酶元件的組合就構(gòu)成了酶的反應(yīng)模塊。根據(jù)反應(yīng)模塊對(duì)非酶元件的依賴性，反應(yīng)模塊可被分為僅包含酶元件的模塊以及由酶元件和非酶元件共同構(gòu)成的模塊兩大類。本節(jié)將從模塊的設(shè)計(jì)、構(gòu)建與應(yīng)用層面分別對(duì)這兩類反應(yīng)模塊進(jìn)行介紹。

1.1 僅包含酶元件的反應(yīng)模塊

在體外多酶分子機(jī)器中，有一類反應(yīng)模塊僅由酶元件構(gòu)成，無需輔酶等非酶元件的協(xié)助即能夠獨(dú)立實(shí)現(xiàn)特定的催化功能。例如，淀粉磷酸化模塊 (Starch phosphorylation module) 由α-葡聚糖磷酸化酶 (α-glucan phosphorylase，αGP)、異淀粉酶 (Isoamylase，IA) 以及4-α-糖基轉(zhuǎn)移酶 (4-α-glucanotransferase，4GT) 這3種酶元件構(gòu)成，將淀粉和無機(jī)磷 (Inorganic phosphate，Pi) 完全轉(zhuǎn)化為葡萄糖1-磷酸 (Glucose 1-phosphate，G1P)并產(chǎn)生少量葡萄糖。在該反應(yīng)模塊的下游添加其他的酶元件或反應(yīng)模塊，能夠進(jìn)一步利用G1P實(shí)現(xiàn)氫氣[18]、肌醇[19]或昆布二糖[20]等的生產(chǎn) (圖1)。

在上述以淀粉為底物產(chǎn)氫的體外多酶分子機(jī)器中，除了淀粉磷酸化模塊之外，另一個(gè)僅由酶元件組成的反應(yīng)模塊是將副產(chǎn)物核酮糖5-磷酸(Ribulose 5-phosphate，Ru5P) 重新轉(zhuǎn)化為反應(yīng)體系的中間產(chǎn)物葡萄糖6-磷酸 (Glucose 6-phosphate，G6P)的碳重排模塊 (Carbon rearrangement module) (圖1)，其作用是提高底物的利用率。在Cheng等設(shè)計(jì)的以木糖為底物生產(chǎn)肌醇的體外多酶分子機(jī)器中，反應(yīng)系統(tǒng)的核心也是一個(gè)類似的碳重排模塊，通過將6分子的木酮糖5-磷酸 (Xylulose 5-phosphate，Xu5P) 轉(zhuǎn)化為5分子的G6P，完成了從五碳化合物到六碳化合物的轉(zhuǎn)變[21]。碳重排模塊也可實(shí)現(xiàn)由四碳化合物向六碳化合物的轉(zhuǎn)化。例如，Igor等設(shè)計(jì)的非氧化糖酵解 (Non-oxidative glycolysis)體外多酶分子機(jī)器中包含一個(gè)將3分子赤蘚糖4-磷酸 (Erythrose 4-phosphate，E4P) 轉(zhuǎn)化為2分子果糖6-磷酸 (Fructose 6-phosphate，F(xiàn)6P) 的碳重排模塊，以實(shí)現(xiàn)該反應(yīng)途徑的最終產(chǎn)物——乙酰磷酸 (Acetyl phosphate) 的化學(xué)計(jì)量數(shù)生成[22]。在這個(gè)碳重排模塊的基礎(chǔ)上，Wei等添加了淀粉磷酸化模塊和L-茶氨酸生產(chǎn)元件，構(gòu)建了以淀粉為底物、以乙酰磷酸為直接能量供體的體外多酶ATP再生底盤系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了ATP的化學(xué)計(jì)量數(shù)再生，并以再生的ATP進(jìn)行了L-茶氨酸的高效生產(chǎn)[13]。

為了簡(jiǎn)化反應(yīng)體系、降低生產(chǎn)成本、提升系統(tǒng)穩(wěn)定性，研究者們?cè)谠O(shè)計(jì)體外多酶分子機(jī)器反應(yīng)路徑時(shí)會(huì)盡量減少所需酶元件的種類，并規(guī)避輔酶的使用[16]。例如丙酮酸是糖酵解途徑的最終產(chǎn)物，也是重要的平臺(tái)化合物。然而生物體內(nèi)利用天然代謝途徑將甘油轉(zhuǎn)化為丙酮酸的過程涉及至少8種酶元件以及NAD、ATP等輔酶元件的參 與[23-25]。為了簡(jiǎn)化反應(yīng)系統(tǒng)，Gao等設(shè)計(jì)了一個(gè)僅需3種熱穩(wěn)酶元件即可將甘油轉(zhuǎn)化為丙酮酸的人工反應(yīng)模塊，并在其下游添加了另外2種酶元件進(jìn)行()-乙偶姻 (()-acetoin) 的生產(chǎn)，獲得了85.5%的高產(chǎn)品得率[26]。該反應(yīng)模塊簡(jiǎn)單、穩(wěn)定、高效，為構(gòu)建以甘油為底物經(jīng)由丙酮酸生產(chǎn)其他生物化學(xué)品的體外多酶分子機(jī)器奠定了良好基礎(chǔ)。

1.2 由酶元件和非酶元件共同構(gòu)成的反應(yīng)模塊

1.2.1 NAD(P) 輔酶再生模塊

在多數(shù)情況下，體外多酶分子機(jī)器反應(yīng)系統(tǒng)會(huì)不可避免地需要輔酶的參與。天然輔酶由于價(jià)格昂貴、穩(wěn)定性差、在高濃度時(shí)對(duì)某些酶的活性造成抑制等因素，不適合一次性大量加入體外多酶分子機(jī)器中進(jìn)行反應(yīng)[27-28]。輔酶再生模塊能夠很好地解決上述問題，是構(gòu)建可持續(xù)運(yùn)作的輔酶依賴型體外多酶分子機(jī)器的重要前提。

天然的煙酰胺類輔酶NAD(P) 是氧化還原酶元件最常用的電子中介體，通過在NAD(P)+(氧化態(tài)) 和NAD(P)H (還原態(tài)) 之間相互轉(zhuǎn)化實(shí)現(xiàn)電子的傳遞。常見的NAD(P)+再生模塊由NAD(P)H氧化酶 (NAD(P)H oxidase)[3,29]或乳酸脫氫酶 (Lactate dehydrogenase)[30]等單一的酶元件與相應(yīng)的輔酶元件組合而成。而常見的最簡(jiǎn)單的NAD(P)H再生模塊則由醇脫氫酶 (Alcohol dehydrogenase，ADH)[30-31]、甲酸脫氫酶 (Formate dehydrogenase，F(xiàn)DH)[32-34]、葡萄糖脫氫酶 (Glucose dehydrogenase，GDH)[35-37]、亞磷酸脫氫酶 (Phosphite dehydrogenase，PTDH)[38-39]或氫酶 (Hydrogenase)[40-41]等單一的酶元件與相應(yīng)的輔酶元件組合而成。

圖1 模塊化的體外多酶分子機(jī)器示例

更為復(fù)雜的煙酰胺類輔酶再生模塊包含多種酶元件。例如，Kim等利用醇脫氫酶、醛脫氫酶 (Aldehyde dehydrogenase，ALDH) 和甲酸脫氫酶組合成反應(yīng)模塊，使1分子甲醇完全氧化并產(chǎn)生3分子NADH，這些還原力可用于生物產(chǎn)電[42]。該反應(yīng)模塊可作為一個(gè)以甲醇為底物的高效NADH再生模塊 (圖2A) 與其他消耗NADH的酶反應(yīng)模塊結(jié)合，創(chuàng)建新的體外多酶分子機(jī)器。來源于極端嗜熱的激烈火球菌的可溶性氫酶 (Soluble hydrogenase I，SHI)偏好輔酶NADP+而對(duì)NAD+的活性極低，可以利用氫氣為底物在高溫下進(jìn)行NADPH的再生[43-44]。為了實(shí)現(xiàn)基于氫酶的NADH再生，Song等構(gòu)建了一個(gè)包含SHI和具有熱穩(wěn)定性的黃遞酶 (Diaphorase，DI) 的NADH再生模塊，利用DI將SHI產(chǎn)生的NADPH轉(zhuǎn)化為NADH (圖2B)，并在該反應(yīng)模塊的基礎(chǔ)上添加了具有熱穩(wěn)定性的乳酸脫氫酶，在50 ℃的條件下實(shí)現(xiàn)了從丙酮酸到乳酸的完全轉(zhuǎn)化[45]。

煙酰胺類輔酶再生模塊通常進(jìn)行的是NAD(P)+與NAD(P)(H) 之間的轉(zhuǎn)化。這類輔酶再生模塊與消耗輔酶的反應(yīng)模塊結(jié)合，用以達(dá)到理想狀態(tài)下體外多酶分子機(jī)器內(nèi)部的輔酶平衡。由于多酶反應(yīng)有時(shí)在高溫下進(jìn)行，而NAD(P)+和NAD(P)H易遇熱分解，導(dǎo)致在較高的溫度下進(jìn)行反應(yīng)的體外多酶分子機(jī)器在運(yùn)行過程中輔酶的濃度逐漸降低，影響了催化效率[12,46]。Honda等發(fā)現(xiàn)在高溫條件下，NAD+被分解為更穩(wěn)定的煙酰胺 (Nicotinamide) 和ADP-核糖 (ADP-ribose)，因此構(gòu)建了包含4種熱穩(wěn)酶元件的輔酶再生模塊，將NAD+受熱分解產(chǎn)生的煙酰胺和ADP-核糖重新合成為NAD+(圖2C)，使反應(yīng)體系中NAD+的濃度在60 ℃能夠保持恒定達(dá)15 h[47]。該輔酶再生模塊能夠在一定程度上緩解輔酶的不穩(wěn)定性對(duì)體外多酶分子機(jī)器造成的負(fù)面影響。

