基于復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)的胃癌關(guān)鍵基因篩選與分析

王曉曼 劉文奇

（昆明理工大學(xué)理學(xué)院，昆明，650093）

引 言

近些年來，復(fù)雜性科學(xué)的實踐研究迅速發(fā)展，分析方法不斷更新，技術(shù)應(yīng)用范圍日益擴(kuò)展。對于一個復(fù)雜系統(tǒng)，單獨研究系統(tǒng)中的個體已經(jīng)不能反映系統(tǒng)的性質(zhì)。往往把系統(tǒng)中的個體視為節(jié)點，個體之間的關(guān)系抽象成邊，這樣就可以用復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)來研究系統(tǒng)的整體性質(zhì)。目前，復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)理論應(yīng)用的范圍越來越廣泛，不僅應(yīng)用到軍事[1]、政治[2]和交通[3]，且已被用來理解生物系統(tǒng)中的基因功能[4]。

近些年來，癌癥患者的數(shù)量逐步上升，中國每年就新增400多萬癌癥患者。胃癌作為如今最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率僅次于肺癌、乳腺癌、結(jié)/直腸癌和前列腺癌。早期胃癌病人的生存率能達(dá)到90%，但是大部分胃癌患者確診時就已經(jīng)喪失治療機會。楊維良等[5]的研究表明胃癌為一種高發(fā)、高惡性度、預(yù)后不良的惡性腫瘤,長期以來包括手術(shù)切除及其他綜合性治療的應(yīng)用,并沒有帶來滿意的生存率。胃癌本身的生物學(xué)過程歸根結(jié)底也是基因突變產(chǎn)生的,因此基因水平的治療成為胃癌治療學(xué)取得新突破的希望。如果能應(yīng)用科學(xué)的數(shù)據(jù)分析方法，找到胃癌惡化過程中的關(guān)鍵基因，就能為癌癥患者帶來意想不到的收益。

王頻等[6]的研究已經(jīng)通過RNA測序建立的癌癥數(shù)據(jù)（The cancer genome atlas，TCGA）和Affymetrix芯片（Affymetrix genechip arrays,HG-U133 Plus 2.0）產(chǎn)生的GSE307207這兩個數(shù)據(jù)庫中正常胃組織和癌癥組織之間的基因表達(dá)，篩選出存在顯著差異的胃癌相關(guān)基因。這樣就大量剔除了與胃癌無關(guān)的基因，為分析關(guān)鍵基因縮小了范圍。

周暉杰[7]與李星[8]研究表明，基因與蛋白質(zhì)很少單獨起作用,而是通過網(wǎng)狀的相互作用而影響生物表達(dá),因此基因組的研究也從結(jié)構(gòu)基因組轉(zhuǎn)向了功能基因組的研究,通過對基因網(wǎng)絡(luò)的分析來了解生物系統(tǒng)的功能。Laura等[9]的研究表明，網(wǎng)絡(luò)生物學(xué)是解釋健康與疾病背景下基因組數(shù)據(jù)的一種系統(tǒng)性方法。其次王華等[10]已經(jīng)將復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)的分析方法應(yīng)用到高血壓特征基因的篩選中。由于高血壓疾病在細(xì)胞、組織與生理水平上都表現(xiàn)出復(fù)雜性，因此應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)分析方法來研究高血壓疾病。根據(jù)基因表達(dá)數(shù)據(jù)的相關(guān)性構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)模型，網(wǎng)絡(luò)中的樞紐基因顯示出與具有不同表達(dá)水平的大多數(shù)基因相同的變化趨勢，并且具有相近的表達(dá)模式。所以樞紐基因比其他基因更具代表性，這些樞紐基因可成為病情分析的關(guān)鍵依據(jù)。

本文將復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)與胃癌測序數(shù)據(jù)相聯(lián)系，將胃癌相關(guān)基因抽象為節(jié)點，依據(jù)胃癌ⅡB期樣本與胃癌ⅢA期樣本間的基因變化率構(gòu)建胃癌基因表達(dá)復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)。通過分析該胃癌基因表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的相關(guān)拓?fù)湫再|(zhì)，發(fā)現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)是稀疏的且具有小世界性。通過計算節(jié)點的度中心性、介數(shù)中心性和緊密度中心性，并引入綜合中心性指標(biāo)，篩選出中心性較高的基因并做出了驗證，因此建議了胃癌惡化過程中的樞紐基因，為胃癌惡化提供了良好的預(yù)警信號。

