自噬相關(guān)基因LC3Ⅱ和LAMP-2a在鼻息肉中的表達(dá)及意義

梁成 陳智斌

Chen等[1]通過(guò)研究表明：CRSwNP組織中自噬表達(dá)下調(diào)，2015年齊君君等[2]發(fā)現(xiàn)鼻息肉組織的自噬相關(guān)基因及蛋白Beclinl-1表達(dá)下調(diào)、P62表達(dá)上調(diào)，CRSwNP組織中自噬水平降低。研究還發(fā)現(xiàn)，自噬水平的改變、缺陷以及功能障礙與呼吸道黏膜上皮損傷的形成、持續(xù)有著不可分割的聯(lián)系[3-5]。推測(cè)自噬參與鼻竇炎鼻息肉的形成，LC3Ⅱ和LAMP-2a分別作為大自噬和分子伴侶介導(dǎo)的自噬中最常見(jiàn)的標(biāo)志物，通過(guò)觀察它們?cè)诒乔唤M織中的表達(dá)情況，有利于更深一步了解自噬與鼻竇炎鼻息肉的關(guān)系。

資料與方法

1 研究對(duì)象

選取本院CRSwNP患者鼻息肉組織以及鼻中隔偏曲患者下鼻甲組織（2016.08～2017.08），根據(jù)病理HE染色分成非嗜酸性粒細(xì)胞性鼻息肉組（mENP）10例（男8例，女 2例，年齡 33～66歲，平均 49.5歲），嗜酸性粒細(xì)胞性鼻息肉組（ENP）10例（男6例，女4例；年齡27～68歲，平均47.5歲），下鼻甲組（IT）10例(男 8例，女 2例；年齡 18～55歲，平均 36.5歲)。診斷標(biāo)準(zhǔn)參照中國(guó)慢性鼻竇炎診斷和治療指南（2018）[6]。排除條件：術(shù)前1個(gè)月內(nèi)接受抗生素及糖皮質(zhì)激素治療，或患有腫瘤、免疫缺陷及結(jié)核等嚴(yán)重全身疾病。該項(xiàng)目經(jīng)本院倫理委員會(huì)同意，取得了充分的知情同意，并簽署相關(guān)知情同意書(shū)。

2 主要試劑及方法

2.1 HE染色法

首先清洗組織標(biāo)本，在常溫條件下，用10%的中性緩沖福爾馬林固定標(biāo)本24h，脫水，石蠟包埋，連續(xù)2μm切片，HE染色，觀察鼻息肉組織的整體細(xì)胞學(xué)構(gòu)造。

2.2 免疫組化PV法

操作按照試劑盒 (福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司)說(shuō)明書(shū)，將切片標(biāo)本置于65℃烤箱烘烤2h，按序使用檸檬酸鈉抗原修復(fù)液高壓修復(fù)3min，過(guò)氧化氫阻斷內(nèi)源酶，一抗LC3Ⅱ抗體（英國(guó)Biorbyt公司，orb97657）及LAMP-2a抗體（美國(guó)Abcam公司，ab18528）工作濃度均為 1∶500，4℃冰箱孵育過(guò)夜，二抗37℃孵育25min，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)染色5min，蘇木素復(fù)染5～10s，脫水透明封片。

2.3 免疫組化的評(píng)分

4個(gè)低倍鏡(×200)視野中組織細(xì)胞呈棕黃色、棕褐色判定為陽(yáng)性細(xì)胞，4個(gè)高倍鏡(×400)視野中計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞比例，依次為：無(wú)以及極少量為(-)得0分；0%～25%為(+)得 1分；25%～50%為(++)得 2分；大于50%～75%為(+++)得 3分；大于75%為(++++)得 4分。

3 統(tǒng)計(jì)分析

使用軟件SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，首先使用 levene 檢驗(yàn)方差的齊性和正態(tài)分布，用兩個(gè)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)（t＜50），P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 鼻息肉HE染色分型

