如意金黃散高效液相色譜指紋圖譜研究

黃良永，楊玲風(fēng)，甘春英，鄭江萍

(1.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬十堰市太和醫(yī)院藥學(xué)部，十堰 442000；2.湖北醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)院，十堰 442000)

如意金黃散是中藥復(fù)方制劑，處方出自陳實(shí)功的《外科正宗》，由天花粉、大黃、姜黃、黃柏、白芷、生天南星、厚樸、陳皮、蒼術(shù)、甘草等10味中藥組成。該藥為2015年版《中華人民共和國藥典》一部收錄品種，臨床使用廣泛，具有清熱解毒、消腫止痛作用，用于熱毒瘀滯肌膚所致瘡瘍腫痛、丹毒流注，癥見肌膚紅、腫、熱、痛，亦可用于跌打損傷。外用于紅腫、煩熱、疼痛時(shí)用清茶調(diào)敷；用于漫腫無頭癥狀時(shí)用醋或蔥酒調(diào)敷，亦可用植物油或蜂蜜調(diào)敷，一日數(shù)次[1]。《中華人民共和國藥典》2015年版采用薄層色譜法對(duì)大黃、黃柏、厚樸、甘草、白芷藥材進(jìn)行定性鑒別，采用高效液相色譜(HPLC)法對(duì)姜黃中的姜黃素進(jìn)行定量測(cè)定。文獻(xiàn)報(bào)道[2-10]如意金黃散含量測(cè)定方法均采用HPLC法，測(cè)定指標(biāo)成分有姜黃素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、厚樸酚、和厚樸酚等，結(jié)果表明不同廠家如意金黃散指標(biāo)成分含量差異顯著。因此，采用測(cè)定中藥復(fù)方制劑中單一指標(biāo)成分或多個(gè)指標(biāo)成分含量的方法來控制質(zhì)量有一定局限性，不能滿足全面質(zhì)量控制的需求。為考察如意金黃散質(zhì)量穩(wěn)定性，探索一種全面控制其質(zhì)量的方法，筆者參考有關(guān)文獻(xiàn)[1-12]，應(yīng)用HPLC梯度洗脫法，建立了如意金黃散HPLC指紋圖譜測(cè)定方法，繪制了10批樣品色譜圖，得到其特征指紋圖譜，能夠較全面地反映處方中原藥材所含化學(xué)成分的種類與數(shù)量，可以對(duì)如意金黃散藥品質(zhì)量進(jìn)行整體描述和評(píng)價(jià)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1儀器 DIONEX Ultimate 3000 高效液相色譜儀(美國Thermo公司，四元梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、二極管陣列檢測(cè)器DAD、柱溫箱)；Chromeleon色譜工作站；色譜柱：Waters XTerra MS C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；KM-340超聲清洗機(jī)(廣東科盟電器有限公司，可調(diào)功率，40 kHz)；AUW 120D電子分析天平(日本島津公司，感量：0.01 mg)。

1.2試藥 橙皮苷對(duì)照品(批號(hào)：MUST-15070211，含量：99.70%)、甘草苷對(duì)照品(批號(hào)：MUST-15082811，含量：98.50%)、大黃素對(duì)照品(批號(hào)：MUST-16110712，含量：99.48%)、大黃酚對(duì)照品(批號(hào)：MUST-16031603，含量：99.01%)由中國科學(xué)院成都生物研究所與成都曼思特生物科技有限公司提供；甘草酸對(duì)照品(批號(hào)：110731-201418，含量：93.10%)、小檗堿對(duì)照品(批號(hào)：110713-200609，含量：100%)、黃柏堿對(duì)照品(批號(hào)：MUST-16040612，含量：99.29%)、蒼術(shù)素對(duì)照品(批號(hào)：111924-201303，含量：99.50%)、厚樸酚對(duì)照品(批號(hào)：110729-200412，含量：100%)、姜黃素對(duì)照品(批號(hào)：110823-201004，含量：98.80%)、蘆薈大黃素對(duì)照品(批號(hào)：110795-201007，含量：98.00%)、大黃酸對(duì)照品(批號(hào)：110757-200206，含量：100%)、大黃素甲醚對(duì)照品(批號(hào)：110758-201415，含量：99.80%)由中國食品藥品檢定研究院提供。如意金黃散10批(批號(hào)：S1～S10)均由太和醫(yī)院制劑室生產(chǎn)。乙腈、甲醇為色譜純(德國默克公司)；水為超純水；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1如意金黃散的制備 處方：天花粉320 g、大黃160 g、姜黃160 g、黃柏160 g、白芷160 g、天南星64 g、厚樸64 g、陳皮64 g、蒼術(shù)64 g、甘草64 g。制備方法：取方中藥材，粉碎成細(xì)粉，過篩孔內(nèi)徑150 μm (100目)篩，混勻即得。