1.2.2 ATP再生模塊

三磷酸腺苷 (Adenosine triphosphate，ATP)是一種高能磷酸化合物，通過與二磷酸腺苷 (Adenosine diphosphate，ADP) 的相互轉(zhuǎn)化實(shí)現(xiàn)能量的貯存和釋放，為生物催化過程提供能量。含有ATP的體外多酶分子機(jī)器通常需要加入ATP再生模塊，以保證ATP的持續(xù)供應(yīng)。以多聚磷酸激酶 (Polyphosphate kinase，PPK) 和ADP構(gòu)成的反應(yīng)模塊是目前應(yīng)用最為廣泛的ATP再生策略[48-51]。該ATP再生模塊利用價(jià)格低廉的多聚磷酸 (Polyphosphate) 作為ATP再生的磷酸供體。然而高濃度的多聚磷酸會(huì)與體外多酶分子機(jī)器反應(yīng)系統(tǒng)中的二價(jià)金屬離子螯合，影響酶元件的催化活性[52-53]。因此，研究人員開發(fā)出更為復(fù)雜的ATP再生模塊，以經(jīng)濟(jì)易得的不含磷化合物作為能量來源，將ADP和無機(jī)磷重新生成為ATP。例如，Kim和Swartz使用含有3種酶元件的反應(yīng)模塊，將丙酮酸經(jīng)由乙酰輔酶A (Acetyl-CoA) 和乙酰磷酸轉(zhuǎn)化為乙酸，同時(shí)完成ATP的再生，每分子丙酮酸能再生1分子ATP (圖3)[54]。該ATP再生模塊也被稱為PANOx系統(tǒng)[55]。為了進(jìn)一步提高ATP的產(chǎn)量，Wang等向PANOx模塊上游添加了糖酵解模塊，以葡萄糖為底物生產(chǎn)ATP再生所需的丙酮酸，改進(jìn)后的ATP再生模塊每消耗1分子葡萄糖底物可再生3分子ATP (圖3)[55]。在這個(gè)改進(jìn)后的ATP再生模塊中，葡萄糖首先在己糖激酶 (Hexokinase，Hex) 的催化作用下被磷酸化為G6P，并消耗ATP。為了進(jìn)一步提高ATP的再生效率，研究者們又使用α-葡聚糖磷酸化酶和磷酸葡萄糖變位酶 (Phosphoglucomutase，PGM) 取代了己糖激酶，構(gòu)建了以麥芽糊精和無機(jī)磷為底物的ATP再生模塊[55]。該模塊避免了葡萄糖磷酸化這一消耗ATP的過程，因此每個(gè)葡萄糖當(dāng)量的麥芽糊精總共可再生4分子ATP。然而這些ATP再生模塊都需要NAD(H) 和輔酶A (Coenzyme A，CoA) 等昂貴輔酶的參與。為了規(guī)避價(jià)格昂貴且不穩(wěn)定的NAD(P) 以及CoA的使用，Wei等構(gòu)建了另一種基于麥芽糊精的ATP再生模塊，在利用α-葡聚糖磷酸化酶和磷酸葡萄糖變位酶將麥芽糊精磷酸化為G6P后，使用磷酸葡萄糖異構(gòu)酶 (Phosphoglucose isomerase，PGI) 將G6P轉(zhuǎn)化為F6P，進(jìn)而利用轉(zhuǎn)酮酶 (Phosphoketolase，PKL)將F6P分解為E4P和乙酰磷酸，之后以乙酰磷酸為直接磷酸供體完成ATP的再生 (圖3)[13]。在將E4P重新轉(zhuǎn)化為F6P的碳重排模塊的協(xié)助下，上述ATP再生模塊每消耗1個(gè)葡萄糖當(dāng)量的麥芽糊精可再生3分子ATP。

圖2 含有多種酶元件的NAD(H)再生模塊

對(duì)于消耗ATP產(chǎn)生單磷酸腺苷 (Adenosine monophosphate，AMP) 的酶元件而言，相應(yīng)的ATP再生模塊需要將AMP轉(zhuǎn)化為ATP[56]。Resnick等構(gòu)建了包含2種酶元件的ATP再生模塊，首先以多聚磷酸為磷酸供體，使用多磷酸AMP磷酸轉(zhuǎn)移酶 (Polyphosphate:AMP phosphotransferase，PPT) 將AMP磷酸化為ADP，之后使用腺苷酸激酶 (Adenylate kinase，ADK) 將2分子ADP轉(zhuǎn)化為1分子ATP和1分子AMP[57]。為了進(jìn)一步提高ATP再生的效率，Kameda等構(gòu)建了PAP-PPK模塊，其中包含2種能夠利用多聚磷酸為磷酸供體的酶元件，將AMP經(jīng)由ADP轉(zhuǎn)化為ATP[52]。該ATP再生模塊與消耗ATP產(chǎn)生AMP的乙酰輔酶A合成酶 (Acetyl-CoA synthase，ACS) 聯(lián)用，實(shí)現(xiàn)了以乙酸和輔酶A為底物的乙酰輔酶A的生產(chǎn)，產(chǎn)物基于輔酶A的得率達(dá)到99.5%。

1.2.3 人工多酶復(fù)合體反應(yīng)模塊

除了輔酶元件，常見的非酶元件還包括用于構(gòu)建人工多酶復(fù)合體反應(yīng)模塊的支架元件、卯榫元件等。這些支架元件和卯榫元件能夠協(xié)助酶元件按照一定的空間結(jié)構(gòu)形成自組裝人工多酶復(fù)合體，產(chǎn)生底物通道效應(yīng) (Substrate channeling)，減少反應(yīng)中間產(chǎn)物的擴(kuò)散，從而展現(xiàn)出高效的催化特性。

基于連接肽這一卯榫元件構(gòu)建而成的融合酶是一種最常見的人工多酶復(fù)合體 (圖4A)。Peters等使用長(zhǎng)度為12–13個(gè)氨基酸殘基的連接肽將烯醇還原酶 (Enoate reductase) 與Baeyer-Villiger單加氧酶 (Baeyer-Villiger-monooxygenase) 組裝成融合酶，并在此基礎(chǔ)上添加游離的醇脫氫酶構(gòu)建成完整的體外多酶分子機(jī)器，將不飽和醇轉(zhuǎn)化為內(nèi)脂 (Lactone)[58]。相比以游離酶元件構(gòu)建而成的多酶分子機(jī)器，含有酶復(fù)合體的多酶分子機(jī)器的產(chǎn)量提高了40%。Fan等使用 (GGGGS)3連接肽將NAD依賴型甲醇脫氫酶 (Methanol dehydrogenase，Mdh) 與6-磷酸己酮糖合成酶 (Hexulose-6-phosphatesynthase，Hps) 及6-磷酸己酮糖異構(gòu)酶 (6-phospho- 3-hexuloisomerase，Phi) 改造為Mdh-Hps-Phi融合酶，其消耗甲醇的max約為游離Mdh的5.7倍，以甲醇為底物生產(chǎn)F6P的反應(yīng)速率約為3種游離酶混合物的1.3倍[59]。

圖3 以丙酮酸、葡萄糖或麥芽糊精為能量來源的ATP再生模塊

卯榫元件的多樣性為人工多酶復(fù)合體的組裝提供了多種策略。例如，亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域 (Leucine zipper domain) 能夠通過coiled-coil相互作用形成二聚體結(jié)構(gòu)[60]，可作為一種卯榫元件與酶元件進(jìn)行融合，從而將多種酶元件組裝成復(fù)合體 (圖4B)。Kim等構(gòu)建了一個(gè)包含3種酶元件的反應(yīng)模塊，利用醇脫氫酶、醛脫氫酶和甲酸脫氫酶的級(jí)聯(lián)反應(yīng)實(shí)現(xiàn)甲醇的完全氧化[42]。每種酶元件的N端都融合了一個(gè)亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域，使得這些酶元件能夠基于coiled-coil相互作用自組裝形成水凝膠結(jié)構(gòu)。與亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域的融合對(duì)醛脫氫酶的催化活性幾乎沒有影響，并提高了醇脫氫酶和甲酸脫氫酶的催化活性。具有親和作用的特定結(jié)構(gòu)域及其配體也可被作為卯榫元件，介導(dǎo)多酶復(fù)合體的組裝 (圖4C)。例如，Price等將SH3結(jié)構(gòu)域及其配體與Hps-Phi融合酶及甲醇脫氫酶分別融合，通過SH3結(jié)構(gòu)域與其配體的親和作用組裝了三酶復(fù)合體，以甲醇和核酮糖5-磷酸為底物生產(chǎn)F6P[61]。與游離酶相比，使用該多酶復(fù)合體使F6P的產(chǎn)量提高了近50倍。

為了使人工多酶復(fù)合體的組裝和催化過程更加可控，研究者們往往將卯榫元件與支架元件聯(lián)用，使多種酶元件在支架元件上進(jìn)行距離可控或順序可控的空間排列。DNA支架元件的穩(wěn)定性強(qiáng)，且可以通過改變DNA鏈的長(zhǎng)度精準(zhǔn)調(diào)控酶元件在支架上的排列間距，是研究多酶復(fù)合體底物通道機(jī)制的重要模型 (圖4D)。例如，Wilner等使用單鏈DNA自組裝成內(nèi)含多個(gè)六邊形的帶狀結(jié)構(gòu)，之后通過化學(xué)交聯(lián)的方式將辣根過氧化物酶 (Horseradish peroxidase，HRP)、葡萄糖脫氫酶以及輔酶NAD+共固定在DNA支架上，大幅度提高了反應(yīng)速率[62]。Ngo等在木糖還原酶 (Xylose reductase，XR) 和木糖醇脫氫酶 (Xylitol dehydrogenase，XDH) 2種酶元件上分別融合了不同的DNA結(jié)合蛋白 (DNA-binding protein) 作為卯榫元件，從而將酶元件固定在DNA折紙結(jié)構(gòu) (DNA origami) 上形成雙酶復(fù)合體，以木糖為底物生產(chǎn)木酮糖[63]。酶元件在DNA支架上的距離被認(rèn)為是影響該雙酶復(fù)合體催化效率的決定性因素。