鼻息肉由極度水腫的結(jié)締組織形成，間質(zhì)中可見(jiàn)不同程度的炎性反應(yīng)細(xì)胞浸潤(rùn)，神經(jīng)以及血管顯著減少。選取4個(gè)高倍鏡下視野并計(jì)算嗜酸性粒細(xì)胞（EOS）比例的平均值，高于10%則為ENP，低于10%則為 nENP[7]。見(jiàn)圖 1，圖 2。

圖1 大量EOS浸潤(rùn)（400倍）

圖2 少量EOS浸潤(rùn)（400倍）

2 免疫組化與統(tǒng)計(jì)學(xué)

2.1 標(biāo)記蛋白定位

鼻息肉和下鼻甲黏膜中的LC3Ⅱ和LAMP-2a在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜中呈強(qiáng)陽(yáng)性黃色表達(dá)，胞核也可以呈棕黃色染色。

2.2 蛋白質(zhì)表達(dá)強(qiáng)度

LC3Ⅱ在IT組織中，上皮、腺體以及間質(zhì)強(qiáng)表達(dá)（圖3），在ENP組織中主要以上皮強(qiáng)表達(dá)為主，間質(zhì)以及腺體少量表達(dá)（圖4），在nENP組織中上皮、間質(zhì)弱表達(dá)，腺體少量表達(dá)（圖5）；LAMP-2a在IT組織中上皮、腺體強(qiáng)表達(dá)，間質(zhì)少量表達(dá)（圖6），在ENP組織中上皮、腺體、間質(zhì)呈中等程度陽(yáng)性表達(dá)（圖7），在nENP組織中上皮呈弱表達(dá)，間質(zhì)、腺體少量表達(dá)（圖8）。

2.3 統(tǒng)計(jì)結(jié)果

見(jiàn)表 1～6。

圖3 LC3Ⅱ在IT中的表達(dá)（200倍）

圖4 LC3Ⅱ在ENP中的表達(dá)（200倍）

圖5 LC3Ⅱ在nENP中的表達(dá)（200倍）

圖6 LAMP-2a在IT中的表達(dá)（200倍）

圖7 LAMP-2a在ENP中的表達(dá)（200倍）

圖8 LAMP-2a在nENP中的表達(dá)（200倍）

表1 LC3Ⅱ免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

表2 LC3Ⅱ在三組間兩兩比較

表3 LAMP-2a免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

表4 LAMP-2a在三組間兩兩比較

表5 息肉組織中LC3Ⅱ和LAMP-2a的表達(dá)結(jié)果

表6 息肉組織中LC3Ⅱ和LAMP-2a檢驗(yàn)及相關(guān)性

討論

對(duì)于鼻息肉的形成，目前認(rèn)為主要與感染、變態(tài)反應(yīng)、超抗原、生物膜、解剖異常以及基因表達(dá)異常等多重因素有關(guān)[8，9]。有限的研究表明，鼻息肉的自噬降低了[10]，而異常的自噬行為可導(dǎo)致鼻息肉的形成。自噬是一個(gè)高度保守的分解代謝過(guò)程，包括蛋白質(zhì)聚集物、損傷的細(xì)胞器（線(xiàn)粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等）以及各種病原體的自溶體降解，它代表一種適應(yīng)性反應(yīng)，以維持細(xì)胞和組織內(nèi)的穩(wěn)態(tài)，應(yīng)對(duì)眾多的細(xì)胞壓力。

