超臨界流體色譜技術在西酞普蘭對映體拆分中的應用*

肖夢琦，聶小春

(1.湖北中醫(yī)藥大學藥學院，武漢 430065；2.武漢藥品醫(yī)療器械檢驗所，武漢 430075)

西酞普蘭(citalopram)是治療抑郁癥的藥物[1]，以消旋體形式給藥，能選擇性抑制5-羥色胺再攝取過程[2]。西酞普蘭分子中有一個手性碳，存在R、S兩種對映體，其中S-對映體藥理活性遠大于R-對映體[3]，已被拆分出來單獨使用，即艾司西酞普蘭(escitalopram)?，F有西酞普蘭對映體拆分方法以正相[4-6]或反相[7]高效液相色譜或與質譜聯(lián)用[8]、毛細管電泳技術[9-11]較常見，而使用超臨界流體色譜技術進行拆分[12-13]筆者較少見。超臨界流體色譜技術的分離原理類似正相色譜，但使用超臨界二氧化碳作為流動相，有機試劑的使用量大幅度減少，因此是一種更加環(huán)保的色譜方法。2012年，美國沃特世(Waters)公司基于超高效液相色譜技術平臺，推出源于超臨界流體色譜技術的超高效合相色譜(ultra performance convergence chromatography，UPC2)系統(tǒng)[14]，筆者在本實驗使用該系統(tǒng)拆分西酞普蘭對映體，以期為相關藥品的質量控制提供新方法。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Waters ACQUITY UPC2超高效合相色譜儀(配有合相色譜管理器、樣品管理器、二元溶劑管理器、PDA檢測器、柱溫箱管理器和Empower3工作站，美國Waters公司)；手性色譜柱：ACQUITY UPC2Trefoil CEL2，固定相為纖維素-三(3-氯-4-甲基苯基氨基甲酸酯)；ACQUITY UPC2Trefoil CEL1，固定相為纖維素-三(3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯)；ACQUITY UPC2Trefoil AMY1，固定相為直鏈淀粉-三(3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯)，3種手性柱均由美國Waters公司生產，規(guī)格均為2.1 mm×50 mm，2.5 μm。

1.2試劑 二氧化碳(武漢鋼鐵集團氧氣有限責任公司，批號：20180510，純度：99.990%)；三乙胺(國藥集團化學試劑有限公司，批號：20170724，分析純)；二乙胺(國藥集團化學試劑有限公司，批號：20130326，分析純)；甲醇(Fisher Chemical，LOT：178498，色譜純)；乙腈(Fisher Chemical，LOT：175165，色譜純)；異丙醇(Fisher Chemical，LOT：168323，色譜純)；乙醇(Scharlau，BATCH：16719415，色譜純)。

對照品：氫溴酸西酞普蘭(含量：100.0%，批號：2001976，H.Lundbeck A/S，Copenhagen-DK，相對分子質量：405.3)；草酸艾司西酞普蘭(即S-對映體，含量：99.0%，批號：V4013，H.Lundbeck A/S，Copenhagen-DK，相對分子質量：414.5)；樣品：草酸艾司西酞普蘭片(批號：P011401，P021401，P031401，韓國SK公司，規(guī)格：每片10 mg)。

2 方法與結果

2.1對照品溶液的配制 對照品溶液A：精密稱取氫溴酸西酞普蘭對照品適量，甲醇溶解并定量稀釋制成0.5 mg·mL-1溶液；對照品溶液B：精密稱取草酸艾司西酞普蘭對照品適量，甲醇溶解并定量稀釋制成0.25 mg·mL-1溶液；對照品溶液C：精密量取對照品溶液A 1 mL，置于5 mL量瓶，用甲醇稀釋制成0.1 mg·mL-1溶液；對照品溶液D：精密稱取草酸艾司西酞普蘭對照品適量，甲醇溶解并定量稀釋制成5 mg·mL-1溶液；對照品溶液E：精密量取對照品溶液C和對照品溶液D各1 mL，置于試管中混勻；供試品溶液：取草酸艾司西酞普蘭片樣品1片，置10 mL量瓶，加適量甲醇浸泡至藥片崩散，甲醇定容，搖勻，用孔徑0.22 μm濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2色譜條件的選擇 在UPC2系統(tǒng)中設置樣品溫度20 ℃，進樣量1 μL，強清洗體積200 μL(甲醇)，弱清洗體積600 μL(甲醇)，對手性柱的種類、改性劑與添加劑的種類和比例、柱溫、背壓、流速進行優(yōu)化選擇。西酞普蘭S-對映體為有效成分，故各項考察指標(保留時間、分離度、對稱因子和理論板數)按S-對映體計算。