2.2HPLC色譜圖的繪制

2.2.1色譜條件 Waters XTerra MS C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱；流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為 0.1%磷酸溶液，按表1規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫；檢測(cè)波長：254 nm；柱溫：30 ℃；流速1.0 mL·min-1，理論板數(shù)以甘草酸計(jì)應(yīng)不低于5000。

表1 洗脫梯度程序

2.2.2樣品溶液的制備

2.2.2.1對(duì)照品溶液的制備 精密稱取橙皮苷對(duì)照品20 mg，甘草酸對(duì)照品10 mg，甘草苷對(duì)照品1 mg，小檗堿對(duì)照品5 mg，黃柏堿對(duì)照品5 mg，蒼術(shù)素對(duì)照品1 mg，厚樸酚對(duì)照品2 mg，姜黃素對(duì)照品0.5 mg，蘆薈大黃素對(duì)照品0.8 mg，大黃素對(duì)照品0.8 mg，大黃酸對(duì)照品0.8 mg，大黃酚對(duì)照品0.8 mg，大黃素甲醚對(duì)照品0.4 mg，分別置于50 mL量瓶，用甲醇超聲溶解并稀釋至刻度，即得對(duì)照品溶液。

2.2.2.2供試品溶液的制備 取10批(批號(hào)：S1～S10)如意金黃散，各2 g，分別置于三角燒瓶，精密加入70%甲醇50 mL，放置0.5 h，稱定質(zhì)量，超聲處理45 min(功率250 W，頻率40 kHz)，放冷，再稱定質(zhì)量，用70%甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。按處方配比分別稱取10味藥材，天花粉0.5 g、大黃0.25 g、姜黃0.25 g、黃柏0.25 g、白芷0.25 g、天南星0.1 g、厚樸0.1 g、陳皮0.1 g、蒼術(shù)0.1 g、甘草0.1 g，分別置于三角燒瓶，精密加入70%甲醇50 mL，放置0.5 h，稱定質(zhì)量，超聲處理45 min(功率250 W，頻率40 kHz)，放冷，再稱定質(zhì)量，用70%甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得10個(gè)藥材的對(duì)照溶液。

2.2.3色譜適應(yīng)性實(shí)驗(yàn) 分別精密量取對(duì)照品溶液、供試品溶液、藥材對(duì)照溶液各10 μL，注入液相色譜儀，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下，如意金黃散供試品溶液色譜圖在對(duì)照品色譜相同的位置有甘草酸、蒼術(shù)素、厚樸酚、姜黃素、蘆薈大黃素、大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚峰，各成分峰與其相鄰峰完全分離，理論塔板數(shù)以甘草酸的峰計(jì)大于5000，見圖1和圖2。與如意金黃散的色譜圖比較10種藥材對(duì)照溶液的色譜圖分別有相應(yīng)的峰，見圖3，通過比較色譜峰保留時(shí)間，初步判定如意金黃散色譜圖中的主要色譜峰的原藥材歸屬，除制南星藥材外，其他藥材均有與如意金黃散的色譜圖相對(duì)應(yīng)的色譜峰，少量色譜峰在原藥材色譜圖中無法歸屬。