1 數(shù)據(jù)的預(yù)處理

本文使用的原始數(shù)據(jù)來自TCGA數(shù)據(jù)庫，包括7種胃癌分期共408個樣本，每個樣本包含60484個基因測序。由于原始數(shù)據(jù)量非常龐大，應(yīng)對數(shù)據(jù)進(jìn)行初步篩選和降維。

首先使用兩個可公開的國際腫瘤數(shù)據(jù)庫：由RNA測序建立的癌癥數(shù)據(jù)TCGA和Affymetrix芯片產(chǎn)生的GSE307207。比較這兩個數(shù)據(jù)庫中正常胃組織和癌癥組織之間的基因表達(dá)，確定了存在顯著差異的基因。TCGA和GSE30727分別有688個和3239個基因達(dá)到了標(biāo)準(zhǔn)（2倍變化和校正后p值＜0.05）。TCGA和GSE30727數(shù)據(jù)集之間存在275個重疊基因，將這275個基因保留，用于后續(xù)的分析[6]。這樣就篩選出與胃癌相關(guān)的基因，剔除了大量無關(guān)基因，為分析關(guān)鍵基因縮小了范圍。

其次，原始數(shù)據(jù)包含胃癌不同分期不同分形共408個樣本，樣本數(shù)量較大。根據(jù)癌癥TNM分期標(biāo)準(zhǔn)（依據(jù)腫瘤浸潤的深度、是否存在淋巴結(jié)以及是否遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。T代表腫瘤浸潤胃壁的深度，N表示局部淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移情況，M則代表有沒有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的情況，可將胃癌分為Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ，4個臨床病理分期，每期又具有不同的分形，本文篩選的樣本應(yīng)用第七版胃癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)如表1所示。根據(jù)大宗臨床報道,實行規(guī)范治療的1期胃癌患者5年生存率為82%～95%，2期為55%，3期為15%～30%，4期為2%[11]。在臨床意義上講，當(dāng)胃癌處于ⅡB期時，腫瘤未侵及胃的外部或者侵浸胃的外部但是腫瘤未轉(zhuǎn)移。處于此時的胃癌患者仍屬于傳統(tǒng)意義上的胃癌前期，有很大的治愈希望。當(dāng)胃癌處于ⅢA期時，腫瘤侵及腹腔臟層腹膜或侵浸到胃的外部[12]。處于這階段的胃癌患者，腫瘤已經(jīng)侵浸胃的外部并發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，在臨床上已經(jīng)發(fā)展為胃癌的中期，治愈希望較低（表2）。因此篩選處于胃癌ⅡB期病人的基因序列（40個樣本）與處于胃癌ⅢA期病人的基因序列（36個樣本）做為對照，分析胃癌從ⅡB期到ⅢA期轉(zhuǎn)變過程中的關(guān)鍵基因，致力于為胃癌惡化提供良好的預(yù)警信號。

表1 第7版胃癌TNM分期分型Tab.1 Seventh edition gastric cancer TNM staging classification

表2 胃癌不同分期的臨床表現(xiàn)Tab.2 Clinical manifestations of different stages of gastric cancer

2 胃癌基因表達(dá)網(wǎng)絡(luò)模型

本文選取了兩個樣本組的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，分別是處于ⅡB期的胃癌患者，共40個樣本，記為H；以及處于ⅢA期的胃癌患者，共36個樣本，記為S。通過構(gòu)建胃癌基因復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)模型，來研究胃癌基因表達(dá)數(shù)據(jù)的變換趨勢與胃癌表型之間的關(guān)系。

2.1 基胃癌計算胃癌基因表達(dá)數(shù)據(jù)變化率

選取第2部分中初步篩選出的275個胃癌相關(guān)基因，將它們定義為網(wǎng)絡(luò)節(jié)點，網(wǎng)絡(luò)規(guī)模N=275。其中每1個節(jié)點都代表1個基因，用基因名稱進(jìn)行標(biāo)注。首先，對于每個節(jié)點i，定義胃癌ⅡB期樣本到胃癌ⅢA期樣本的基因變化率為