與DNA支架相比，蛋白支架的成本更加低廉，更適合被應(yīng)用于體外多酶分子機(jī)器進(jìn)行生物化學(xué)品的生產(chǎn)。最為廣泛研究的蛋白支架是由多個(gè)黏連蛋白 (Cohesin) 通過連接肽進(jìn)行融合制作而成 (圖4E)。融合了錨定蛋白 (Dockerin) 的酶元件可通過黏連蛋白與錨定蛋白之間的特異性親和作用被安裝在蛋白支架上。例如，You等設(shè)計(jì)了含有3種來源于不同嗜熱菌的黏連蛋白的線性支架mini-scaffoldin，將3種熱穩(wěn)酶元件在該蛋白支架上進(jìn)行了有序排列，使其催化速率相比游離酶提高了1個(gè)數(shù)量級(jí)[64]。該支架蛋白mini-scaffoldin上還攜帶有纖維素結(jié)合域 (Cellulose-binding module，CBM)，可與纖維素結(jié)合，實(shí)現(xiàn)多酶復(fù)合體的一步組裝與純化[65]。Chen等以同樣的mini- scaffoldin蛋白支架將包括氫酶在內(nèi)的3種熱穩(wěn)酶元件組裝成人工多酶復(fù)合體，以麥芽糊精為底物進(jìn)行了氫氣的生產(chǎn)[66]。與游離酶相比，該多酶復(fù)合體在70 ℃具有相似的穩(wěn)定性，但能將反應(yīng)速率提升2.5倍。Liu等將含有3種黏連蛋白的支架展示在酵母細(xì)胞表面，將醇脫氫酶、甲醛脫氫酶和甲酸脫氫酶有序地組裝成為復(fù)合體，使NADH的生產(chǎn)速率提高了5倍[67]。其他具有親和作用的卯榫元件也可被用于蛋白支架的構(gòu)建。例如，Yu等設(shè)計(jì)了包含3個(gè)卯榫元件的IPa-IPb-IPc線性蛋白支架，進(jìn)而通過IPA/IPa、IPB/IPb、IPC/IPc這 3組卯榫蛋白元件的相互作用構(gòu)建了包含3種纖維素酶的復(fù)合體，并通過調(diào)整3種纖維素酶在蛋白支架上的排列順序，進(jìn)一步提高了纖維素分解的效率[68]。

圖4 人工多酶復(fù)合體的組裝策略

具有平面型空間結(jié)構(gòu)的蛋白支架元件也可以被用于人工多酶復(fù)合體的組裝。例如，Zhang等利用可自組裝成六邊形片狀結(jié)構(gòu)的腸道沙門氏菌殼蛋白 (Shell protein) 作為支架元件，并將殼蛋白與卯榫元件SpyCatcher融合，繼而通過SpyTag/SpyCatcher卯榫元件的共價(jià)相互作用構(gòu)建了雙酶復(fù)合體，將()-2-己醇 (()-2-hexanol) 轉(zhuǎn)化為()-2-氨基己烷 (()-2- aminohexane)[69]。與游離酶相比，該雙酶復(fù)合體使反應(yīng)達(dá)到90%底物轉(zhuǎn)化率的時(shí)間縮短了50%。Hirakawa等使用具有空心環(huán)狀結(jié)構(gòu)的增殖細(xì)胞核抗原 (Proliferating cell nuclear antigen，PCNA) 作為蛋白支架，將細(xì)菌細(xì)胞色素P450 (Cytochrome P450)、鐵氧還蛋白 (Ferredoxin)以及鐵氧還蛋白還原酶 (Ferredoxin reductase) 分別與異源三聚體PCNA的3個(gè)亞基經(jīng)由連接肽融合，從而基于PCNA蛋白支架的自組裝形成了人工三酶復(fù)合體，將反應(yīng)速率提升了2個(gè)數(shù)量級(jí)[70]。

上述研究證明了人工多酶復(fù)合體在提升反應(yīng)效率方面具有很高的應(yīng)用價(jià)值和潛力。在未來的研究中，人工多酶復(fù)合體可作為一個(gè)獨(dú)立的反應(yīng)模塊被整合于更為復(fù)雜的體外多酶分子機(jī)器中，以提升多酶分子機(jī)器反應(yīng)系統(tǒng)的整體效率。

2 體外多酶分子機(jī)器各組分的適配

構(gòu)成同一體外多酶分子機(jī)器的各生物元件在輔酶偏好性、催化活性、最適溫度和pH、熱穩(wěn)定性等方面都可能存在差異。過于顯著的元件性質(zhì)差異將導(dǎo)致反應(yīng)系統(tǒng)不能很好地適配，從而影響體外多酶分子機(jī)器的催化效率。因此，實(shí)現(xiàn)體外多酶分子機(jī)器各組分之間的適配是提升反應(yīng)系統(tǒng)運(yùn)行效率的重要前提。

本節(jié)主要從輔酶相關(guān)的系統(tǒng)適配、酶元件的催化功能改造與系統(tǒng)適配以及體外多酶分子機(jī)器物質(zhì)流瓶頸的確認(rèn)與解除這3個(gè)方面對(duì)目前的研究現(xiàn)狀進(jìn)行詳細(xì)介紹。

2.1 輔酶相關(guān)的系統(tǒng)適配

2.1.1 氧化還原酶的輔酶偏好性改造

體外多酶分子機(jī)器有時(shí)包含多種氧化還原酶元件及相應(yīng)的輔酶元件。其中，煙酰胺類輔酶NADP(H) 和NAD(H) 是生命體氧化還原過程最常見的電子中介體。大多數(shù)氧化還原酶都具有特定的輔酶偏好性[71]。解決酶元件與輔酶元件的適配問題有助于使整個(gè)體外多酶分子機(jī)器協(xié)調(diào)運(yùn)轉(zhuǎn)，實(shí)現(xiàn)高效的生物制造。在1.2.1小節(jié)中所介紹的，利用黃遞酶將反應(yīng)體系中的NADP(H) 與NAD(H) 進(jìn)行相互轉(zhuǎn)化的方法，是對(duì)體外多酶分子機(jī)器中酶元件與輔酶元件進(jìn)行協(xié)調(diào)適配的一種策略[45]。而對(duì)氧化還原酶元件進(jìn)行輔酶偏好性改造則是一種更為常見的實(shí)現(xiàn)酶與輔酶有效適配的方法。

酮醇酸還原異構(gòu)酶 (Keto-acid reductoisomerase，KARI) 通常為NADPH依賴型[72]，在支鏈氨基酸 (Branched-chain amino acids，BCAAs) 等化學(xué)品的生產(chǎn)中發(fā)揮著重要作用[73-75]。Brinkmann-Chen等以KARI為例，通過蛋白序列比對(duì)、蛋白晶體結(jié)構(gòu)分析等手段，總結(jié)出轉(zhuǎn)換此類酶的輔酶偏好性的通用方法[76]。經(jīng)改造后的NADH依賴型KARI能夠與產(chǎn)生NADH的反應(yīng)模塊 (如常見的糖酵解模塊) 相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)BCAA的生產(chǎn)。

為了降低生產(chǎn)成本，用于構(gòu)建體外多酶分子機(jī)器的酶元件通常只經(jīng)由熱處理或鎳柱親和純化等簡(jiǎn)單的處理即投入使用，導(dǎo)致酶元件中不可避免地含有少量雜質(zhì)。提升體外多酶分子機(jī)器的反應(yīng)溫度有助于減少雜質(zhì)導(dǎo)致的副反應(yīng)，提高產(chǎn)品得率，但對(duì)元件的穩(wěn)定性提出了更高的要求。相對(duì)于NADP，NAD的價(jià)格較低且相對(duì)穩(wěn)定[5,77-78]。將天然依賴NADP的具有熱穩(wěn)定性的酶元件改造為NAD依賴型，有助于酶元件和整個(gè)體外多酶分子機(jī)器穩(wěn)定性的提升。Chen等比較和分析了多種NADP+和NAD+依賴型的6-葡萄糖酸脫氫酶 (6-phosphogluconate dehydrogenase，6PGDH) 的氨基酸序列，并借助計(jì)算機(jī)模擬分子對(duì)接的技術(shù)研究了酶和輔酶之間的相互作用，確認(rèn)了與NADP+磷酸基團(tuán)相互作用的氨基酸殘基并將其進(jìn)行理性設(shè)計(jì)，從而成功將來源于極端嗜熱的海棲熱袍菌的6PGDH由NADP+依賴型改造成為NAD+依賴型[79]。6PGDH是磷酸戊糖途徑 (Pentose phosphate pathway，PPP) 中的一部分，為了構(gòu)建一個(gè)穩(wěn)定的NAD依賴型的磷酸戊糖人工反應(yīng)模塊，Kim等又對(duì)磷酸戊糖途徑中的另一個(gè)氧化還原酶——葡萄糖6-磷酸脫氫酶 (Glucose 6-phosphate dehydrogenase，G6PDH) 進(jìn)行了輔酶偏好性改造，將來源于的G6PDH由NADP+依賴型改造為NAD+依賴型，從而實(shí)現(xiàn)了磷酸戊糖人工反應(yīng)模塊中的輔酶適 配[80]。該反應(yīng)模塊被應(yīng)用于以淀粉為能量來源的體外多酶分子機(jī)器，能夠在80 ℃條件下高效催化水分解產(chǎn)生氫氣。

