高效液相色譜法測定生附子中3種雙酯型生物堿含量*

楊海寧，文瑾，孫筱林，王登才，張宇佳，鄭穩(wěn)生

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所，藥物傳輸技術(shù)及新型制劑北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100050；2.中國藥學(xué)會學(xué)術(shù)部，北京 100022；3.三株醫(yī)藥生物研究所，濟(jì)南 250100)

附子是毛茛科植物烏頭(AconitumcarmichaeliiDebx.)子根的加工品，每年六月下旬至八月下旬采挖，主產(chǎn)于四川、湖南、湖北等地，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》。附子味辛、甘，性大熱，有毒，具有補(bǔ)火助陽、散寒止痛、回陽救逆之功效，自古以來就是醫(yī)家常用之品，但其毒性較強(qiáng)，臨床用之不當(dāng)可能導(dǎo)致中毒或死亡。《中華人民共和國藥典》2015年版規(guī)定，附子常用量3～15 g[1-3]。但火神派代表吳佩蘅在方劑中動輒使用百余克附子，病情嚴(yán)重者可加至200～400 g[4]。附子中所含有效成分與有毒物質(zhì)均為二萜類生物堿類，其毒性主要作用于神經(jīng)系統(tǒng)、肌肉組織和心臟。其中雙酯型生物堿毒性最強(qiáng)，主要包括烏頭堿、次烏頭堿和新烏頭堿，此3種生物堿含量高，特征性強(qiáng)，常作為含附子制劑的測定指標(biāo)[5-6]。目前文獻(xiàn)中對生物堿類物質(zhì)的提取多采用氨水堿化樣品，再用有機(jī)試劑進(jìn)行提取，但該方法操作較繁瑣，重復(fù)性差。筆者在本研究采用酸水提取附子中雙酯型生物堿，提取率更高，操作更簡單，重復(fù)性好，建立的同時(shí)測定3種雙酯型生物堿的高效液相色譜法靈敏度高、操作簡單、重復(fù)性好，可以用于生附子中3種雙酯型的含量測定，可為生附子質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與試藥

1.1儀器 普析L600型高效液相色譜儀(北京普析通用公司)，檢測器(北京普析通用公司，型號：L600-UV)；色譜柱WondaSil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；XS105DU型電子天平(梅特勒-托利多儀器公司，感量：0.01 mg)；BSA423S-CW型電子天平(北京塞多利斯科學(xué)儀器有限公司，感量：0.001 g)；DTC-27型超聲波清洗機(jī)(鼎泰生化科技設(shè)備制造有限公司)。

1.2試藥 生附子(濟(jì)南三株醫(yī)院提供，批號：171225，180108，180302；產(chǎn)地四川，經(jīng)濟(jì)南三株醫(yī)院牛紀(jì)江主任醫(yī)師鑒定為毛茛科植物烏頭AconitumcarmichaeliiDebx.的子根)；烏頭堿對照品(批號：17110910，含量98.01%)、次烏頭堿對照品(批號：17111310，含量99.04%)、新烏頭堿對照品(批號：MUST-17111010，含量98.12%)均由成都曼思特生物科技有限公司提供；乙腈(上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司，批號：G2781296，含量99.99%)、甲醇(賽默飛世爾科技有限公司，批號：175167，含量99.99%)、四氫呋喃(上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司，批號：V593K072，含量99.99%)、醋酸銨(北京伊諾凱科技有限公司，批號：KBCK706，含量97%)、鹽酸(北京化工廠，批號：20150701，含量36%～38%)、其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件 Wondasil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm) ；以60 mmol·L-1醋酸銨作為流動相A，以乙腈-四氫呋喃(9：1)為流動相B，梯度洗脫(0～50 min，26%→38%B)，流速1.0 mL·min-1；柱溫35 ℃； 波長235 nm；理論板數(shù)按烏頭堿計(jì)算應(yīng)≥3000，相鄰兩色譜峰分離度應(yīng)>1.5?；旌蠈φ掌?、樣品色譜圖見圖1。