式中：i=1,2,…,275，S=36，h=40。接下來計算出每個節(jié)點對應(yīng)的基因變化率Ri，通過式（2）很容易得到基因變化率的平均值T=0.3617。這個平均值可以為下一步的閾值選取作為參考。

2.2 基因復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)的連邊規(guī)則

由于胃癌基因變化率的平均值較大，應(yīng)選擇一個較小的閾值，增大基因間的關(guān)聯(lián)性，降低節(jié)點間的擾動對網(wǎng)絡(luò)的影響。通過多次實驗，選定0.008T作為閾值，此時網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)較為穩(wěn)定，基因間的關(guān)聯(lián)性較強，節(jié)點間的擾動較小[13]。建立連邊的規(guī)則如下：比較節(jié)點i與節(jié)點j的基因變化率差值，當(dāng)差值小于0.008T時，兩個節(jié)點間的變化趨勢相近，則在這兩個節(jié)點間建立一條邊。式（3）為胃癌基因復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)連邊規(guī)則的數(shù)學(xué)表達(dá)

應(yīng)用上述思路，構(gòu)建了1個包含275個節(jié)點（基因）和828條邊的胃癌基因表達(dá)網(wǎng)絡(luò)。通過Pajek軟件將該網(wǎng)絡(luò)可視化。圖1為胃癌基因表達(dá)網(wǎng)絡(luò)示意圖，圖中間是網(wǎng)絡(luò)的密集部分，有較高的連接數(shù)，圖2是網(wǎng)絡(luò)密集部分的放大圖。

下面對該胃癌基因復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)的相關(guān)拓?fù)湫再|(zhì)進(jìn)行簡單分析。

該胃癌基因表達(dá)網(wǎng)絡(luò)包含275個節(jié)點，假設(shè)該網(wǎng)絡(luò)是一個完全連通網(wǎng)絡(luò)，則網(wǎng)絡(luò)的最大連通度為

圖1 胃癌基因表達(dá)網(wǎng)絡(luò)示意圖Fig.1 Schematic diagram of gastric cancer gene network

圖2 胃癌基因網(wǎng)絡(luò)示意圖密集部分放大圖Fig.2 Enlarged view of the gastric cancer gene network

然而，該網(wǎng)絡(luò)共有828條邊，平均度為6.02，其平均度遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于該網(wǎng)絡(luò)的最大連通度，故可以認(rèn)為該胃癌基因表達(dá)網(wǎng)絡(luò)是稀疏的。這表明，每個基因的表達(dá)趨勢可能只與少量的基因表達(dá)數(shù)據(jù)變化趨勢一致，也就是說，每個基因受其他基因調(diào)控的平均數(shù)量較小。

平均路徑長度是指網(wǎng)絡(luò)中所有頂點對之間最短路徑的平均值，可通過平均路徑衡量網(wǎng)絡(luò)中不同基因數(shù)據(jù)變化的差異[14]。通過計算，該胃癌基因表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的平均路徑長度約為9.48，平均路徑較小，有

通過式（5），可計算得到該胃癌基因表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的聚類系數(shù)C=0.641。該網(wǎng)絡(luò)的聚類系數(shù)約是同規(guī)模隨機網(wǎng)絡(luò)的28倍。綜上所述，胃癌基因表達(dá)網(wǎng)絡(luò)具有較大的聚類系數(shù)與較小的平均路徑長度，滿足小世界特性。

3 胃癌關(guān)鍵基因

構(gòu)建出胃癌基因表達(dá)網(wǎng)絡(luò)后，發(fā)現(xiàn)該網(wǎng)絡(luò)具有稀疏性和小世界特性，這意味著平均每個基因可能受較少的基因調(diào)控，這些起到關(guān)鍵作用的基因可能具有較強的中心性。那如果能找到基因表達(dá)網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵基因，就能為胃癌惡化提供良好的預(yù)警信號。下面將分析胃癌基因復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點的3種中心性，包括介數(shù)中心性、緊密度中心性和度中心性，應(yīng)用定量的方法對每個節(jié)點的中心度進(jìn)行描述，進(jìn)而確定胃癌基因表達(dá)網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵基因。

度中心性[15]

式中:ki為節(jié)點i的度，N為網(wǎng)絡(luò)節(jié)點總數(shù)。度中心性定義為節(jié)點的度與網(wǎng)絡(luò)中其他節(jié)點總數(shù)的比值。通過度中心性可以迅速找到該網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵節(jié)點。