2.1.2 輔酶濃度的智能調(diào)控

在構(gòu)建含有輔酶元件的體外多酶分子機(jī)器時(shí)，常規(guī)的策略是通過合理的反應(yīng)路徑設(shè)計(jì)，達(dá)到理想狀態(tài)下輔酶消耗與再生的化學(xué)計(jì)量數(shù)平衡。然而，體外多酶分子機(jī)器的實(shí)際運(yùn)作過程往往伴隨一些消耗輔酶的副反應(yīng)，如NADH的自發(fā)性氧 化[9]、ATP的自發(fā)性水解，以及難以完全去除的ATP水解酶對(duì)ATP的消耗[81]等。這些副反應(yīng)導(dǎo)致了輔酶的實(shí)際消耗量大于理論值。因此，在體外多酶分子機(jī)器長(zhǎng)時(shí)間運(yùn)轉(zhuǎn)后往往會(huì)出現(xiàn)體系中輔酶濃度逐漸降低的狀況，影響了反應(yīng)效率。針對(duì)ATP降解的問題，Opgenorth等基于變阻器的思路設(shè)計(jì)了一個(gè)ATP調(diào)控模塊 (ATP rheostat) (圖5A)[81]。 該調(diào)控模塊包含2個(gè)獨(dú)立的反應(yīng)分支，均能將反應(yīng)的中間產(chǎn)物甘油醛3-磷酸 (Glyceraldehyde 3-phosphate，G3P) 轉(zhuǎn)化為下游反應(yīng)所需的3-磷酸甘油酸 (3-phosphoglycerate，3PG)。其中一個(gè)反應(yīng)分支僅包含1種不能進(jìn)行磷酸化的磷酸甘油醛脫氫酶 (Nonphosphorylating glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GapN)，在將G3P轉(zhuǎn)化為3PG的同時(shí)生成下游反應(yīng)所需的NAPDH，該反應(yīng)并不產(chǎn)生ATP；另一個(gè)反應(yīng)分支包含可進(jìn)行磷酸化的磷酸甘油醛脫氫酶 (Phosphorylating glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，mGapDH) 和磷酸甘油酸激酶 (Phosphoglycerate kinase，PGK)，在這2個(gè)酶的作用下，將G3P經(jīng)由1,3-二磷酸甘油酸 (1,3- bisphosphoglycerate，1,3-BPG) 轉(zhuǎn)化為3PG并產(chǎn)生NADPH，同時(shí)將ADP和無機(jī)磷再生為ATP。多酶分子機(jī)器中的磷濃度是決定該ATP調(diào)控模塊運(yùn)行方式的因素：當(dāng)磷濃度較低時(shí)，GapN支路發(fā)揮作用進(jìn)行NADPH的生產(chǎn)，該反應(yīng)模塊并無ATP生成；當(dāng)ATP經(jīng)由副反應(yīng)水解導(dǎo)致體系中磷濃度升高時(shí)，mGapDH/PGK支路被啟用，產(chǎn)生額外的ATP以彌補(bǔ)損耗，從而將體外多酶分子機(jī)器中的ATP濃度長(zhǎng)時(shí)間維持在一個(gè)恒定的水平，大幅度提高了產(chǎn)品的生成量。

在構(gòu)建體外多酶分子機(jī)器的過程中，有時(shí)難以通過簡(jiǎn)單的路徑設(shè)計(jì)達(dá)到輔酶消耗與再生的化學(xué)計(jì)量數(shù)平衡。例如在Opgenorth等設(shè)計(jì)的以丙酮酸為底物的聚羥基丁酸酯 (Polyhydroxybutyrate，PHB) 合成途徑中，丙酮酸脫氫酶 (Pyruvate dehydrogenase，PDH) 將1分子丙酮酸、1分子輔酶A以及1分子NADP+轉(zhuǎn)化為1分子乙酰輔酶A和1分子NADPH；乙酰輔酶A和NADPH進(jìn)而被下游的PHB合成模塊以2︰1的化學(xué)計(jì)量數(shù)所利用，即每消耗1分子乙酰輔酶A僅再生1/2分子的NADP+，使整個(gè)體外多酶分子機(jī)器在長(zhǎng)時(shí)間運(yùn)行過程中出現(xiàn)NADPH的積累[9]。針對(duì)該問題，研究者們?cè)O(shè)計(jì)了一個(gè)維持體外多酶分子機(jī)器內(nèi)部NADP+與NADPH平衡的控制閥模塊 (Purge valve module) (圖5B)。該控制閥模塊包含3種酶元件，分別為依賴NADP+的突變型PDH，依賴NAD+的野生型PDH，以及僅能消耗NADH的NADH氧化酶 (NADH oxidase，NoxE)。當(dāng)系統(tǒng)中NADPH/NADP+比值較低的時(shí)候，控制閥處于關(guān)閉狀態(tài)，NADP+依賴型的PDH正常發(fā)揮功能生成乙酰輔酶A，同時(shí)產(chǎn)生NADPH；當(dāng)系統(tǒng)中NADPH/NADP+比值升高時(shí)，控制閥被打開，NADPH依賴型PDH的活性受到高濃度NADPH的抑制，乙酰輔酶A的生產(chǎn)由NADH依賴型PDH完成，而NoxE消耗了所產(chǎn)生的NADH，既保證了系統(tǒng)中NAD+的再生，又避免了無用的NADH的積累。該控制閥模塊為體外多酶分子機(jī)器的反應(yīng)路徑設(shè)計(jì)提供了更靈活的思路。

2.1.3 人工仿生輔酶元件的創(chuàng)制及應(yīng)用

人工仿生輔酶 (Biomimetic cofactors) 元件的創(chuàng)制，有望進(jìn)一步提高輔酶的穩(wěn)定性并降低其成本[77,82]，從而為基于酶元件催化的生物制造模式帶來更廣闊的工業(yè)化前景。此外，通過改造特定的酶元件使其偏好人工輔酶，可以將相應(yīng)的酶催化反應(yīng)與體外多酶分子機(jī)器中其他消耗天然輔酶的酶催化反應(yīng)分離開來，有利于生物催化過程的精準(zhǔn)調(diào)控[83]。

煙酰胺類人工仿生輔酶是目前研究的熱點(diǎn)。基于天然存在的NAD和NADP (圖6A)，目前人們已創(chuàng)制出多種煙酰胺類人工仿生輔酶元件 (圖6B)，并對(duì)酶元件進(jìn)行了改造，以實(shí)現(xiàn)其與人工仿生輔酶的有效適配。Ji等以非天然的氟胞嘧啶 (Flucytosine) 取代天然輔酶NAD中的腺嘌呤部分，創(chuàng)制出NAD的類似物煙酰胺氟代胞嘧啶二核苷酸 (Nicotinamide flucytosine dinucleotide，NFCD)，并通過定點(diǎn)飽和突變的方式改造出偏好NFCD的蘋果酸脫氫酶 (Malate dehydrogenase) 和乳酸脫氫酶[83]。這兩種突變酶元件的組合形成了1個(gè)將蘋果酸轉(zhuǎn)化為乳酸，同時(shí)實(shí)現(xiàn)NFCD循環(huán)的簡(jiǎn)單反應(yīng)模塊。在后續(xù)的研究中，Ji等又將NFCD中的氟原子分別以氯原子、溴原子或甲基取代，創(chuàng)制出更多人工仿生輔酶元件，以及偏好這些人工仿生輔酶元件的突變型蘋果酸酶 (Malic enzyme)[84]。相比由野生型蘋果酸酶與NAD組合而成的反應(yīng)模塊，由突變型蘋果酸酶與人工仿生輔酶元件組合而成的反應(yīng)模塊具有更高的催化效率 (cat/m)。Liu等通過半理性設(shè)計(jì)的方式，改造出偏好另一人工仿生輔酶——煙酰胺胞嘧啶二核苷酸 (Nicotinamide cytosine dinucleotide，NCD) 的亞磷酸脫氫酶，并解析了突變酶與NCD的結(jié)合機(jī)制[85]。在對(duì)酶元件利用天然輔酶的能力進(jìn)行改造時(shí)，也可能同時(shí)獲得對(duì)人工仿生輔酶具有催化活性的突變體酶元件。例如，Campbell等對(duì)來自極端嗜熱菌.的醇脫氫酶的輔酶結(jié)合口袋進(jìn)行了理性改造，使其對(duì)NAD和NADP的催化活性都得到了提升[86]，并發(fā)現(xiàn)改造后的醇脫氫酶能夠利用人工仿生輔酶煙酰胺單核苷酸(Nicotinamide mononucleotide，NMN) 進(jìn)行催化[87]。Maurer等將細(xì)胞色素P450的2個(gè)氨基酸殘基進(jìn)行突變，使該細(xì)胞色素P450從NADPH偏好型轉(zhuǎn)變?yōu)镹ADH偏好型[88]。而Ryan等發(fā)現(xiàn)經(jīng)改造后的該細(xì)胞色素P450還獲得了利用人工仿生輔酶1-芐基- 1,4二氫煙酰胺 (-benzyl-1,4-dihydronicotinamide，BNA) 進(jìn)行催化的能力[89]。

由于多數(shù)人工仿生輔酶與天然輔酶存在較明顯的結(jié)構(gòu)差異，對(duì)人工仿生輔酶的創(chuàng)制與開發(fā)利用仍處于初期研究階段，面臨諸多挑戰(zhàn)[87]。未來我們需要?jiǎng)?chuàng)制更多穩(wěn)定性高、價(jià)格低廉的人工輔酶，并對(duì)相應(yīng)的酶元件進(jìn)行輔酶偏好性改造，進(jìn)而將人工仿生輔酶與相適配的酶元件應(yīng)用于更復(fù)雜的體外多酶分子機(jī)器反應(yīng)系統(tǒng)中，充分發(fā)揮其優(yōu)勢(shì)。