圖1 供試品溶液HPLC色譜圖

2.3指紋圖譜方法學(xué)考察

2.3.1精密度實(shí)驗(yàn) 取同一供試品溶液(批號(hào)：S5)，按“2.2.3”項(xiàng)方法連續(xù)進(jìn)樣5次，每次10 μL，記錄色譜圖，測(cè)定21個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果21個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD均<0.40%，相對(duì)峰面積RSD均<0.71%(n=5)，結(jié)果表明，儀器精密度好。

2.3.2重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批供試品(批號(hào)：S5)，按“2.2.2.2”項(xiàng)方法制備供試品溶液6份，按“2.2.3”項(xiàng)方法進(jìn)樣測(cè)定并分別測(cè)定其色譜圖，結(jié)果其相對(duì)保留時(shí)間穩(wěn)定，21個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD<0.49%。

1.橙皮苷；2.甘草酸；3.甘草苷；4.小檗堿；5.黃柏堿；6.蒼術(shù)素；7.厚樸酚；8.姜黃素；9.蘆薈大黃素；10.大黃素；11.大黃酸；12.大黃酚；13.大黃素甲醚。

圖2 13個(gè)對(duì)照品溶液HPLC圖譜與供試品的HPLC指紋圖譜比較

1.hesperidin；2.glycyrrhizin；3.liquiritin；4.berberine；5.phellodendrine；6.atractyloadin；7.magnolol；8.curcumin；9.aloeemodin；10.emodin；11.rhein；12.chrysophanol；13.rheochrysidin.

Fig.2ComparisonofHPLCfingerprintofthesampleand13batchesofstandard

2.3.3穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一樣品(批號(hào)：S5)溶液在0，4，12，24 h分別按“2.2.3”項(xiàng)方法進(jìn)樣測(cè)定并分別記錄其色譜圖，測(cè)定主要共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果21個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均<0.40%，相對(duì)峰面積RSD均<1.32%(n=5)，結(jié)果表明供試品溶液常溫下0～24 h可保持穩(wěn)定。

2.4指紋圖譜相似性評(píng)價(jià)

2.4.1共有指紋峰的標(biāo)定 取10批如意金黃散供試品，分別按“2.2.2.2”項(xiàng)供試品溶液制備方法處理，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下，測(cè)定其色譜圖。利用中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2004A版)軟件，以供試品S5的色譜圖作為參照?qǐng)D譜，時(shí)間窗寬度為0.1，選取平均值方法，采用自動(dòng)匹配法生成共有特征圖譜R，并分析各批供試品之間共有峰和相似度，確定共有峰。結(jié)果顯示10批供試品共有21個(gè)共有峰，見圖4和圖5，10批供試品圖譜與共有特征圖譜R相似度均>0.9，見表2。

2.4.2已知成分的確認(rèn) 從13個(gè)對(duì)照品色譜圖的各峰保留時(shí)間可知，7，8，9，10，12，14，15，18，19號(hào)峰保留時(shí)間與甘草酸、蘆薈大黃素、大黃酸、姜黃素、大黃素、厚樸酚、大黃酚、大黃素甲醚、蒼術(shù)素對(duì)照品峰保留時(shí)間一致，可確認(rèn)如意金黃散中含有這9種已知成分，見圖4。

7.甘草酸；8.蘆薈大黃素；9.大黃酸；10.姜黃素；12.大黃素；14.厚樸酚；15.大黃酚；18.大黃素甲醚；19.蒼術(shù)素。

圖4 如意金黃散共有特征圖譜R

7.glycyrrhizin；8.atractyloadin；9.rhein；10.curcumin；12.emodin；14.magnolol；15.chrysophanol；18.rheochrysidin；19.atractyloadin.