介數(shù)中心性[15]

式中:gjk(i)為節(jié)點j與節(jié)點k的最短路徑經(jīng)過節(jié)點i的數(shù)量，gjk為節(jié)點j到節(jié)點i的最短路徑數(shù)。介數(shù)中心性定義為節(jié)點i與節(jié)點k之間經(jīng)過節(jié)點i的最短路徑數(shù)與節(jié)點i與節(jié)點k之間的最短路徑總數(shù)之比。介數(shù)中心性衡量的是經(jīng)過該節(jié)點最短路徑數(shù)的度量。通過介數(shù)中心性可以迅速找到該網(wǎng)絡(luò)中的重要節(jié)點。

緊密度中心性[15]

式中:Li節(jié)點i到網(wǎng)絡(luò)中每個節(jié)點距離的平均值。緊密度中心性定義為節(jié)點i到網(wǎng)絡(luò)中每個節(jié)點距離的平均值的倒數(shù)。一般觀點認(rèn)為，網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)渲行氖蔷W(wǎng)絡(luò)中其他節(jié)點到該節(jié)點距離最小的節(jié)點，因此，緊密度中心性可以作為復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)中的中心性度量。

分別應(yīng)用式（1-3）對度中心指標(biāo)、介數(shù)中心性指標(biāo)和緊密度中心性指標(biāo)進(jìn)行計算，各中心指標(biāo)結(jié)果靠前的基因分別列在了表3中。由于有多個基因的某個中心性指標(biāo)相同，所以選定度中心性排名前32的基因、介數(shù)中心性排名前20的基因以及緊密度中心性排名前22的基因列在表3中。

從表3中可以得出，度中心性大的節(jié)點往往它們的緊密度中心性也較大，介數(shù)中心性大的節(jié)點其緊密度中心性也是相對較大的。但是介數(shù)中心性的值普遍較小，如果直接分析不能發(fā)揮介數(shù)中心性的重要性。

圖3給出了基于度中心性、介數(shù)中心性、緊密度中心性的重要胃癌基因的分布示意圖，可以發(fā)現(xiàn)，3種中心性指標(biāo)均靠前的是MMP11基因。但是由于中心性指標(biāo)間的差異性，并沒有太多的重疊基因。

表3 胃癌度中心性、介數(shù)中心性、緊密度中心和綜合中心性指標(biāo)靠前的基因及數(shù)值Tab.3 Top genes and values for three central and comprehensive central indicators of gastric cancer

圖4繪出了胃癌基因度中心性、介數(shù)中心性和緊密度中心性3種指標(biāo)分布的三維圖，從圖4中可以看出同時具有較高的3種中心性指標(biāo)的節(jié)點應(yīng)分布于圖的最上部，這些節(jié)點就有可能是網(wǎng)絡(luò)的樞紐節(jié)點。

引用加權(quán)分析的方法將這3種指標(biāo)定量化，來計算每個節(jié)點的綜合中心性指標(biāo)。根據(jù)式（9），將度中心性、介數(shù)中心性、緊密度中心性分別歸一化為一個相對性中心性指標(biāo)：Ca(i)/Ca.max，Cb(i)/Cb.max和Cc(i)/Cc.max，將綜 合中心性指標(biāo)定義為3個中心性指標(biāo)的平均值[10]。篩選出綜合中心指標(biāo)前20的基因，將其列在表3當(dāng)中。

通過對表3中的4種中心性指標(biāo)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)，綜合性中心指標(biāo)排名第1的基因MMP11，其3種中心性指標(biāo)均是較高的。由于度中心性差值較小，其他綜合性中心指數(shù)較高的基因其度中心性不一定排名靠前，但是相對擁有較高的介數(shù)中心性和緊密度中心性，這并不意味著其度中心性是較低的。通過對表3進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)基因INTS8到基因SGSM3的綜合中心性指標(biāo)下降過快，選定綜合性指標(biāo)Cintgr＞0.72的16個基因作為關(guān)鍵基因，此外，由于ALDH6A1基因的度中心較高（排名第3位），在基因表達(dá)網(wǎng)絡(luò)中擁有較高的度，連接著較多的節(jié)點，因此也應(yīng)考慮其為關(guān)鍵基因。應(yīng)說明的是，選擇基因是否為關(guān)鍵基因的閾值可大可小，若想增大或減小關(guān)鍵基因的數(shù)量，應(yīng)將閾值調(diào)小或調(diào)大。