圖5 能夠智能調(diào)控輔酶濃度的反應(yīng)模塊

圖6 天然煙酰胺輔酶與人工仿生煙酰胺輔酶的結(jié)構(gòu)

2.2 酶元件的催化功能改造與系統(tǒng)適配

天然酶元件有時(shí)無法高效完成特定的催化反應(yīng)，因此需要對(duì)酶元件的催化功能進(jìn)行改造，實(shí)現(xiàn)其與所設(shè)計(jì)的體外多酶分子機(jī)器的適配。Lu等設(shè)計(jì)了僅利用3種酶元件即可將甲醛經(jīng)由糖醛 (Glycoaldehyde) 和乙酰磷酸最終轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A的全新反應(yīng)模塊[90]。在該反應(yīng)模塊的基礎(chǔ)上，可添加上游反應(yīng)的相應(yīng)酶元件，實(shí)現(xiàn)二氧化碳、甲烷、甲醇等一碳化合物的固定，也可添加下游反應(yīng)的相應(yīng)酶元件將乙酰輔酶A進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為蛋白質(zhì)、糖類等高值化學(xué)品。為了獲得能夠催化模塊中第一步反應(yīng) (將2分子甲醛縮合為1分子糖醛) 的酶元件，研究者們根據(jù)天然輔酶元件二磷硫酸銨 (Thiamine diphosphate，ThDP) 協(xié)助催化醛類形成二聚物的催化機(jī)理創(chuàng)建出theozyme模型，基于模型中ThDP的C2原子與產(chǎn)物糖醛的距離對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)中ThDP依賴型的天然酶元件進(jìn)行了篩選，并對(duì)其中活性相對(duì)最高的酶元件進(jìn)行了定向進(jìn)化改造，使其將甲醛轉(zhuǎn)化為糖醛的活性提高了近70倍，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)了整個(gè)反應(yīng)模塊的順利運(yùn)行，為未來以一碳化合物為底物高效生產(chǎn)高值化學(xué)品提供了新的思路。

根據(jù)熱力學(xué)分析，將L-阿拉伯糖 (L-arabinose)轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-核酮糖 (L-ribulose) 的單酶催化反應(yīng)是難以進(jìn)行的。為了實(shí)現(xiàn)從L-阿拉伯糖到L-核酮糖的高效轉(zhuǎn)化，Chuaboon等設(shè)計(jì)了包含2種酶元件的反應(yīng)模塊，將L-阿拉伯糖經(jīng)由keto-arabinose轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-核酮糖[91]。在該反應(yīng)模塊中，糖氧化酶催化第一步反應(yīng)，過程需要消耗氧氣，因此可以通過提高氧氣供應(yīng)的方式推動(dòng)整個(gè)反應(yīng)模塊的運(yùn)行。使該反應(yīng)模塊順利運(yùn)行的關(guān)鍵在于獲得一個(gè)對(duì)L-阿拉伯糖具有較高底物特異性的糖氧化酶。研究者們通過理性設(shè)計(jì)，將偏好以六碳糖為底物的天然吡喃糖2-氧化酶 (Pyranose 2-oxidase，P2O)改造為偏好L-阿拉伯糖的突變體，從而實(shí)現(xiàn)了其與下游酶元件的適配。在這個(gè)反應(yīng)模塊的基礎(chǔ)上，研究者們進(jìn)一步添加了基于甲酸脫氫酶的NADPH再生模塊，以及用于消耗突變體P2O反應(yīng)副產(chǎn)物的過氧化氫酶 (Catalase) 元件，組成了一個(gè)能夠更持久運(yùn)行的體外多酶分子機(jī)器反應(yīng)系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了從L-阿拉伯糖到L-核酮糖的完全轉(zhuǎn)化。

2.3 物質(zhì)流瓶頸的確認(rèn)與解除

相對(duì)于微生物細(xì)胞工廠，體外多酶分子機(jī)器的反應(yīng)路徑和組成成分相對(duì)簡(jiǎn)單，因此更易于尋找制約反應(yīng)效率提升的關(guān)鍵因素。Su等構(gòu)建了含有7種酶元件的體外多酶分子機(jī)器，以蔗糖 (Sucrose)為底物生產(chǎn)葡萄糖酸 (Glucaric acid，GA)[92]。在確認(rèn)了該體外多酶分子機(jī)器的最適運(yùn)行溫度、pH、底物濃度、緩沖液類型等條件后，研究者們采用了若干實(shí)驗(yàn)方法，包括：1) 控制單一變量，每次降低1種酶元件的濃度，并檢測(cè)產(chǎn)物GA的得率； 2) 測(cè)試產(chǎn)物GA對(duì)各個(gè)酶元件的抑制作用；3) 測(cè)試各個(gè)酶元件的穩(wěn)定性，從而尋找到該體外多酶分子機(jī)器中的限速酶元件，繼而通過提高限速酶的濃度以及在反應(yīng)過程中流加限速酶的手段，解除了物質(zhì)流瓶頸，使GA的產(chǎn)量得到進(jìn)一步提升。

隨著生物信息學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，計(jì)算機(jī)模擬分析 (analysis) 已成為實(shí)現(xiàn)體外多酶分子機(jī)器體系適配的重要輔助手段。Zhong等設(shè)計(jì)了一個(gè)包含3種酶元件、將蔗糖轉(zhuǎn)化為纖維二糖 (Cellobiose) 的體外多酶分子機(jī)器，并建立了相應(yīng)的動(dòng)力學(xué)模型，用于預(yù)測(cè)3種酶元件之間的最優(yōu)比例等反應(yīng)條件，繼而在模擬結(jié)果的指導(dǎo)下進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)[93]。計(jì)算機(jī)模擬也可以被用于預(yù)測(cè)更為復(fù)雜的體外多酶分子機(jī)器反應(yīng)系統(tǒng)的適配條件，大幅度減少實(shí)驗(yàn)工作量。例如，Korman等設(shè)計(jì)了包含5個(gè)反應(yīng)模塊、20余種酶元件、將葡萄糖轉(zhuǎn)化為單萜類化合物 (Monoterpenes) 的體外多酶分子機(jī)器，并使用COPASI軟件[94]建立了該多酶分子機(jī)器的動(dòng)力學(xué)模型，預(yù)測(cè)出限制反應(yīng)效率的關(guān)鍵因素，進(jìn)而在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，實(shí)現(xiàn)了單萜類化合物的高效生產(chǎn)[95]。

在完善體外多酶分子機(jī)器運(yùn)行效率的過程中，有時(shí)需要人為設(shè)置限速步驟，以實(shí)現(xiàn)各個(gè)酶元件的適配。例如，在上述以葡萄糖為底物生產(chǎn)單萜類化合物的體外多酶分子機(jī)器中，處于反應(yīng)路徑最上游的己糖激酶 (Hexokinase，Hex) 和處于相對(duì)下游的磷酸果糖激酶 (Phosphofructokinase) 都需要消耗ATP進(jìn)行反應(yīng)[95]。為了防止反應(yīng)系統(tǒng)上游的Hex反應(yīng)速度過快將反應(yīng)系統(tǒng)中的ATP耗盡，研究者們通過限制Hex的添加量，實(shí)現(xiàn)了體外多酶分子機(jī)器中2種消耗ATP的酶元件的適配。

產(chǎn)物抑制是制約體外多酶分子機(jī)器效率的因素之一。Busto等構(gòu)建了包含3種酶元件的體外多酶分子機(jī)器，將酚類衍生物轉(zhuǎn)化為對(duì)映異構(gòu)純的對(duì)羥基苯基乳酸 (-hydroxyphenyl lactic acid)[15]。在概念實(shí)驗(yàn)中，產(chǎn)物得率僅為24%。研究者們通過改變底物濃度、改變氧氣含量、額外添加最終產(chǎn)物進(jìn)而分析產(chǎn)品得率的方法，對(duì)該體外多酶分子機(jī)器的適配性進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)反應(yīng)終產(chǎn)物對(duì)多酶分子機(jī)器中催化第一步反應(yīng)的酶元件有抑制作用。為了克服產(chǎn)物抑制，研究者們采用了一鍋式分階段反應(yīng)，首先向反應(yīng)體系中加入進(jìn)行第一步催化反應(yīng)的酶元件，待其完成反應(yīng)后再添加下游酶元件，從而將產(chǎn)品得率提升至58%–85%。

除了克服產(chǎn)物抑制，分階段反應(yīng)的策略也可被用于解決體外多酶分子機(jī)器中某些酶元件穩(wěn)定性差的問題。Tian等構(gòu)建了利用4–5種酶元件將蔗糖轉(zhuǎn)化為棉子糖 (Raffinose) 或水蘇糖 (Stachyose) 的體外多酶分子機(jī)器，其中，反應(yīng)路徑最下游的 2種酶元件在30 ℃反應(yīng)36 h后活性顯著下降[96]。改進(jìn)后的體外多酶分子機(jī)器仍然采用一鍋式反應(yīng)，但包含2個(gè)反應(yīng)階段：在第一階段，反應(yīng)路徑上游幾種較為穩(wěn)定的酶元件首先進(jìn)行反應(yīng)，積累大量可被用于后續(xù)反應(yīng)的中間產(chǎn)物；在第二階段，較不穩(wěn)定的2種下游酶元件被添加入反應(yīng)體系中。這種分階段反應(yīng)的方法使產(chǎn)物棉子糖的得率提高了4.2倍。Meng等設(shè)計(jì)的一鍋法以纖維多糖 (Cellodextrin) 為底物生產(chǎn)肌醇 (Inositol) 的體外多酶分子機(jī)器存在各個(gè)酶元件的最適反應(yīng)溫度并不一致的問 題[97]。反應(yīng)路徑上游的3種酶元件的最適溫度為55 ℃，而下游的另外3種熱穩(wěn)酶元件均具有更高的最適溫度，其中反應(yīng)路徑下游的肌醇1-磷酸合成酶 (Inositol 1-phosphate synthase，IPS) 只有在溫度超過60 ℃時(shí)才有較高酶活。為了提高肌醇的得率，研究者們?cè)?5 ℃的起始條件下進(jìn)行一鍋式反應(yīng)，并對(duì)反應(yīng)中間產(chǎn)物濃度隨時(shí)間的變化進(jìn)行了檢測(cè)，從而確定在反應(yīng)進(jìn)行8 h后將溫度提升至70 ℃以解除IPS的催化瓶頸，最終達(dá)到了接近100%的肌醇得率。分階段進(jìn)行反應(yīng)的方法保證了整個(gè)體外多酶分子機(jī)器的穩(wěn)定性與適配性，是一種提高產(chǎn)品得率的有效策略。

