黃芩苷聯(lián)合小檗堿干預(yù)非酒精性脂肪性肝炎兩種動(dòng)物模型的病理學(xué)研究

續(xù)暢 馬致潔 黃鳳 鐘曉松

[摘要] 目的 從病理學(xué)的角度探討黃芩苷聯(lián)合小檗堿對(duì)非酒精性脂肪性肝炎（NASH）兩種動(dòng)物模型的干預(yù)作用。 方法 選用6周齡SD大鼠及C57BL/6小鼠各40只，按隨機(jī)數(shù)字表法各分為4組：正常對(duì)照組、NASH模型組、小檗堿組、黃芩苷+小檗堿組，每組10只。除正常對(duì)照組外，其他三組分別制備高脂飲食誘導(dǎo)的SD大鼠NASH模型及蛋氨酸-膽堿缺乏飲食誘導(dǎo)的C57BL/6小鼠NASH模型，小檗堿組造模的同時(shí)灌胃給予小檗堿，黃芩苷+小檗堿組造模的同時(shí)灌胃給予黃芩苷及小檗堿，大鼠持續(xù)8周后取材，小鼠持續(xù)2周后取材。肝組織制成石蠟切片進(jìn)行HE染色，制成冰凍切片進(jìn)行油紅O染色，經(jīng)光鏡觀察攝片后，采用非酒精性脂肪性肝病活動(dòng)度積分表（NAS）對(duì)各組進(jìn)行NASH評(píng)估。 結(jié)果 兩種動(dòng)物模型的NASH模型組肝脂肪變、小葉內(nèi)炎癥、肝細(xì)胞氣球樣變?cè)u(píng)分及NAS總分均顯著高于正常對(duì)照組（P < 0.01）。兩種動(dòng)物模型的小檗堿組、黃芩苷+小檗堿組肝脂肪變、小葉內(nèi)炎癥、肝細(xì)胞氣球樣變?cè)u(píng)分及NAS總分均顯著低于NASH模型組（P < 0.05或P < 0.01）。 結(jié)論 黃芩苷及小檗堿可顯著抑制NASH相關(guān)病理變化的發(fā)生、發(fā)展，對(duì)NASH具有一定的干預(yù)作用。

[關(guān)鍵詞] 黃芩苷;小檗堿;非酒精性脂肪性肝炎;大鼠;小鼠;病理學(xué)

[中圖分類號(hào)] R-332? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-7210（2019）08（c）-0007-05

[Abstract] Objective To investigate the effect of Baicalin combined with Berberine on non-alcoholic steatohepatitis （NASH） in two animal models from the pathological point of view. Methods 40 SD rats and 40 C57BL/6 mice aged 6 weeks were divided into four groups according to random number table method： normal control group， NASH model group， Berberine group， Baicalin + Berberine group， 10 rats （or mice） in each group. In addition to normal control group， the other three groups prepared SD rats NASH model induced by high fat diet and C57BL/6 mice NASH model induced by methionine-choline deficiency diet. Berberine group was given Berberine by gavage， Baicalin + Berberine group was given Baicalin and Berberine by gavage. The rats were taken after 8 weeks， and the mice were taken after 2 weeks. Paraffin sections of liver tissue were stained with HE， frozen sections were stained with oil red O. After light microscopy， non-alcoholic fatty liver disease activity scale （NAS） was used to evaluate NASH in each group. Results The scores of hepatic steatosis， intralobular inflammation， hepatocyte balloon-like degeneration and total NAS in NASH model group were significantly higher than those in normal control group of two animal models （P < 0.01）. The scores of hepatic steatosis， intralobular inflammation， hepatocyte balloon-like degeneration and NAS in Berberine group and Baicalin + Berberine group were significantly lower than those in NASH model group of two animal models （P < 0.05 or P < 0.01）. Conclusion Baicalin and Berberine can significantly inhibit the occurrence and development of pathological changes in NASH. They have certain intervention effect on NASH.