2.2.1檢測波長的選擇 采用PDA檢測器，在210～400 nm波長范圍內掃描，西酞普蘭在240 nm波長處有最大吸收，故選擇檢測波長為240 nm。

2.2.2手性柱的選擇 筆者在實驗中考察了ACQUITY UPC2Trefoil系列3種手性柱的分離效果。以超臨界二氧化碳為流動相中主要組分，改性劑為甲醇-乙腈(9：1)，在流動相中占比9%；添加劑為三乙胺，在改性劑中占比為0.1%；柱溫37 ℃；背壓為11.72 MPa(1700 psi)；流速0.6 mL·min-1。使用對照品溶液A進樣以觀察分析效果，使用溶劑甲醇和對照品溶液B定位(圖1)。在此條件下，分別使用3根手性柱進行實驗。結果表明，CEL2柱可以實現西酞普蘭R、S-對映體的拆分(圖2)，而AMY1柱和CEL1柱不能拆分西酞普蘭對映體，因此選用CEL2柱。

2.2.3改性劑種類的選擇 采用CEL2柱，設置流動相中改性劑占比9%，柱溫35 ℃，背壓11.72 MPa(1700 psi)，流速0.7 mL·min-1，考察改性劑的種類對分離效果的影響，見表1。

由表1可知，當改性劑為甲醇-乙腈(9：1)時，對稱因子最接近于1，理論板數最大，且分離度較大；當改性劑中沒有加入三乙胺(添加劑)時，使用甲醇、乙醇、異丙醇、乙腈中的任何一種都不能完全分離西酞普蘭對映體。因此，應選擇甲醇-乙腈(9：1)為改性劑，并加入適量的添加劑。

圖1 西酞普蘭S-對映體色譜圖

Fig.1ChromatogramofcitalopramS-enantiomer

圖2 西酞普蘭在CEL2柱上分離的色譜圖

Fig.2ChromatogramofcitalopramseparatedbyCEL2column

2.2.4添加劑的選擇 采用CEL2柱，使用甲醇-乙腈(9：1)作為改性劑，設置流動相中改性劑占比9%，柱溫35 ℃，背壓11.72 MPa(1700 psi)，流速0.7 mL·min-1，考察添加劑的種類和比例對分離效果的影響。結果見表2，3。

由表2可見，使用三乙胺作為添加劑時分離效果更好。由表3可見，添加劑比例越大，流動相洗脫能力越強，但分離度就越?。划斎野吩诟男詣┲械恼急葹?.1%時分離度最大，故選用0.1%三乙胺作為添加劑進行后續(xù)實驗。

2.2.5改性劑比例的選擇 采用CEL2柱，使用甲醇-乙腈(9：1)作為改性劑，0.1%三乙胺為添加劑，設置柱溫35 ℃，背壓11.72 MPa(1700 psi)，流速0.7 mL·min-1，考察改性劑在流動相中的占比對分離效果的影響，見表4。

由表4可見，改性劑比例越大，流動相洗脫能力越強，但分離度減?。桓男詣┍壤秊?%時雖然分離度最大，但分析時間較長；當改性劑比例為9%時，分離度和理論塔板數都較大，且節(jié)省了一定的分析時間；當改性劑比例為5%時，洗脫能力不足，主成分在色譜柱上保留，未能被洗脫。因此選用改性劑比例為9%進行后續(xù)實驗。

2.2.6柱溫的選擇 采用CEL2柱，改性劑為甲醇-乙腈(9：1)，設置流動相中改性劑占比9%,添加劑為0.1%三乙胺，設置背壓11.72 MPa(1700 psi)，流速0.7 mL·min-1，考察柱溫對分離效果的影響，見表5。

由表5可見，在30～45 ℃，柱溫越高，保留時間越短；當柱溫為37 ℃時，分離度最大，對稱因子最接近于1，理論塔板數較高。因此，柱溫選擇37 ℃。

2.2.7背壓的選擇 背壓指的是色譜柱出口的壓力，為保持流動相處于均一可控的狀態(tài)，應控制柱后壓力。采用CEL2柱，改性劑為甲醇-乙腈(9：1)，設置流動相中改性劑的占比為9%,添加劑為0.1%三乙胺，設置柱溫37 ℃，流速0.7 mL·min-1，考察背壓對分離效果的影響，見表6。

由表6可見，背壓越大，保留時間越短；當背壓為11.72 MPa(1700 psi)時，分離度最大，理論板數較高。因此，選擇背壓為11.72 MPa(1700 psi)。

2.2.8流速的選擇 采用CEL2柱，改性劑為甲醇-乙腈(9：1)，設置流動相中改性劑的占比為9%,添加劑為0.1%三乙胺，設置柱溫37 ℃，背壓11.72 MPa(1700 psi)，考察流速對分離效果的影響，見表7。

表1 改性劑的種類對西酞普蘭對映體分離的影響

Tab.1Effectofmodifiertypeontheseparationofcitalopramenantiomersn=5

改性劑添加劑保留時間/min分離度對稱因子理論塔板數甲醇-乙腈(55)0.5%三乙胺7.0061.7371.1222040甲醇-乙腈(64)0.5%三乙胺6.7661.8071.1272090甲醇-乙腈(73)0.5%三乙胺6.6491.6901.2091987甲醇-乙腈(82)0.5%三乙胺6.7041.7151.1092171甲醇-乙腈(91)0.5%三乙胺6.8961.7821.0972890甲醇0.5%三乙胺7.3791.7401.2582310乙醇0.5%三乙胺4.9761.4611.1962107