納米材料是提升體外多酶分子機(jī)器運(yùn)行效率和系統(tǒng)穩(wěn)定性的潛在工具。以固定二氧化碳的體外多酶分子機(jī)器為例，該分子機(jī)器包含甲酸脫氫酶、甲醛脫氫酶和醇脫氫酶，將二氧化碳經(jīng)由甲酸和甲醛最終還原為甲醇。熱力學(xué)性質(zhì)分析表明，該系統(tǒng)中的甲酸脫氫酶和甲醛脫氫酶所催化的反應(yīng)并不偏好于生產(chǎn)目標(biāo)產(chǎn)品，然而研究人員認(rèn)為將上述酶元件共同固定在具有孔狀結(jié)構(gòu)的納米材質(zhì)中，有助于提高反應(yīng)中間產(chǎn)物的局部濃度，從而提升該多酶分子機(jī)器的反應(yīng)效率[98]。Wang等設(shè)計(jì)了基于納米硅顆粒和鄰苯二酚修飾的明膠的雙層微囊結(jié)構(gòu)，使上述3種酶元件依次分布于微囊空腔、微囊內(nèi)層和微囊外層[99]。與游離酶相比 (甲醇基于NADH的得率為35.5%)，該微囊結(jié)構(gòu)使甲醇的得率提升至71.6%。在9次循環(huán)使用后，基于微囊結(jié)構(gòu)的體外多酶分子機(jī)器的甲醇得率仍可達(dá)到52.6%，表明該納米微囊結(jié)構(gòu)的構(gòu)建可提高體外多酶分子機(jī)器的重復(fù)利用效率，降低生產(chǎn)成本。Ji等將上述3種酶元件和用于NADH再生的谷氨酸脫氫酶共同包裹在摻雜了聚丙烯胺鹽酸鹽 (Poly(allylamine hydrochloride)，PAH) 的聚氨酯中空納米纖維內(nèi)，并利用PAH與NADH之間的靜電作用將NADH穩(wěn)定地吸附于中空納米纖維的內(nèi)壁，同時(shí)在納米纖維外表面固定了碳酸酐酶，從而將甲醇基于NADH的得率提升至103.2%[100]。這個(gè)包含酶和輔酶元件的中空納米纖維結(jié)構(gòu)在10次重復(fù)使用后仍保有80%的催化活性。盡管上述基于納米材料和結(jié)構(gòu)的體外多酶分子機(jī)器僅能產(chǎn)生μmol/L濃度級(jí)別的甲醇，納米材料仍不失為一種改進(jìn)體外多酶分子機(jī)器性能的有效手段，有望在未來得到更廣泛的應(yīng)用。

3 總結(jié)與展望

體外多酶分子機(jī)器具有不需維持細(xì)胞的生長(zhǎng)、反應(yīng)路徑明確、副反應(yīng)少、無細(xì)胞膜的阻礙、生產(chǎn)過程具有高度可調(diào)控性等特點(diǎn)，是高效生產(chǎn)目標(biāo)化合物的重要手段。體外多酶分子機(jī)器作為一個(gè)強(qiáng)大的生物制造平臺(tái)，具有廣闊的應(yīng)用前景。例如以淀粉為底物生產(chǎn)肌醇的體外多酶分子機(jī)器已被用于工業(yè)規(guī)模的生產(chǎn)[19]，初步展現(xiàn)出這一生物制造平臺(tái)的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。然而，總體來說，體外多酶分子機(jī)器的穩(wěn)定性和系統(tǒng)中元件/模塊的適配性仍是目前亟需改善的兩大最關(guān)鍵的問題。未來體外多酶分子機(jī)器的研究方向和發(fā)展趨勢(shì)是：1) 建立可共享的酶元件、非酶元件以及反應(yīng)模塊數(shù)據(jù)庫(kù)，實(shí)現(xiàn)反應(yīng)路徑的精簡(jiǎn)化、智能化設(shè)計(jì)；2) 繼續(xù)新酶元件的發(fā)掘和對(duì)現(xiàn)有酶元件的改造，以獲得催化活性高、熱穩(wěn)定性良好的新酶元件，并創(chuàng)制成本低廉、穩(wěn)定性高的人工輔酶和蛋白質(zhì)骨架等非酶元件，提升體外多酶分子機(jī)器的穩(wěn)定性；3) 開發(fā)多樣化的有效手段，解決反應(yīng)系統(tǒng)中的元件與模塊適配問題，加快反應(yīng)速度和提升產(chǎn)品得率；4) 建立并完善目標(biāo)化合物的大規(guī)模生產(chǎn)和產(chǎn)物分離純化等相關(guān)技術(shù)，促進(jìn)體外多酶分子機(jī)器的工業(yè)化應(yīng)用。隨著相關(guān)研究的逐漸深入，上述問題有望在未來得到解決，使體外多酶分子機(jī)器這一生物制造平臺(tái)發(fā)揮出更大的潛力，更好地服務(wù)于科學(xué)研究和工業(yè)生產(chǎn)。

[1] Zhang YHP. Production of biocommodities and bioelectricity by cell-free synthetic enzymatic pathway biotransformations: challenges and opportunities. Biotechnol Bioeng, 2010, 105(4): 663–677.

[2] Rollin JA, Martin del Campo J, Myung S, et al. High-yield hydrogen production from biomass by in vitro metabolic engineering: mixed sugars coutilization and kinetic modeling. Proc Natl Acad Sci USA, 2015, 112(16): 4964–4969.

[3] Opgenorth PH, Korman TP, Bowie JU. A synthetic biochemistry module for production of bio-based chemicals from glucose. Nat Chem Biol, 2016, 12(6): 393–395.

[4] Zhang YHP, Myung S, You C, et al. Toward low-cost biomanufacturing throughsynthetic biology: bottom-up design. J Mater Chem, 2011, 21(47): 18877–18886.

[5] Zhang YHP. Production of biofuels and biochemicals bysynthetic biosystems: opportunities and challenges. Biotechnol Adv, 2015, 33(7): 1467–1483.

[6] Qi P, You C, Zhang YHP. One-pot enzymatic conversion of sucrose to synthetic amylose by using enzyme cascades. ACS Catal, 2014, 4(5): 1311–1317.

[7] Kim JE, Zhang YHP. Biosynthesis of D-xylulose 5-phosphate from D-xylose and polyphosphate through a minimized two-enzyme cascade. Biotechnol Bioeng, 2016, 113(2): 275–282.

[8] Zhang YHP. Simpler is better: high-yield and potential low-cost biofuels production through cell-free synthetic pathway biotransformation (SyPaB). ACS Catal, 2011, 1(9): 998–1009.

[9] Opgenorth PH, Korman TP, Bowie JU. A synthetic biochemistry molecular purge valve module that maintains redox balance. Nat Commun, 2014, 5: 4113.

[10] Wang YR, Huang WD, Sathitsuksanoh N, et al. Biohydrogenation from biomass sugar mediated bysynthetic enzymatic pathways. Chem Biol, 2011, 18(3): 372–380.

[11] Schultheisz HL, Szymczyna BR, Scott LG, et al. Enzymaticpyrimidine nucleotide synthesis. J Am Chem Soc, 2011, 133(2): 297–304.

[12] Krutsakorn B, Honda K, Ye XT, et al.production of-butanol from glucose. Metab Eng, 2013, 20: 84–91.

[13] Wei XL, Xie LP, Zhang YHPJ, et al. Stoichiometric regeneration of ATP by a NAD(P)/CoA-free and phosphate-balancedsynthetic enzymatic biosystem. ChemCatChem, 2018, 10(24): 5597–5601.

[14] Valliere MA, Korman TP, Woodall NB, et al. A cell-free platform for the prenylation of natural products and application to cannabinoid production. Nat Commun, 2019, 10(1): 565.

[15] Busto E, Simon RC, Richter N, et al. One-pot, two-module three-step cascade to transform phenol derivatives to enantiomerically pure ()- or ()--hydroxyphenyl lactic acids. ACS Catal, 2016, 6(4): 2393–2397.

[16] Taniguchi H, Okano K, Honda K. Modules formetabolic engineering: pathway assembly for bio-based production of value-added chemicals. Synth Syst Biotechnol, 2017, 2(2): 65–74.

[17] Sperl JM, Sieber V. Multienzyme cascade reactions—status and recent advances. ACS Catal, 2018, 8(3): 2385–2396.

[18] Kim JE, Kim EJ, Chen H, et al. Advanced water splitting for green hydrogen gas production through complete oxidation of starch bymetabolic engineering. Metab Eng, 2017, 44: 246–252.

[19] You C, Shi T, Li YJ, et al. An in vitro synthetic biology platform for the industrial biomanufacturing of myo-inositol from starch. Biotechnol Bioeng, 2017, 114(8): 1855–1864.

[20] Sun SS, Wei XL, You C. The Construction of ansynthetic enzymatic biosystem that facilitates laminaribiose biosynthesis from maltodextrin and glucose. Biotechnol J, 2019, 14(4): 1800493.