自噬主要包括大自噬、小自噬和分子伴侶介導(dǎo)的自噬。LC3Ⅱ是監(jiān)測(cè)大自噬水平穩(wěn)定可靠的特異性標(biāo)志物，其含量在一定程度上反映了自噬的數(shù)量，隨著自噬體膜的增加和LC3II表達(dá)的增加[11]，LC3II含量與自噬活性呈正相關(guān)，其含量可間接反映自噬水平[12]。正常情況下胞漿內(nèi)的蛋白以及細(xì)胞器在胞漿中大致呈整體均勻分布，而本組實(shí)驗(yàn)中在高倍鏡(×400)視野下觀察鼻息肉組織時(shí)，可見(jiàn)大量棕色點(diǎn)狀聚集形成于鼻息肉假?gòu)?fù)層纖毛上皮細(xì)胞胞漿以及胞核內(nèi)，說(shuō)明機(jī)體在受到損害時(shí)細(xì)胞自噬活動(dòng)增加，細(xì)胞胞漿中LC3Ⅱ蛋白呈明顯的點(diǎn)狀或斑塊聚集，從形態(tài)學(xué)上表明自噬水平上調(diào)，但是又比正常下鼻甲組組織的表達(dá)強(qiáng)度明顯低，故鼻息肉組織的自噬水平較鼻甲組織是下降的，尤其在非嗜酸性粒細(xì)胞性鼻息肉組織中表現(xiàn)明顯。通過(guò)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析：首先，LC3Ⅱ在IT組的表達(dá)水平高于鼻息肉（nENP+ENP）組，顯示了鼻腔組織從鼻甲黏膜到鼻息肉的形成過(guò)程中，大自噬水平是降低的或是不足，但兩者之間表達(dá)強(qiáng)度差異并沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；其次，三組間兩兩比較發(fā)現(xiàn)IT組和nENP組的表達(dá)強(qiáng)度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而IT組和ENP組的表達(dá)強(qiáng)度差異卻沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，所以推測(cè)大自噬在鼻息肉組織中的下降僅僅出現(xiàn)在nENP組織中，ENP組織中大自噬的水平可能并不受影響，這不同于以往研究中關(guān)于鼻息肉中自噬水平下降這一相對(duì)籠統(tǒng)的觀點(diǎn)；進(jìn)一步的分析nENP和ENP組織中LC3Ⅱ的表達(dá)差異發(fā)現(xiàn)，nENP的表達(dá)量顯著低于ENP，且兩者的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，推測(cè)EOS的浸潤(rùn)可能會(huì)上調(diào)鼻息肉組織中的大自噬水平，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，臨床上即表現(xiàn)為EOS的浸潤(rùn)加重了鼻息肉組織的炎癥。事實(shí)上在很多炎癥、腫瘤的形成過(guò)程中，自噬都表現(xiàn)出降低的情況，但是，Yoshioka等揭示了在食道和胃腸惡性腫瘤中LC3II表達(dá)明顯高于癌旁組織。因此推測(cè)不同類(lèi)型疾病形成LC3Ⅱ表達(dá)及作用各不相同。LAMP-2a是分子伴侶介導(dǎo)自噬（chaperonmediated autophagy,CMA）降解底物蛋白中含量最高的標(biāo)志物，反映CMA的活性。一般情況下，CMA在輕度氧化應(yīng)激作用下被激活時(shí)，LAMP-2a可表現(xiàn)出上調(diào)[13]，而本組實(shí)驗(yàn)中在高倍鏡(×400)視野下觀察鼻息肉組織時(shí)，細(xì)胞胞漿中LAMP-2a蛋白呈明顯的點(diǎn)狀或斑塊聚集，從形態(tài)學(xué)上表現(xiàn)出和LC3Ⅱ相似的情況。本研究發(fā)現(xiàn)，由于僅IT組和nENP組的表達(dá)強(qiáng)度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，IT組和NP組、IT組和ENP組、nENP和ENP的表達(dá)強(qiáng)度差異均沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，所以推測(cè)CMA在鼻息肉組織中的下降也僅僅出現(xiàn)在nENP組織中，但與EOS的浸潤(rùn)可能會(huì)上調(diào)鼻息肉組織中的大自噬水平不同，EOS的浸潤(rùn)并不影響鼻息肉組織中CMA的表達(dá)。