表2 添加劑的種類對西酞普蘭對映體分離的影響

Tab.2Effectofadditivetypeontheseparationofcitalopramenantiomersn=5

表3 添加劑在改性劑中的占比對西酞普蘭對映體分離的影響

Tab.3Effectoftheproportionofadditiveinmodifierontheseparationofcitalopramenantiomersn=5

比例/%保留時間/min分離度對稱因子理論板數0.19.5752.0651.26424240.28.6881.9841.21424630.37.8671.8641.17822400.47.3671.8271.12923910.56.9381.7911.1432482

表4 改性劑在流動相中的占比對西酞普蘭對映體分離的影響

Tab.4Effectoftheproportionofmodifierinmobilephaseontheseparationofcitalopramenantiomersn=5

比例/%保留時間/min分離度對稱因子理論板數5————715.9012.2121.230236699.4622.0421.2222417116.1371.8171.3202153134.3331.6431.2241999

表5 柱溫對西酞普蘭對映體分離的影響

Tab.5Effectofcolumntemperatureontheseparationofcitalopramenantiomers

n=5

由表7可見，當流速為0.6 mL·min-1時，分離度和理論塔板數的優(yōu)勢明顯。因此選用0.6 mL·min-1的流速。

表6 背壓對西酞普蘭對映體分離的影響

Tab.6Effectofbackpressureontheseparationofcitalopramenantiomersn=5

背壓(psi)/MPa保留時間/min分離度對稱因子理論板數10.34(1500)9.6162.0171.341271211.03(1600)9.1902.0401.184266711.72(1700)8.8892.0441.220270112.41(1800)8.6231.9951.286248513.10(1900)8.3792.0161.2112501

表7 流速對西酞普蘭對映體分離的影響

Tab.7Effectofflowrateontheseparationofcitalopramenantiomersn=5

流速/(mL·min-1)保留時間/min分離度對稱因子理論板數0.610.6582.3151.1983 1840.78.8892.0441.2202 7010.87.8772.0581.2842 4761.06.1981.8661.2142 0081.25.0911.7761.1851 886

2.2.9重復性實驗 在優(yōu)選的色譜條件下，使用對照品溶液A連續(xù)進樣5次(該濃度下色譜峰的響應值適中)，計算得到R-對映體和S-對映體保留時間的平均值分別為9.047和10.658 min，RSD分別為0.30%和0.23%，2種對映體分離度的平均值為2.315，RSD為1.07%。結果表明該方法重復性良好。

2.3應用 在UPC2系統(tǒng)中設置優(yōu)選的色譜條件[采用CEL2柱，以超臨界CO2為流動相中主要組分，改性劑為甲醇-乙腈(9：1)，改性劑在流動相中的占比為9%，添加劑為0.1%三乙胺，柱溫37 ℃，背壓11.72 MPa(1700 psi)，流速0.6 mL·min-1，樣品溫度20 ℃，進樣量為1 μL，檢測波長240 nm]，使用對照品溶液E進樣(圖3)。對照品溶液E中R-對映體的濃度約為S-對映體濃度的1%，連續(xù)進樣5次，R-對映體保留時間的平均值為9.122 min，RSD為0.42%，R-對映體峰面積的平均值為286 868，RSD為1.57%，重復性較好，表明該方法可以應用于艾司西酞普蘭制劑的對映體雜質檢查。

在優(yōu)選條件下對3批樣品(批號：P011401，P021401，P031401)進行測定，結果草酸艾司西酞普蘭片中R-對映體的含量分別為0.38%，0.39%，0.36%。

圖3 對照品溶液E色譜圖

3 討論

筆者在本實驗中采用超臨界流體色譜技術，以超高效合相色譜系統(tǒng)，考察了手性柱的種類、改性劑與添加劑的種類和比例、柱溫、背壓、流速對西酞普蘭對映體分離的影響，最終確定優(yōu)選的色譜條件為：采用ACQUITY UPC2Trefoil CEL2手性柱，以超臨界CO2為流動相中主要組分，改性劑為甲醇-乙腈(9：1)在流動相中占比為9%，添加劑為0.1%三乙胺，柱溫37 ℃，背壓11.72 MPa(1700 psi)，流速0.6 mL·min-1，樣品溫度20 ℃，進樣量為1 μL，檢測波長240 nm。在此條件下，能夠在13 min內使西酞普蘭R、S-對映體完全分離，分離度為2.315，分離效率高，重復性良好，可以應用于艾司西酞普蘭制劑的對映體雜質檢查。

超臨界流體色譜技術可以用于多種化合物的分離分析，由于流動相的主要組分為CO2，有機試劑的使用量非常少，因此產生的廢液較常規(guī)HPLC減少很多，對環(huán)境的污染更小，并且節(jié)約成本，為藥品質量控制提供了一種更為環(huán)保的新方法。