[Key words] Baicalin; Berberine; Non-alcoholic steatohepatitis; Rats; Mice; Pathology

非酒精性脂肪性肝炎（NASH）是指無過量飲酒史，以肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞大泡性脂肪病變及脂肪貯積為病理特征，并伴隨肝小葉彌漫性炎癥及肝竇、中央靜脈周圍膠原沉積的臨床綜合征[1]。據(jù)相關(guān)臨床研究顯示，NASH是單純性脂肪肝向肝硬化、肝纖維化、肝衰竭轉(zhuǎn)化的重要環(huán)節(jié)，是隱源性肝硬化的關(guān)鍵病因之一[2-3]，且NASH與糖尿病、高脂血癥、肥胖同屬代謝綜合征，并常常相互轉(zhuǎn)化[4]，因此NASH的潛在患者數(shù)量是巨大的，探索防治NASH的多靶點(diǎn)藥物已成為目前迫在眉睫的工作。本課題組采用兩種動(dòng)物模型，從病理學(xué)的角度對(duì)小檗堿及黃芩苷聯(lián)合小檗堿治療NASH的效果進(jìn)行評(píng)價(jià)，以期為NASH的防治工作提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)所用的SD大鼠及C57BL/6小鼠均購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0006，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：大鼠11400700375241/小鼠11400700376164]。實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物飼養(yǎng)、造模、給藥、取材方案均報(bào)備首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院科研倫理委員會(huì)并獲批后，飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物房的獨(dú)立通氣籠具系統(tǒng)（IVC）中，每籠5只，均為6周齡。

1.2 藥品與試劑

鹽酸小檗堿片（東北制藥集團(tuán)沈陽第一制藥有限公司，批號(hào)：101201）;黃芩苷膠囊（東莞市金美濟(jì)藥業(yè)有限公司，批號(hào)：1714113）;大鼠維持飼料、大鼠高脂飼料、小鼠蛋氨酸-膽堿缺乏飼料（MCD）[5]、小鼠蛋氨酸-膽堿充足飼料（MCS）均購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

RM2235型輪狀切片機(jī)，德國(guó)徠卡（Leica）;XPE105電子天平，瑞士梅特勒-托利多（Mettler Toledo）;ST40R高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)賽默飛世爾（Thermo Fisher）;DW-86L729-86℃超低溫保存箱，中國(guó)海爾;DM3000正置顯微鏡，德國(guó)徠卡（Leica）;CamERC5s照相系統(tǒng)，德國(guó)蔡司（Zeiss）。

1.4 動(dòng)物分組、造模與給藥

1.4.1 高脂飲食誘發(fā)的NASH模型? 根據(jù)課題組前期研究成果[6]，將SD雄性大鼠40只（120±5）g根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法分為4組：正常對(duì)照組、NASH模型組、小檗堿組（按人與大鼠的公斤體重劑量換算公式折算，90.32 mg/kg）、黃芩苷+小檗堿組（按人與大鼠的公斤體重劑量換算公式折算，150.62 mg/kg+90.32 mg/kg），每組10只。所有SD大鼠經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，正常對(duì)照組飼喂維持飼料，其他三組均飼喂高脂飼料，共持續(xù)8周。實(shí)驗(yàn)采用干預(yù)給藥方式：小檗堿組及黃芩苷+小檗堿組每日上午灌胃給藥1次，正常對(duì)照組及NASH模型組經(jīng)灌胃給予同體積的生理鹽水。各組大鼠自由進(jìn)食、飲水，每日觀察大鼠的活動(dòng)、毛發(fā)、二便等情況。第8周實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，所有大鼠禁食不禁水24 h，稱重、麻醉（10%水合氯醛，0.04 mL/kg）、解剖并取相同部位的肝組織（1 cm×1 cm）2塊，一塊由4%多聚甲醛固定用以制作石蠟切片，另一塊由OCT包埋用以制作冰凍切片。

1.4.2 蛋氨酸-膽堿缺乏飲食誘發(fā)的NASH模型? 根據(jù)課題組前期研究成果[6]，C57BL/6雄性小鼠40只（25±5）g根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法分為4組：正常對(duì)照組、NASH模型組、小檗堿組（按人與小鼠的公斤體重劑量換算公式折算，129.78 mg/kg）、黃芩苷+小檗堿組（按人與小鼠的公斤體重劑量換算公式折算，216.34 mg/kg+129.78 mg/kg），每組10只。所有C57BL/6小鼠經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，正常對(duì)照組飼喂MCS飼料，其他三組均飼喂MCD飼料，共持續(xù)2周。實(shí)驗(yàn)小鼠給藥途徑、飼養(yǎng)、觀察、取材等步驟同“1.4.1”。