從本次實(shí)驗(yàn)LC3Ⅱ與LAMP-2a的聯(lián)合檢測(cè)中能夠更完整推測(cè)：在炎癥、缺氧等條件刺激下，鼻息肉上皮細(xì)胞的自噬活動(dòng)被激發(fā)增強(qiáng)，當(dāng)這種激發(fā)增強(qiáng)的自噬不足以清除上皮細(xì)胞內(nèi)的有害物質(zhì)時(shí)，可能會(huì)誘發(fā)鼻息肉的逐步形成，從而表現(xiàn)出自噬活性的降低，在鼻息肉組織中LC3Ⅱ的表達(dá)水平（2.85±0.87）顯著高于 LAMP-2a（1.15±0.81），且它們之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，顯示在鼻息肉組織的自噬路徑中，大自噬起到主導(dǎo)作用，CMA因其不具有特異性而表現(xiàn)出其從屬性。所以在不同的微環(huán)境條件下，它們可能被同時(shí)激活彼此間既有交融也有相對(duì)獨(dú)立的發(fā)揮空間。然而，迄今為止，大自噬和CMA參與鼻息肉形成的具體過(guò)程卻尚未見(jiàn)報(bào)道，但是可以確定的是自噬與許多慢性炎癥疾病有關(guān)。研究表明,自噬可以調(diào)節(jié)炎癥小體的活化，抑制炎性細(xì)胞因子IL-1β和IL-18的產(chǎn)生，誘導(dǎo)鼻黏膜上皮細(xì)胞自噬不足，通過(guò)激活凋亡通路,誘導(dǎo)上皮細(xì)胞凋亡，在病理情況下，凋亡細(xì)胞過(guò)多，特別是呼吸道上皮細(xì)胞缺失如鼻黏膜上皮細(xì)胞損傷和缺失，會(huì)引起上皮細(xì)胞屏障功能的損傷。同時(shí)也為細(xì)菌、病毒以及有害物質(zhì)的入侵提供了便利條件和入口，引起黏膜下炎癥細(xì)胞及炎癥因子的聚集，它導(dǎo)致慢性鼻竇炎慢性黏膜下炎癥的持續(xù)存在。鼻息肉組織中缺乏自噬，導(dǎo)致鼻息肉組織來(lái)源的成纖維細(xì)胞COX-2產(chǎn)生促炎癥介質(zhì)，組織結(jié)構(gòu)重塑也導(dǎo)致慢性炎癥持續(xù)。嗜酸性粒細(xì)胞也可產(chǎn)生細(xì)胞因子、ECP、MBP等，加重其微環(huán)境結(jié)構(gòu)特征的炎癥反應(yīng)，后者可影響鼻腔上皮細(xì)胞的鈉離子通道，導(dǎo)致鈉離子吸收增加，組織水腫，鼻息肉的生長(zhǎng)和增多，實(shí)驗(yàn)顯示EOS的浸潤(rùn)會(huì)導(dǎo)致息肉組織中的自噬水平提高，即表現(xiàn)為更重的炎癥反應(yīng)，進(jìn)一步證實(shí)了嗜酸性粒細(xì)胞鼻息肉有更加嚴(yán)重的臨床表現(xiàn)這一事實(shí)[14]。鼻息肉病以持續(xù)炎癥為特征，但發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，尚存在爭(zhēng)議。自噬能否成為治療鼻息肉的手段目前完全是未知的。近些年來(lái)，針對(duì)調(diào)控自噬的靶向治療藥物成為了耳鼻喉科醫(yī)生研究的熱點(diǎn)，研究發(fā)現(xiàn)地塞米松誘導(dǎo)編碼應(yīng)激反應(yīng)蛋白Dig2、RTP801、REDDl的基因的表達(dá)[15]，而 Dig2、RTP801、REDDl(mTOR 信號(hào)通路的負(fù)調(diào)節(jié)物)的升高能夠誘導(dǎo)自噬。因此，地塞米松提高了自噬基因的表達(dá)[16]，減輕息肉炎癥反應(yīng)，臨床試驗(yàn)也證實(shí)皮質(zhì)類(lèi)固醇類(lèi)藥物洗脫鼻竇植入物對(duì)ENP的治療表現(xiàn)出顯著的療效[17]。

綜上所述，nENP組織中自噬水平呈整體性下降，細(xì)胞內(nèi)免疫防御機(jī)制失調(diào)，進(jìn)而胞外激發(fā)免疫細(xì)胞特異性識(shí)別，導(dǎo)致鼻腔組織炎癥發(fā)生以及持續(xù)，而EOS的浸潤(rùn)可能會(huì)提高鼻息肉組織中的大自噬水平，也即增強(qiáng)了鼻息肉組織的炎癥反應(yīng)。