[21] Cheng K, Zheng WM, Chen HG, et al. Upgrade of wood sugar D-xylose to a value-added nutraceutical bymetabolic engineering. Metab Eng, 2019, 52: 1–8.

[22] Bogorad IW, Lin TS, Liao JC. Synthetic non-oxidative glycolysis enables complete carbon conservation. Nature, 2013, 502(7473): 693–697.

[23] Chao YP, Patnaik R, Roof WD, et al. Control of gluconeogenic growth by pps and pck in. J Bacteriol, 1993, 175(21): 6939–6944.

[24] Gonzalez R, Murarka A, Dharmadi Y, et al. A new model for the anaerobic fermentation of glycerol in enteric bacteria: trunk and auxiliary pathways in. Metab Eng, 2008, 10(5): 234–245.

[25] Murarka A, Dharmadi Y, Yazdani SS, et al. Fermentative utilization of glycerol byand its implications for the production of fuels and chemicals. Appl Environ Microbiol, 2008, 74(4): 1124–1135.

[26] Gao C, Li Z, Zhang LJ, et al. An artificial enzymatic reaction cascade for a cell-free bio-system based on glycerol. Green Chem, 2015, 17(2): 804–807.

[27] Iwamoto S, Motomura K, Shinoda Y, et al. Use of anrecombinant producing thermostable polyphosphate kinase as an ATP regenerator to produce fructose 1,6-diphosphate. Appl Environ Microbiol, 2007, 73(17): 5676–5678.

[28] Wu H, Tian CY, Song XK, et al. Methods for the regeneration of nicotinamide coenzymes. Green Chem, 2013, 15(7): 1773–1789.

[29] Wu X, Kobori H, Orita I, et al. Application of a novel thermostable NAD(P)H oxidase from hyperthermophilic archaeon for the regeneration of both NAD+and NADP+. Biotechnol Bioeng, 2012, 109(1): 53–62.

[30] Tong XD, El-Zahab B, Zhao XY, et al. Enzymatic synthesis of L-lactic acid from carbon dioxide and ethanol with an inherent cofactor regeneration cycle. Biotechnol Bioeng, 2011, 108(2): 465–469.

[31] Fossati E, Polentini F, Carrea G, et al. Exploitation of the alcohol dehydrogenase-acetone NADP-regeneration system for the enzymatic preparative-scale production of 12-ketochenodeoxycholic acid. Biotechnol Bioeng, 2006, 93(6): 1216–1220.

[32] Wong CH, Whitesides GM. Enzyme-catalyzed organic synthesis: NAD(P)H cofactor regeneration using ethanol/alcohol dehydrogenase/aldehyde dehydrogenase and methanol/alcohol dehydrogenase/aldehyde dehydrogenase/formate dehydrogenase. J Org Chem, 1982, 47(14): 2816–2818.

[33] Bo?i? M, Pricelius S, Guebitz GM, et al. Enzymatic reduction of complex redox dyes using NADH-dependent reductase fromcoupled with cofactor regeneration. Appl Microbiol Biotechnol, 2010, 85(3): 563–571.

[34] Tao RS, Jiang Y, Zhu FY, et al. A one-pot system for production ofL-2-aminobutyric acid fromL-threonine byL-threonine deaminase and a NADH-regeneration system based onL-leucine dehydrogenase and formate dehydrogenase. Biotechnol Lett, 2014, 36(4): 835–841.

[35] Wong CH, Drueckhammer DG, Sweers HM. Enzymatic vs. fermentative synthesis: thermostable glucose dehydrogenase catalyzed regeneration of NAP(P)H for use in enzymatic synthesis. J Am Chem Soc, 1985, 107(13): 4028–4031.

[36] Eguchi T, Kuge Y, Inoue K, et al. NADPH regeneration by glucose dehydrogenase fromfor-leucovorin synthesis. Biosci Biotech Biochem, 1992, 56(5): 701–703.

[37] Xu ZN, Jing KJ, Liu Y, et al. High-level expression of recombinant glucose dehydrogenase and its application in NADPH regeneration. J Ind Microbiol Biotechnol, 2007, 34(1): 83–90.

[38] Johannes TW, Woodyer RD, Zhao HM. Directed evolution of a thermostable phosphite dehydrogenase for NAD(P)H regeneration. Appl Environ Microbiol, 2005, 71(10): 5728–5734.

[39] Relyea HA, van der Donk WA. Mechanism and applications of phosphite dehydrogenase. Bioorg Chem, 2005, 33(3): 171–189.

[40] Mertens R, Liese A. Biotechnological applications of hydrogenases. Curr Opin Biotechnol, 2004, 15(4): 343–348.

[41] Eberly JO, Ely RL. Thermotolerant hydrogenases: biological diversity, properties, and biotechnological applications. Crit Rev Microbiol, 2008, 34(3/4): 117–130.

[42] Kim YH, Campbell E, Yu J, et al. Complete oxidation of methanol in biobattery devices using a hydrogel created from three modified dehydrogenases. Angew Chem Int Ed, 2013, 52(5): 1437–1440.

[43] Ma K, Weiss R, Adams MWW. Characterization of hydrogenase II from the hyperthermophilic archaeonand assessment of its role in sulfur reduction. J Bacteriol, 2000, 182(7): 1864–1871.

[44] Mertens R, Greiner L, van den Ban ECD, et al. Practical applications of hydrogenase I fromfor NADPH generation and regeneration. J Mol Catal B: Enzym, 2003, 24–25: 39–52.

[45] Song YH, Liu MX, Xie LP, et al. A recombinant 12-His taggedsoluble [NiFe]-hydrogenase I overexpressed inKOD1 facilitates hydrogen-poweredNADH regeneration. Biotechnol J, 2019, 14(4): 1800301.

[46] Ye XT, Honda K, Sakai T, et al. Synthetic metabolic engineering-a novel, simple technology for designing a chimeric metabolic pathway. Microb Cell Fact, 2012, 11: 120.

[47] Honda K, Hara N, Cheng M, et al.metabolic engineering for the salvage synthesis of NAD+. Metab Eng, 2016, 35: 114–120.

[48] Liu S, Li Y, Zhu J. Enzymatic production ofL-theanine by γ-glutamylmethylamide synthetase coupling with an ATP regeneration system based on polyphosphate kinase. Process Biochem, 2016, 51(10): 1458–1463.

[49] Meng QL, Zhang YF, Ju XZ, et al. Production of 5-aminolevulinic acid by cell free multi-enzyme catalysis. J Biotechnol, 2016, 226: 8–13.

[50] Cao H, Li CC, Zhao J, et al. Enzymatic production of glutathione coupling with an ATP regeneration system based on polyphosphate kinase. Appl Biochem Biotechnol, 2018, 185(2): 385–395.

[51] Zhang X, Wu H, Huang B, et al. One-pot synthesis of glutathione by a two-enzyme cascade using a thermophilic ATP regeneration system. J Biotechnol, 2017, 241: 163–169.

[52] Kameda A, Shiba T, Kawazoe Y, et al. A novel ATP regeneration system using polyphosphate-AMP phosphotransferase and polyphosphate kinase. J Biosci Bioeng, 2001, 91(6): 557–563.

[53] Wang W, Liu MX, You C, et al. ATP-free biosynthesis of a high-energy phosphate metabolite fructose 1,6-diphosphate bymetabolic engineering. Metab Eng, 2017, 42: 168–174.

[54] Kim DM, Swartz JR. Regeneration of adenosine triphosphate from glycolytic intermediates for cell-free protein synthesis. Biotechnol Bioeng, 2001, 74(4): 309–316.

[55] Wang YR, Zhang YHP. Cell-free protein synthesis energized by slowly-metabolized maltodextrin. BMC Biotechnol, 2009, 9: 58.

[56] Kitabatake S, Dombou M, Tomioka I, et al. Synthesis of P1, P4-di(adenosine 5′-) tetraphosphate by leucyl-tRNA synthetase, coupled with ATP regeneration. Biochem Biophys Res Commun, 1987, 146(1): 173–178.

[57] Resnick SM, Zehnder AJB.ATP regeneration from polyphosphate and AMP by polyphosphate: AMP phosphotransferase and adenylate kinase from210A. Appl Environ Microbiol, 2000, 66(5): 2045–2051.

[58] Peters C, Rudroff F, Mihovilovic MD, et al. Fusion proteins of an enoate reductase and a Baeyer-Villiger monooxygenase facilitate the synthesis of chiral lactones. Biol Chem, 2017, 398(1): 31–37.

[59] Fan LW, Wang Y, Tuyishime P, et al. Engineering artificial fusion proteins for enhanced methanol bioconversion. ChemBioChem, 2018, 19(23): 2465–2471.

[60] Landschulz WH, Johnson PF, McKnight SL. The leucine zipper: a hypothetical structure common to a new class of DNA binding proteins. Science, 1988, 240(4860): 1759–1764.

[61] Price JV, Chen L, Whitaker WB, et al. Scaffoldless engineered enzyme assembly for enhanced methanol utilization. Proc Natl Acad Sci USA, 2016, 113(45): 12691–12696.

[62] Wilner OI, Weizmann Y, Gill R, et al. Enzyme cascades activated on topologically programmed DNA scaffolds. Nat Nanotechnol, 2009, 4(4): 249–254.

[63] Ngo TA, Nakata E, Saimura M, et al. Spatially organized enzymes drive cofactor-coupled cascade reactions. J Am Chem Soc, 2016, 138(9): 3012–3021.

[64] You C, Myung S, Zhang YHP. Facilitated substrate channeling in a self-assembled trifunctional enzyme complex. Angew Chem Int Ed, 2012, 51(35): 8787–8790.

[65] You C, Zhang YHP. Self-assembly of synthetic metabolons through synthetic protein scaffolds: one-step purification, co-immobilization, and substrate channeling. ACS Synth Biol, 2013, 2(2): 102–110.