Fig.4CommoncharacteristicsofHPLCchromatogramRofRuyihuangjinSan

圖5 10批供試品HPLC指紋圖譜相似度比較

Fig.5SimilaritycomparisonofHPLCfingerprintof10batchesofsamples

2.4.3參照峰的確定 7號(hào)峰為甘草酸，保留時(shí)間約31.6 min，在色譜圖的中間位置，峰對(duì)稱性好，峰面積值穩(wěn)定，故選擇甘草酸峰作為參照峰。標(biāo)定各批號(hào)供試品的色譜圖，設(shè)甘草酸峰的相對(duì)保留時(shí)間和峰面積為1，計(jì)算色譜圖中各共有峰相對(duì)它的相對(duì)保留時(shí)間以及相對(duì)峰面積的值，并計(jì)算RSD值；10批供試品色譜圖中，21個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD值≤0.22%，表明各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間比較吻合，21個(gè)共有峰相對(duì)峰面積的RSD值在10.09%～48.00%之間，表明各共有峰相對(duì)峰面積波動(dòng)大，說明不同來源藥材成分含量相差較大，表明本實(shí)驗(yàn)建立的如意金黃散高效液相色譜指紋圖譜可靠，具有全面性和代表性，見表3和表4。

3 討論

在選擇流動(dòng)相時(shí)，參照《中華人民共和國藥典》2015年版中測(cè)定甘草含量的高效液相色譜法洗脫程序和流動(dòng)相做預(yù)實(shí)驗(yàn)，得到的色譜圖信息量小，峰型差。預(yù)實(shí)驗(yàn)比較乙腈-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.05%磷酸溶液不同流動(dòng)相體系，發(fā)現(xiàn)以乙腈-0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，經(jīng)梯度優(yōu)化，各色譜峰能完全分離，峰型對(duì)稱，故選擇乙腈-0.1%磷酸溶液為本實(shí)驗(yàn)的流動(dòng)相體系。

選擇檢測(cè)波長時(shí)，《中華人民共和國藥典》2015年版中大黃蒽醌類檢測(cè)波長254 nm，厚樸酚的最大吸收波長294 nm，橙皮苷最大吸收波長283 nm，蒼術(shù)素最大吸收波長340 nm，實(shí)驗(yàn)中使用254，284，294，340 nm波長對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果顯示，254 nm波長處測(cè)得的色譜圖中峰信息量最多且峰面積相對(duì)較大，9個(gè)對(duì)照成分的檢測(cè)靈敏度最大，故采用254 nm作為檢測(cè)波長，實(shí)驗(yàn)建立的色譜條件適應(yīng)性好。

表2 10批供試品HPLC指紋圖譜相似度

表3 HPLC指紋圖譜共有峰相對(duì)保留時(shí)間

表4 HPLC指紋圖譜共有峰面積

如意金黃散是由10味中藥組成的復(fù)方制劑，包含大量水溶性成分和脂溶性成分，在供試品處理過程中，為兼顧兩類成分提取和植物蛋白等雜質(zhì)去除，以50%，70%，100%甲醇為溶劑，進(jìn)行超聲處理與加熱回流；經(jīng)過兩種提取方法和提取時(shí)間的對(duì)比研究。結(jié)果表明，使用70%甲醇超聲提取45 min得到的供試品溶液測(cè)得色譜圖的峰信息量最多和峰面積最大；而對(duì)照品在甲醇中溶解度較大，所以對(duì)照品溶液用100%甲醇溶解配制。

10批供試品溶液的色譜圖表明，實(shí)驗(yàn)選擇的色譜條件適用，色譜圖中主要的特征峰均可找到原藥材歸屬，同時(shí)標(biāo)示出13種已知成分的色譜峰，為這些已知成分的含量測(cè)定奠定了基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)制得的指紋圖譜，標(biāo)示出了21個(gè)共有特征峰，特征峰的相對(duì)保留時(shí)間相對(duì)偏差小(RSD<0.22%)，說明色譜圖穩(wěn)定性好，特征成分穩(wěn)定可靠檢出；特征峰的相對(duì)峰面積相對(duì)偏差大(RSD>11.09%)，說明不同批次的供試品成分含量差異顯著，不同產(chǎn)地和不同批號(hào)的原藥材質(zhì)量有較大的差異，為了保證如意金黃散質(zhì)量的穩(wěn)定性，必須保證原藥材的質(zhì)量和來源統(tǒng)一。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，指紋圖譜技術(shù)可以較全面地控制中藥復(fù)方制劑的質(zhì)量。