1.5 病理學(xué)檢測(cè)

經(jīng)4%多聚甲醛固定的肝組織，進(jìn)行常規(guī)的石蠟包埋與切片（4 μm），制成石蠟切片后進(jìn)行HE染色，由光學(xué)顯微鏡觀察并攝片;經(jīng)OCT包埋的肝組織，制成冰凍切片（10 μm）并進(jìn)行油紅O染色，由光學(xué)顯微鏡觀察并攝片。NASH的病理診斷標(biāo)準(zhǔn)采用由美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院（NIH）于2005年制訂的非酒精性脂肪性肝病活動(dòng)度積分表（NAS）[7]進(jìn)行計(jì)算評(píng)估。NAS評(píng)估系統(tǒng)對(duì)NASH的3項(xiàng)病理指標(biāo)、14項(xiàng)病理改變進(jìn)行綜合評(píng)估計(jì)分。見表1。

采用SPSS 20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，對(duì)正態(tài)分布、方差齊的數(shù)據(jù)采用單因素方差分析;對(duì)正態(tài)分布但方差不齊的數(shù)據(jù)采用Welch檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝組織石蠟切片HE染色結(jié)果

正常對(duì)照組大鼠及小鼠肝組織著色較為均勻，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整清晰，沿中央靜脈周圍呈放射狀排列;NASH模型組大鼠及小鼠肝組織結(jié)構(gòu)紊亂，發(fā)生大面積的脂肪樣變，中央靜脈周圍肝細(xì)胞空泡化嚴(yán)重，可見多個(gè)炎癥病灶;小檗堿組大鼠及小鼠肝組織脂肪變性減輕，肝細(xì)胞基本呈放射狀排列，炎癥病灶減少;黃芩苷+小檗堿組大鼠及小鼠肝組織脂肪變性明顯減輕，大部分肝細(xì)胞呈放射狀排列且空泡化明顯減輕，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少。見圖1。

2.2 肝組織冰凍切片油紅O染色結(jié)果

正常對(duì)照組大鼠及小鼠肝組織著色較淺或不著色;NASH模型組大鼠及小鼠肝組織中出現(xiàn)了大量脂滴;小檗堿組、黃芩苷+小檗堿組的大鼠及小鼠肝組織中的脂滴明顯減少并呈不均勻分布。見圖2。

2.3 NAS組織學(xué)評(píng)分

2.3.1 SD大鼠NAS組織學(xué)評(píng)分? 高脂飲食誘導(dǎo)的NASH大鼠模型中，正常對(duì)照組的NAS總分<3分，NASH模型組的NAS總分≥ 5分，可明確診斷為NASH，NASH造模成功;小檗堿組的NAS總分為3～<5分，處于NASH可能階段;黃芩苷+小檗堿組的NAS總分<3分，可排除NASH。NASH模型組大鼠的肝脂肪變、小葉內(nèi)炎癥、肝細(xì)胞氣球樣變?cè)u(píng)分及NAS總分均顯著高于正常對(duì)照組（P < 0.01）。小檗堿組、黃芩苷+小檗堿組大鼠的肝脂肪變、小葉內(nèi)炎癥、肝細(xì)胞氣球樣變?cè)u(píng)分及NAS總分均顯著低于NASH模型組（P < 0.05或P < 0.01）。見表2。

2.3.2 C57BL/6小鼠NAS組織學(xué)評(píng)分? 蛋氨酸-膽堿缺乏飲食誘導(dǎo)的NASH小鼠模型中，正常對(duì)照組的NAS總分<3分，NASH模型組的NAS總分≥5分，可明確診斷為NASH，NASH造模成功;小檗堿組的NAS總分為3～<5分，處于NASH可能階段;黃芩苷+小檗堿組的NAS總分<3分，可排除NASH。NASH模型組小鼠的肝脂肪變、小葉內(nèi)炎癥、肝細(xì)胞氣球樣變?cè)u(píng)分及NAS總分均顯著高于正常對(duì)照組（P < 0.01）。小檗堿組、黃芩苷+小檗堿組小鼠的肝脂肪變、小葉內(nèi)炎癥、肝細(xì)胞氣球樣變?cè)u(píng)分及NAS總分均顯著低于NASH模型組（P < 0.01）。見表3。