2.2對照品的制備 精密稱取各對照品適量，用0.05%鹽酸甲醇溶解，配成新烏頭堿、次烏頭堿、烏頭堿(分別為0.526，0.522，0.108 mg·mL-1)混合對照品儲備液。取該儲備液1 mL，加0.05%鹽酸甲醇至10 mL，定容，濾過，取20 μL進(jìn)樣。

2.3供試品溶液的制備 取過篩孔內(nèi)徑0.15 mm(100目篩)生附子粉末1 g于具塞磨口錐形瓶中，精密加入1%鹽酸10 mL，搖勻，超聲處理30 min，放至室溫，3000 r·min-1離心10 min(r=15.7 cm)，取上清液，濾過，取20 μL進(jìn)樣。

2.4線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2”項(xiàng)對照品儲備溶液1，4，8，10，12，20 μL，分別進(jìn)樣測定峰面積，以對照品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(X)，以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。新烏頭堿回歸方程Y=1 063 519.314X-31 122.424(r= 0.999 7)。結(jié)果表明，在0.526～10.520 μg范圍內(nèi)，新烏頭堿峰面積與進(jìn)樣量呈良好的線性關(guān)系；次烏頭堿回歸方程為Y=1 216 539.728X-34 643.270(r=0.999 5)。結(jié)果表明，在0.522～10.440 μg范圍內(nèi)，次烏頭堿峰面積與進(jìn)樣量呈良好的線性關(guān)系；烏頭堿回歸方程為Y=1 190 920.635X-6 345.444(r=0.999 2)。結(jié)果表明，在0.108～2.160 μg范圍內(nèi)，烏頭堿進(jìn)樣量與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

A.混合對照品；B.生附子；1.新烏頭堿；2.次烏頭堿；3.烏頭堿。

A.mixed reference substances； B.lateral roots ofAconitumcarmichaeliiDebx.；1.mesaconitine； 2.hypaconitine；3.aconitine.

Fig.1HPLCchromatogramsofmixedreferencesubstancesandlateralrootsofAconitumcarmichaeliiDebx.

2.5精密度考察 精密吸取混合對照品溶液20 μL，按上述色譜條件注入高效液相色譜儀，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。結(jié)果新烏頭堿、次烏頭堿、烏頭堿峰面積的RSD 值分別2.97%，1.14%，2.39%，表明該色譜方法精密度良好。

2.6加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取已知含量的生附子藥材粉末9份各1.000 g，分別精密加入新烏頭堿、次烏頭堿及烏頭堿對照品溶液適量，使樣品溶液中新烏頭堿、次烏頭堿及烏頭堿含量為樣品中相應(yīng)物質(zhì)含量的80%(3份)、100%(3份)、120%(3份)。照“2.3”項(xiàng)供試品溶液制備方法制備，照“2.1”項(xiàng)色譜條件測定3種雙酯型生物堿含量，分別計(jì)算加樣回收率及RSD值，結(jié)果見表1。

2.7穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密吸取同一樣品，分別于0，2，4，8，10，24 h 注入高效液相色譜儀，檢測相應(yīng)雙酯型生物堿的峰面積，新烏頭堿、次烏頭堿、烏頭堿峰面積RSD值分別為2.95%，3.01%，2.08%。結(jié)果表明采用酸水提取的供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表1 3種雙酯型生物堿加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.8重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 分別精密稱定同一批生附子粉末6份，每份1 g，照“2.3”項(xiàng)供試品溶液的制備方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測定，記錄各色譜峰面積。測得新烏頭堿、次烏頭堿、烏頭堿的峰面積RSD值分別為2.3%，1.1%，1.3%，結(jié)果表明本方法測定3種雙酯型生物堿含量重復(fù)性良好。

2.9樣品含量測定 取生附子3批，按“2.3”項(xiàng)方法制備供試品，按照“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測定，結(jié)果見表2。

