不同原料血漿制備的冷沉淀對(duì)凝血因子Ⅷ及纖維蛋白原的影響 楊

顏菁 王艷清 謝冬梅 龔嘉聰

[摘要]目的 分析由四種原料新鮮冰凍血漿制備的冷沉淀所含凝血因子Ⅷ（FⅧ）及纖維蛋白原（Fg）含量，為臨床提供優(yōu)質(zhì)安全的冷沉淀制劑。方法 隨機(jī)抽取2015年4月我站采集的20袋（ACD-B配方）全血，在6 h內(nèi)按照成分制備標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程制備四種新鮮冰凍血漿[新鮮冰凍血漿（FFP）、濾白冰凍血漿、滅活冰凍血漿、濾白滅活冰凍血漿]并速凍;1周后將制備的FFP在低溫水浴箱（4±2）℃融化后，用虹吸法原理制備出四種冷沉淀（冰凍血漿冷沉淀、濾白冷沉淀、滅活冷沉淀、濾白滅活冷沉淀）并速凍;冰凍1周后在37℃水浴箱融化后檢測(cè)凝血因子FⅧ含量及Fg含量。結(jié)果 FFP冷沉淀、濾白冷沉淀、滅活冷沉淀、濾白滅活冷沉淀的FⅧ及Fg含量依次為（1.506±0.351）、（1.352±0.217）、（1.184±0.235）、（0.724±0.281）IU/ml和（3.055±0.474）、（2.801±0.313）、（1.671±0.215）、（1.552±0.162）g/L，不同冷沉淀間的FⅧ及Fg含量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。FFP冷沉淀、濾白冷沉淀、滅活冷沉淀、濾白滅活冷沉淀的FⅧ及Fg回收率依次為100.0%、89.7%、78.6%、48.1%和100.0%、91.7%、54.7%、50.8%，不同冷沉淀的回收率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。結(jié)論 采用不同原料、不同方法制備出的冷沉淀FⅧ及Fg含量有所差別，F(xiàn)FP冷沉淀、濾白冷沉淀、滅活冷沉淀的FⅧ及Fg含量較高且符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。

[關(guān)鍵詞]新鮮冰凍血漿;凝血因子;纖維蛋白原;冷沉淀

[中圖分類號(hào)] R943? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1674-4721（2019）8（c）-0041-03

[Abstract] Objective To analyze the content of clotting factor Ⅷ （FⅧ） and fibrinogen （Fg） in cold precipitation prepared from fresh frozen plasma of four kinds of raw materials and provide high quality and safe cold precipitation preparations for clinical use. Methods A total of 20 bags of whole blood （ACD-B formula） collected by our station in April 2015 were randomly sampled， four kinds of fresh frozen plasma （cryoprecipitation of frozen plasm [FFP]， filtered frozen plasma， inactivated cold precipitation， filtering inactivated frozen plasm） were prepared and quick freezing in 6 hours according to the standard operating procedures for preparation. Four kinds of fresh frozen plasma prepared after one week were melted in a low temperature water between（4±2）℃， four kinds of cold precipitates were prepared by siphon method， and quick freezing. The content of FⅧ and Fg were detected after thawing in 37℃ water bath after 1 week of freezing. Results FFP cryoprecipitate， filtered white cold precipitate， inactivated cryoprecipitate， filtered white inactivated cryoprecipitate FⅧ and Fg content were （1.506±0.351）， （1.352±0.217）， （1.184±0.235）， （0.724±0.281） IU/ml and （3.055±0.474）， （2.801±0.313）， （1.671±0.215）， （1.552±0.162） g/L， there were statistically significant differences in FⅧ and Fg content between different cryoprecipitates （P<0.05）. The FⅧ and Fg recovery rates of FFP cryoprecipitate， filtered white cold precipitation， inactivated cryoprecipitate and whitening inactivated cryoprecipitate were 100.0% and 89.7%， respectively. 78.6%， 48.1% and 100.0%， 91.7%， 54.7%， 50.8%， the recovery rates of different cryoprecipitates were statistically different （P<0.05）. Concluison The contents of FⅧ and fibrinogen in cold precipitation， filter white cold precipitation and inactivated cold precipitation of FP are higher and meet the national standards.