[66] Chen H, Huang R, Kim EJ, et al. Building a thermostable metabolon for facilitating coenzyme transport andhydrogen production at elevated temperature. ChemSusChem, 2018, 11(18): 3120–3130.

[67] Liu F, Banta S, Chen W. Functional assembly of a multi-enzyme methanol oxidation cascade on a surface-displayed trifunctional scaffold for enhanced NADH production. Chem Commun, 2013, 49(36): 3766–3768.

[68] Yu T, Gao X, Ren YH, et al. Assembly of cellulases with synthetic protein scaffolds. Bioresour Bioprocess, 2015, 2: 16.

[69] Zhang GQ, Quin MB, Schmidt-Dannert C. Self-assembling protein scaffold system for easycoimmobilization of biocatalytic cascade enzymes. ACS Catal, 2018, 8(6): 5611–5620.

[70] Hirakawa H, Nagamune? T. Molecular assembly of P450 with ferredoxin and ferredoxin reductase by fusion to PCNA. ChemBioChem, 2010, 11(11): 1517–1520.

[71] Cahn JKB, Werlang CA, Baumschlager A, et al. A general tool for engineering the NAD/NADP cofactor preference of oxidoreductases. ACS Synth Biol, 2017, 6(2): 326–333.

[72] Dumas R, Biou V, Halgand F, et al. Enzymology, structure, and dynamics of acetohydroxy acid isomeroreductase. Acc Chem Res, 2001, 34(5): 399–408.

[73] Arfin SM, Umbarger HE. Purification and properties of the acetohydroxy acid isomeroreductase of. J Biol Chem, 1969, 244(5): 1118–1127.

[74] Atsumi S, Hanai T, Liao JC. Non-fermentative pathways for synthesis of branched-chain higher alcohols as biofuels. Nature, 2008, 451(7174): 86–89.

[75] Shen CR, Liao JC. Metabolic engineering offor 1-butanol and 1-propanol production via the keto-acid pathways. Metab Eng, 2008, 10(6): 312–320.

[76] Brinkmann-Chen S, Flock T, Cahn JKB, et al. General approach to reversing ketol-acid reductoisomerase cofactor dependence from NADPH to NADH. Proc Natl Acad Sci USA, 2013, 110(27): 10946–10951.

[77] Paul CE, Arends IWCE, Hollmann F. Is simpler better? Synthetic nicotinamide cofactor analogues for redox chemistry. ACS Catal, 2014, 4(3): 788–797.

[78] You C, Huang R, Wei XL, et al. Protein engineering of oxidoreductases utilizing nicotinamide-based coenzymes, with applications in synthetic biology. Synth Syst Biotechnol, 2017, 2(3): 208–218.

[79] Chen H, Zhu ZG, Huang R, et al. Coenzyme engineering of a hyperthermophilic 6-phosphogluconate dehydrogenase from NADP+to NAD+with its application to biobatteries. Sci Rep, 2016, 6: 36311.

[80] Kim EJ, Kim JE, Zhang YHPJ. Ultra-rapid rates of water splitting for biohydrogen gas production throughartificial enzymatic pathways. Energ Environ Sci, 2018, 11(8): 2064–2072.

[81] Opgenorth PH, Korman TP, Iancu L, et al. A molecular rheostat maintains ATP levels to drive a synthetic biochemistry system. Nat Chem Biol, 2017, 13(9): 938–942.

[82] Rollin JA, Tam TK, Zhang YHP. New biotechnology paradigm: cell-free biosystems for biomanufacturing. Green Chem, 2013, 15(7): 1708–1719.

[83] Ji DB, Wang L, Hou SH, et al. Creation of bioorthogonal redox systems depending on nicotinamide flucytosine dinucleotide. J Am Chem Soc, 2011, 133(51): 20857–20862.

[84] Ji DB, Wang L, Liu WJ, et al. Synthesis of NAD analogs to develop bioorthogonal redox system. Sci China Chem, 2013, 56(3): 296–300.

[85] Liu YX, Feng YB, Wang L, et al. Structural insights into phosphite dehydrogenase variants favoring a non-natural redox cofactor. ACS Catal, 2019, 9(3): 1883–1887.

[86] Campbell E, Wheeldon IR, Banta S. Broadening the cofactor specificity of a thermostable alcohol dehydrogenase using rational protein design introduces novel kinetic transient behavior. Biotechnol Bioeng, 2010, 107(5): 763–774.

[87] Campbell E, Meredith M, Minteer SD, et al. Enzymatic biofuel cells utilizing a biomimetic cofactor. Chem Commun, 2012, 48(13): 1898–1900.

[88] Maurer SC, Kühnel K, Kaysser LA, et al. Catalytic hydroxylation in biphasic systems using CYP102A1 mutants. Adv Synth Catal, 2005, 347(7/8): 1090–1098.

[89] Ryan JD, Fish RH, Clark DS. Engineering cytochrome P450 enzymes for improved activity towards biomimetic 1,4-NADH cofactors. ChemBioChem, 2008, 9(16): 2579–2582.

[90] Lu XY, Liu YW, Yang YQ, et al. Constructing a synthetic pathway for acetyl-coenzyme A from one-carbon through enzyme design. Nat Commun, 2019, 10(1): 1378.

[91] Chuaboon L, Wongnate T, Punthong P, et al. One-pot bioconversion ofL-arabinose toL-ribulose in an enzymatic cascade. Angew Chem Int Ed, 2019, 58(8): 2428–2432.

[92] Su HH, Guo ZW, Wu XL, et al. Efficient bioconversion of sucrose to high-value-added glucaric acid bymetabolic engineering. ChemSusChem, 2019, 12(10): 2278–2285.

[93] Zhong C, Wei P, Zhang YHP. A kinetic model of one-pot rapid biotransformation of cellobiose from sucrose catalyzed by three thermophilic enzymes. Chem Eng Sci, 2017, 161: 159–166.

[94] Hoops S, Sahle S, Gauges R, et al. COPASI-a COmplex PAthway SImulator. Bioinformatics, 2006, 22(24): 3067–3074.

[95] Korman TP, Opgenorth PH, Bowie JU. A synthetic biochemistry platform for cell free production of monoterpenes from glucose. Nat Commun, 2017, 8: 15526.

[96] Tian CY, Yang JG, Zeng Y, et al. Biosynthesis of raffinose and stachyose from sucrose via anmultienzyme system. Appl Environ Microbiol, 2019, 85(2): e02306–18.

[97] Meng DD, Wei XL, Zhang YHPJ, et al. Stoichiometric conversion of cellulosic biomass bysynthetic enzymatic biosystems for biomanufacturing. ACS Catal, 2018, 8(10): 9550–9559.

[98] Obert R, Dave BC. Enzymatic conversion of carbon dioxide to methanol: enhanced methanol productionsol-gel matrices. J Am Chem Soc, 1999, 121(51): 12192–12193.

[99] Wang XL, Li Z, Shi JF, et al. Bioinspired approach to multienzyme cascade system construction for efficient carbon dioxide reduction. ACS Catal, 2014, 4(3): 962–972.

[100] Ji XY, Su ZG, Wang P, et al. Tethering of nicotinamide adenine dinucleotide inside hollow nanofibers for high-yield synthesis of methanol from carbon dioxide catalyzed by coencapsulated multienzymes. ACS Nano, 2015, 9(4): 4600–4610.

multi-enzyme molecular machines – a review

Xinlei Wei, and Chun You

,,300308,

multi-enzyme molecular machines that follow the designed multi-enzyme pathways, require the rational optimization and adaptation of several purified or partially purified enzyme components, in order to convert certain substrates into target compoundsin an efficient manner. This type of molecular machine is component-based and modularized, so that its design, assembly, and regulation processes are highly flexible. Recently, the advantages ofmulti-enzyme molecular machines on the precise control of reaction process and the enhancement of product yield have suggested their great application potential in biomanufacturing. Studies onmulti-enzyme molecular machines have become an important branch of synthetic biology, and are gaining increasing attentions. This article systematically reviews the enzyme component-/module-based construction strategy ofmulti-enzyme molecular machines, as well as the research progress on the improvement of compatibility among enzyme components/modules. The current challenges and future prospects ofmulti-enzyme molecular machines are also discussed.

biological component, reaction module, coenzyme, artificial multi-enzyme complex, compatibility,synthetic enzymatic biosystem,synthetic biology, biomanufacturing

10.13345/j.cjb.190213

游淳 中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所體外合成生物學(xué)中心研究員，國(guó)家青年千人，博士生導(dǎo)師。主要研究方向是通過構(gòu)建體外多酶分子機(jī)器高效生產(chǎn)高值化學(xué)品，例如單糖、寡糖、肌醇及其衍生物、人造淀粉等。研究涉及到酶元件的穩(wěn)定性和輔酶適配性改造，多酶復(fù)合模塊的構(gòu)建和底物穿梭機(jī)制的研究，體外多酶分子機(jī)器中元件/模塊的適配性研究等。以第一作者或通訊作者在、、、等國(guó)際期刊發(fā)表40余篇學(xué)術(shù)論文。

魏欣蕾, 游淳. 體外多酶分子機(jī)器的現(xiàn)狀和最新進(jìn)展. 生物工程學(xué)報(bào), 2019, 35(10): 1870–1888.

Wei XL, You C.multi-enzyme molecular machines – a review. Chin J Biotech, 2019, 35(10): 1870–1888.

May25, 2019;

July15, 2019

Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 21778073), Sichuan Provincial Science and Technology Plan Project (No. 16ZC2954).

Chun You. Tel/Fax: +86-22-84868789; E-mail: you_c@tib.cas.cn

國(guó)家自然科學(xué)基金(No. 21778073)，四川省科技計(jì)劃項(xiàng)目(No. 16ZC2954) 資助。

(本文責(zé)編 陳宏宇)