3 討論

3.1提取方法考察 附子中生物堿除極少部分以游離狀態(tài)存在外，大部分以生物堿鹽的形式存在于植物細(xì)胞?！吨腥A人民共和國藥典》2015年版采用氨水堿化樣品，將生物堿游離出來，再提取。但實(shí)際操作中筆者發(fā)現(xiàn)，采用該方法提取雙酯型生物堿，含量明顯低于酸水直接提取。筆者在本實(shí)驗(yàn)中還考察了不同有機(jī)溶劑對結(jié)果的影響，結(jié)果顯示，采用三氯甲烷提取時(shí)三氯甲烷易揮發(fā)，實(shí)驗(yàn)操作困難，結(jié)果可重復(fù)性差；采用異丙醇：乙酸乙酯(1：1)提取重復(fù)性較好，但操作繁瑣，提取率偏低，約為1%酸水提取率的75%。同時(shí)，筆者在本實(shí)驗(yàn)中還考察了酸用量對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，結(jié)果表明，在1%鹽酸溶液中，烏頭堿穩(wěn)定性優(yōu)于0.5%鹽酸。因此，筆者選擇1%酸水作為最終提取液。

表2 樣品含量測定結(jié)果

Tab.2Resultsofcontentdeterminationonsamplesμg·g-1

樣品平均含量新烏頭堿次烏頭堿烏頭堿171225689.2698.2139.7180108622.9657.9128.2180302402.7457.278.1

3.2液相色譜條件的選擇 本實(shí)驗(yàn)中，筆者考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-四氫呋喃-水等系統(tǒng)作為流動相的色譜情況。由于3種雙酯型生物堿最佳檢測波長約235 nm，采用甲醇-水系統(tǒng)時(shí)基線波動較大，不利于檢測，而采用乙腈-水系統(tǒng)時(shí)可以有效避免基線波動，但烏頭堿類生物堿屬于含氮化合物，具有弱堿性，單純使用乙腈-水系統(tǒng)會有拖尾峰出現(xiàn)，因此選擇在水相中加入醋酸銨來改善峰型[7]。筆者在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，加入10 mmol·L-1醋酸銨時(shí)，僅對低濃度烏頭堿峰形有改善作用，而隨著烏頭堿濃度增加，依然有拖尾，所以最終色譜條件選擇60 mmol·L-1醋酸銨溶液作為水相。雖然乙腈-水-醋酸銨系統(tǒng)基線平穩(wěn)，峰型較好，但3種雙酯型生物堿分離度較差，調(diào)節(jié)流動相比例依然不能將其完全分離，而采用乙腈與四氫呋喃9：1混合作為有機(jī)相時(shí)，3種雙酯型生物堿分離度良好。

3.3附子的毒性及減毒 附子毒性主要來源于雙酯型生物堿，且該類化合物對Na+通道的II位點(diǎn)具有高親和力，其可增加Na+內(nèi)流，進(jìn)而引起心律失常，導(dǎo)致嚴(yán)重急性毒性(LD50約0.15 mg·kg-1)[8]。雙酯型生物堿穩(wěn)定性差，經(jīng)炮制和煎煮可水解成苯甲酰類單酯型生物堿及原堿，且隨煎煮時(shí)間的變化，其含量呈現(xiàn)一定規(guī)律變化。生成的單酯類生物堿活性較強(qiáng)且毒性顯著降低[9-11]。因此，現(xiàn)在臨床煎劑及中成藥中一般選用制附子。附子的傳統(tǒng)炮制解毒方式較多，包括去皮、炮、炒、煨、燒、黑豆制、蜜制、姜制等[12]。在此基礎(chǔ)上，有學(xué)者利用先進(jìn)的科學(xué)技術(shù)，摸索出附子炮制新工藝，如鄧文偉等[13]采用烘箱烘烤法成功制備出質(zhì)量合格的制附子，楊明等[14]采用微波炮制出藥效好、毒性低的附子。附子與其他中藥配伍也能在一定程度上減輕其毒性，例如與甘草配伍，甘草中羧酸可與附子中生物堿發(fā)生締合作用生成沉淀，進(jìn)而降低附子之毒[15]。

綜上所述，筆者在本實(shí)驗(yàn)建立的液相檢測方法能同時(shí)測定生附子中烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿含量，且該方法簡單、靈敏，可用于附子中雙酯型生物堿的質(zhì)量控制。