[Key words] Fresh frozen plasma; Clotting factor; Fibrinogen; Cold precipitation

冷沉淀是采用特定的提取方法，將冰凍血漿在低溫條件下（一般為4℃）融化后的一些不溶性物質(zhì)所提取出來的，這些不溶性物質(zhì)中含有凝血過程物質(zhì)，如纖維蛋白原（Fg）、凝血因子Ⅷ（FⅧ）等。在臨床工作中，由于血漿制品的缺乏，冷沉淀被廣泛用于那些由凝血功能障礙導(dǎo)致的疾病[1-3]。目前在血液中心工作中，制備冷沉淀時(shí)主要有新鮮冰凍血漿（FFP）、新鮮病毒滅活冰凍血漿（滅活FFP）、新鮮濾白冰凍血漿（濾白FFP）、新鮮濾白病毒滅活冰凍血漿（濾白滅活FFP），而據(jù)以往臨床研究報(bào)道，不同的方法制備出的冷沉淀其質(zhì)量不同，而反應(yīng)冷沉淀質(zhì)量的兩個(gè)重要指標(biāo)即是FⅧ及Fg含量[3-4]，本研究探討這四種冷沉淀制備方法所制備出的冷沉淀FⅧ及Fg的差異，現(xiàn)報(bào)道如下。

1材料與方法

1.1標(biāo)本來源

隨機(jī)抽取2015年4月我站采集的（ACD-B配方）400 ml全血20袋，所有血液來源均有記錄，且這些血源的獻(xiàn)血者和血液質(zhì)量均符合國(guó)家相關(guān)規(guī)定的要求[5-6]，這些血制品保存于2～6℃條件下，并在6 h內(nèi)制成冰凍血漿制品。本研究經(jīng)我中心醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2方法

血漿及冷沉淀制備方法及過程。將400 ml全血分成2份，每份200 ml，1份接駁5聯(lián)袋，另1份接駁濾白血袋。將接駁五聯(lián)袋的200 ml全血離心制備100 ml新鮮血漿，平均分成2份，1份為新鮮血漿，另1份進(jìn)行用MB-P病毒滅活制備成滅活新鮮血漿。接駁濾白血袋的200 ml全血經(jīng)濾白后以同樣的方法離心制備成濾白新鮮血漿和濾白滅活新鮮血漿。將4種新鮮血漿各接駁一空袋，并各留取5 ml樣本，將血漿和樣本速凍后放入低溫冰箱冰凍保存。4種血漿冰凍1周后取出，采用虹吸法制備冷沉淀，剩余血漿即為GRP，再放入冰箱冰凍保存。1周后取出上述4種FFP樣本和4種CRP血漿在37℃水浴箱融化后進(jìn)行檢測(cè)。

1.3檢測(cè)指標(biāo)

采用凝固法檢測(cè)FⅧ和Fg含量。

1.3.1試劑材料? 凝血因子試劑盒購于南京建成生物工程公司，操作流程均按照說明書進(jìn)行;其余一次性使用血袋等制品均取用我站統(tǒng)一購買的一次性物品。

1.3.2儀器設(shè)備? 大容量低溫離心機(jī);血漿速凍機(jī);病毒滅活機(jī);醫(yī)用低溫冰箱;分光光度計(jì);全自動(dòng)血凝儀;無菌接管機(jī)。以上儀器均由我站設(shè)備科提供安裝，檢測(cè)時(shí)這些儀器均處于正常工作狀態(tài)，保證測(cè)量值的準(zhǔn)確。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用F檢驗(yàn)，兩組間比較采用LSD-t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1四種冷沉淀FⅧ、Fg測(cè)定結(jié)果的比較

FFP冷沉淀、濾白冷沉淀、滅活冷沉淀、濾白滅活冷沉淀的FⅧ及Fg含量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（表1）。

2.2四種冷沉淀FⅧ、Fg回收結(jié)果的比較

本試驗(yàn)檢測(cè)出FFP冷沉淀、濾白冷沉淀、滅活冷沉淀、濾白滅活冷沉淀的FⅧ及Fg回收率依次為100.0%、89.7%、78.6%、48.1%和100.0%、91.7%、54.7%、50.8%。濾白滅活冷沉淀Ⅷ及Fg損失率接近50.0%。各種冷沉淀的FⅧ及Fg回收率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

3討論

冷沉淀是冰凍血漿在4℃左右產(chǎn)生的不溶性白色沉淀物。冷沉淀是采用特定的提取方法，將冰凍血漿在低溫條件下（一般為4℃）融化后的一些不溶性物質(zhì)所提取出來的，這些不溶性物質(zhì)中含有凝血過程物質(zhì)，如纖維蛋白原、凝血因子等。在臨床工作中，由于血漿制品的缺乏，冷沉淀被廣泛用于那些由凝血功能障礙導(dǎo)致的疾病。同時(shí)，目前對(duì)冷沉淀的制作主要有FFP、滅活FFP、濾白FFP、濾白滅活FFP，受具體血站條件限制，其選擇的制作方法有所不同[7-8]。大部分血站為了保障冷沉淀的質(zhì)量，通常對(duì)血漿不做病毒滅活處理或?yàn)V除白細(xì)胞制作冷沉淀[9]。由于輸血可引起血源性疾病的傳播和同種免疫反應(yīng)，對(duì)所有的血液制劑來說風(fēng)險(xiǎn)較高的是輸注冷沉淀，更容易使病毒傳染[10-11]。