3 討論

有研究顯示，小檗堿可顯著降低2型糖尿病患者的空腹血糖（FPG）、餐后2 h血糖（2 h PG）及糖化血紅蛋白（HbA1c），且其作用機(jī)制為抑制胰島素抵抗的發(fā)生、發(fā)展[8-10]。因此，小檗堿對(duì)與同屬代謝綜合征的NASH而言，理應(yīng)具有治療效果，且本課題組通過Meta分析等循證醫(yī)學(xué)方法，也從臨床角度證實(shí)了小檗堿治療NASH確有其效[11]。而黃芩苷在臨床中主要用于輔助治療急性肝炎、慢性肝炎、遷延性肝炎等肝臟疾病[12-18]，但針對(duì)黃芩苷治療NASH等非酒精性脂肪性肝病方面的研究卻鮮有報(bào)道。

本課題組前期研究顯示，葛根芩連湯對(duì)NASH具有良好的治療效果[19-20]。葛根芩連湯由葛根、黃芩、黃連、甘草四味中藥組成，其中葛根的主要有效成分葛根素、黃連的主要有效成分小檗堿對(duì)NASH的有效性已被本課題組證實(shí)，而黃芩的主要有效成分黃芩苷對(duì)NASH的作用尚待研究。為此，本課題組采用高脂飲食誘發(fā)的NASH大鼠模型、蛋氨酸-膽堿缺乏飲食誘發(fā)的NASH小鼠模型，從病理學(xué)的角度，對(duì)小檗堿、黃芩苷聯(lián)合小檗堿治療NASH的效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，小檗堿、黃芩苷聯(lián)合小檗堿均可減輕兩種NASH動(dòng)物模型肝臟的脂肪變性，抑制肝細(xì)胞空泡化的發(fā)生，減少肝小葉內(nèi)炎癥病灶的數(shù)量，其中黃芩苷聯(lián)合小檗堿對(duì)NASH的療效優(yōu)于單獨(dú)使用小檗堿，經(jīng)黃芩苷聯(lián)合小檗堿干預(yù)的兩種NASH動(dòng)物模型可維持基本正常、完整的肝組織結(jié)構(gòu)，肝細(xì)胞沿中央靜脈周圍呈放射狀排列。

綜上所述，小檗堿、黃芩苷聯(lián)合小檗堿均對(duì)兩種NASH動(dòng)物模型具有良好的療效。今后，本課題組將從藥效學(xué)、血清學(xué)、分子生物學(xué)的角度進(jìn)一步探索小檗堿及黃芩苷治療NASH的效能與機(jī)制，從而為防治NASH提供新的思路。

[參考文獻(xiàn)]

[1]? European Association for the Study of the Liver（EASL），European Association for the Study of Diabetes（EASD），European Association for the Study of Obesity（EASO）. EASL-EASD-EASO Clinical Practice Guidelines for the management of non-alcoholic fatty liver disease [J]. Diabetologia，2016，59（6）：1121-1140.

[2]? Eslam M，George J. Genetic and epigenetic mechanisms of NASH [J]. Hepatol Int，2016，10（3）：394-406.

[3]? Laish I，Mannasse-Green B，Hadary R，et al. Telomere dysfunction in nonalcoholic fatty liver disease and cryptogenic cirrhosis [J]. Cytogenet Genome Res，2016，150（2）：93-99.

[4]? Chow MD，Lee YH，Guo GL. The role of bile acids in nonalcoholic fatty liver disease and nonalcoholic steatohepatitis [J]. Mol Aspects Med，2017，56（1）：34-44.

[5]? Lee GS，Yan JS，Ng RK，et al. Polyunsaturated fat in the methionine-choline-deficient diet influences hepatic inflammation but not hepatocellular injury [J]. J Lipid Res，2007，48（8）：1885-1896.

[6]? 續(xù)暢，劉澤洲，許可嘉，等.高脂及MCD飲食誘導(dǎo)非酒精性脂肪性肝炎動(dòng)物模型的比較[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2014，14（18）：3451-3455.

[7]? Kleiner DE，Brunt EM，Van Natta M，et al. Design and validation of a histological scoring system for nonalcoholic fatty liver disease [J]. Hepatology，2005，41（6）：1313-1321.