圖3 基于3種中心性指標(biāo)的重要胃癌基因分布圖Fig.3 Gene map of important gastric cancer based on three central indicators

圖4 度中心性、介數(shù)中心性和緊密度中心性分布的三維圖Fig.4 Three-dimensional map of three central distributions

將該胃癌基因復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分區(qū)視圖，如圖5所示，文獻(xiàn)[16]指出發(fā)現(xiàn)度中心性較小的節(jié)點往往分布更加廣泛。而大多數(shù)基因都集合在一個完全連通的子網(wǎng)絡(luò)中，在此子網(wǎng)絡(luò)中，中心性較高的基因鏈接著更多的基因，在基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中處于關(guān)鍵地位。通過式（9）選取的中心度較高的17個基因全部落在該子網(wǎng)絡(luò)中，這與網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵基因定量考慮的結(jié)果一致。

因此可以確定出胃癌基因表達(dá)網(wǎng)絡(luò)中的17個重要的樞紐基因，分別是：MMP11，TMEM63A，CKAP2，IFITM1，NOP2，ADAT1，ACTL6A，F(xiàn)ERMT1，ECT2，SLC6A6，TNFRSF12A，CHORDC1，COL6A3，YEATS2，NCL，INTS8和ALDH6A1。

依據(jù)胃癌基因在ⅡB與ⅢA樣本間的表達(dá)變化率構(gòu)建胃癌基因復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)，將每個基因抽象為節(jié)點，分析了該網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)涮卣?。通過Pajek軟件對基因的3種中心性指標(biāo)進(jìn)行計算，進(jìn)一步引入綜合中心性指標(biāo)，進(jìn)而篩選出上述17個關(guān)鍵的胃癌基因。

圖5 胃癌基因復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)社區(qū)結(jié)構(gòu)圖Fig.5 Gastric cancer gene complex network community structure

4 結(jié)束語

本文對TCGA胃癌數(shù)據(jù)進(jìn)行初步的篩選和降維，篩選出與胃癌相關(guān)的275個胃癌基因，為分析關(guān)鍵基因縮小了范圍。原始數(shù)據(jù)包含胃癌不同分期不同分形共408個樣本，樣本數(shù)量較大。根據(jù)胃癌TNM分期，篩選胃癌ⅡB期（40個樣本）與ⅢA期（36個樣本）做為對照，分析胃癌從ⅡB期到ⅢA期轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵基因，致力于發(fā)現(xiàn)胃癌惡化過程中的特征基因。其次應(yīng)用復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)的方法，將網(wǎng)絡(luò)分析的方法與胃癌基因表達(dá)數(shù)據(jù)結(jié)合起來。將胃癌基因抽象為節(jié)點，依據(jù)兩組樣本組間基因的變化率，選擇合理的閾值來建立連邊關(guān)系。然后分析了該網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)涮卣?，發(fā)現(xiàn)胃癌基因表達(dá)網(wǎng)絡(luò)是稀疏的，具有小世界特性。計算了該復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)節(jié)點的3種中心度指標(biāo)，分別是度中心性、介數(shù)中心性和緊密度中心性，然后引入綜合中心性指標(biāo)，篩選出17個中心指標(biāo)較高的基因。最后對該胃癌基因復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行社區(qū)劃分，發(fā)現(xiàn)這17個中心度較高的基因都在一個規(guī)模較大的連通子網(wǎng)絡(luò)中，進(jìn)而驗證了結(jié)論。因此建議了胃癌惡化過程中的關(guān)鍵基因，為胃癌惡化提供了良好的預(yù)警信號。

本文研究的問題是基于復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)理論和數(shù)據(jù)分析方法，篩選出胃癌惡化過程中17個的關(guān)鍵基因，但基因間的鏈路關(guān)系還需進(jìn)一步的研究。另外，本文是基于病例數(shù)據(jù)做出的篩選與分析，缺乏動物實驗?zāi)Ｐ万炞C，這需要繼續(xù)研究學(xué)習(xí)。