國(guó)內(nèi)的研究[7-8]已經(jīng)證明，針對(duì)冷沉淀的制作，采用亞甲藍(lán)光化學(xué)滅活冷沉淀中的病毒被認(rèn)為對(duì)于冷沉淀是一種高效、安全的滅活方式，目前在我國(guó)僅有此法被批準(zhǔn)應(yīng)用于冷沉淀的滅活。亞甲藍(lán)光化學(xué)滅活技術(shù)的原理主要是利用亞甲藍(lán)與病毒的含有磷酸雙分子層的模型結(jié)構(gòu)相結(jié)合，其后在可見光的照射下發(fā)生作用而使得病毒無法復(fù)制和生存，以此達(dá)到滅活的目的[12-13]。雖然亞甲藍(lán)光化學(xué)滅活法對(duì)病毒的滅活十分有效，但是此法僅僅對(duì)游離在胞質(zhì)外的病毒有效，而對(duì)在采集血液前已經(jīng)寄生于細(xì)胞中的病毒卻無效。由于冷沉淀中含有的細(xì)胞多數(shù)為白細(xì)胞，所以如何除去白細(xì)胞中的病毒或直接除去白細(xì)胞成為廣大臨床輸血者共同關(guān)注的熱點(diǎn)問題，由于白細(xì)胞比冷沉淀的有效成分-凝血因子的直徑更大，所以對(duì)冷沉淀采用特制的濾過膜能有效的將白細(xì)胞去除[14-15]。

白細(xì)胞過濾器可降低非溶血性輸血發(fā)熱反應(yīng)的發(fā)生率，降低輸血后移植物抗宿主?。℅VHD）的發(fā)生率，防止部分輸血相關(guān)病毒的傳染，預(yù)防HLA同種異體免疫反應(yīng)引起的血小板輸注無效，降低了輸血風(fēng)險(xiǎn)[16-17]。目前，國(guó)外采用的濾白冷沉淀制備方法在國(guó)內(nèi)已被各個(gè)供血機(jī)構(gòu)廣泛采用，而增加濾白冷沉淀的工序無疑會(huì)對(duì)冷沉淀的成分產(chǎn)生影響[18]。而我國(guó)現(xiàn)行冷沉淀質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)中，明確規(guī)定了在200 ml冷沉淀中，F(xiàn)Ⅷ的含量應(yīng)>80 IU，而對(duì)Fg的水平并未做明確規(guī)定。而經(jīng)過本次檢測(cè)，采用濾白冰凍血漿制備的冷沉淀達(dá)到了質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)因此可在臨床推廣應(yīng)用。另一方面，對(duì)冰凍血漿進(jìn)行滅活處理也能達(dá)到降低血液輸注風(fēng)險(xiǎn)的目的，因?yàn)闇缁钐幚砑夹g(shù)使得各種病毒失去活性，喪失了感染能力，可降低輸注風(fēng)險(xiǎn)，研究結(jié)果顯示采用滅活新鮮冰凍血漿制備的冷沉淀中的FⅧ的含量達(dá)到質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)因此可在臨床應(yīng)用。而濾白細(xì)胞和病毒滅活同時(shí)進(jìn)行制備的濾白滅活冷沉淀，其Ⅷ及Fg含量均未達(dá)到國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，暫不能用于臨床使用。

本研究結(jié)果提示，單采用新鮮冰凍血漿制備的冷沉淀，雖然FⅧ的含量達(dá)到了質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，但其由于獻(xiàn)血人員健康狀況不確定、未經(jīng)病毒滅活處理及可能因白細(xì)胞存在而發(fā)生異體免疫反應(yīng)，使得它的應(yīng)用受到較大限制;而采用了濾白和滅活兩道工序的濾白滅活冷沉淀，未能達(dá)到質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)不能使用。濾白冷沉淀和滅活冷沉淀由于避免了上述風(fēng)險(xiǎn)且質(zhì)量達(dá)標(biāo)，故可推廣使用。

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（收稿日期：2019-05-20? 本文編輯：崔建中）