小紅參對心肌缺血/再灌注損傷NO、氧化應(yīng)激及線粒體能量代謝的影響*

張光云，童 英，王 礴，陳 普

（云南中醫(yī)藥大學(xué)云南省傣醫(yī)藥與彝醫(yī)藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650500）

心肌缺血/再灌注損傷（Myocardial Ischemia Rreperfusion Injury，MIRI）是嚴(yán)重影響心肌缺血后溶栓治療效果的重要病理過程，其發(fā)生多認(rèn)為與大量氧自由基、炎癥反應(yīng)、Ca2+超載、線粒體功能障礙、血管內(nèi)皮損傷等有關(guān)。其中氧化應(yīng)激損傷和氧自由基連鎖反應(yīng)、血管內(nèi)皮損傷及線粒體能量代謝障礙被認(rèn)為是導(dǎo)致MIRI二次損傷的關(guān)鍵因素[1-2]。大量研究發(fā)現(xiàn)，藥物可通過抗氧自由基、增加eNOS活性及其產(chǎn)生的NO含量，改善線粒體能量代謝減輕MIRI，從而發(fā)揮保護(hù)心肌細(xì)胞的作用[3-5]。小紅參為茜草科茜草屬植物滇茜草（Rubia yunnanensis Diels.）的干燥根及根莖[6]，在云南民間用于治療胸痹心痛、心悸、高血壓、脈管炎等已有上百年的歷史?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)小紅參具有抗心肌缺血的作用，主要表現(xiàn)為抗血小板聚集，增強(qiáng)小鼠耐缺氧能力和心肌中ATP含量[7]；增加狗急性心肌缺血的冠脈血流量以減輕心肌的損傷[8]；且抗心肌缺血的活性部位主要在乙酸乙酯提取物中[9]。課題組前期研究已表明小紅參乙酸乙酯部位具有縮小心肌梗死面積，降低心電圖S-T段抬高，減少心肌損傷標(biāo)志物CK-MB和cTnI含量的作用（此部分?jǐn)?shù)據(jù)正在他刊投稿中）。因此，基于前期研究和氧化應(yīng)激及心肌線粒體能量代謝障礙在MIRI發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵作用，實(shí)驗(yàn)通過復(fù)制經(jīng)典MIRI動物模型，觀察小紅參治療MIRI的作用機(jī)制，為小紅參的進(jìn)一步研究和臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 48只健康Wistar雄性大鼠，SPF級，體質(zhì)量（280±20）g，購自昆明楚商科技有限公司，許可證號：SCXK（湘）2013-0004，合格證號：0019228。每籠6只飼養(yǎng)，每日光照約12 h，自由飲食、飲水，環(huán)境清潔、通風(fēng)，溫度（22±2）℃，濕度 40%～60%。動物飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)均符合《醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物管理實(shí)施細(xì)則》要求。實(shí)驗(yàn)符合云南中醫(yī)藥大學(xué)動物倫理委員會的相關(guān)規(guī)定。動物購買后適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.2 主要試劑及儀器 小紅參購自云南綠生藥業(yè)有限公司（批號：C180634）；復(fù)方丹參片（云南白藥集團(tuán)股份有限公司，批號：A14002034125）；檢測試劑盒（eNOS、NO、ROS）、T-AOC（A015）檢測試劑盒、CAT（A007-1）檢測試劑盒、ATP檢測試劑盒、細(xì)胞凋亡線粒體膜電位檢測試劑盒、超微量ATP酶Na+-K+和Ca2+測試盒均購自南京建成生物工程研究所；組織線粒體分離試劑盒（ZR0246）購自上海朝瑞技術(shù)有限公司。BL-420生物信號采集處理系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司）；V-300多功能小動物呼吸機(jī)（上海玉研科學(xué)儀器有限公司）；ME104E/02電子天平（梅特勒-拖利多儀器（上海）有限公司）；酶標(biāo)儀（美國Molecular）；微量移液器（eppendorf公司）；低溫高速冷凍離心機(jī)（Thermo公司）；旋渦混勻器（上海啟前）；混合器（江蘇省海門市實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）。

1.3 藥物及制備 稱取2 kg小紅參藥材打碎成粉末，以500 g為單位平均分成4份。500 g小紅參分別加入8杯、6杯、4杯（500 mL/杯）95%乙醇浸泡30 min后，加熱回流提取3次，合并提取液，抽濾，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（t=70℃，r=90）減壓回收乙醇，得濃縮液，同種方法乙醇提取剩余3份小紅參藥材粉末；將濾液用大型分液漏斗分離的乙酸乙酯部分再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓回收，最后得小紅參濃縮液，置于-80℃內(nèi)冷凍保存，臨用時(shí)按低、中、高濃度配制，每次灌胃時(shí)將藥物加熱。

1.4 MIRI經(jīng)典動物模型制備 除假手術(shù)組外，其余藥物處理組均在麻醉狀態(tài)下對大鼠進(jìn)行氣管插管和結(jié)扎心臟冠狀動脈左前降支30 min，當(dāng)結(jié)扎點(diǎn)以下心肌顏色變白，心電圖ST段進(jìn)行性抬高弓背向上0.2 mv以上，QRS寬大畸形，標(biāo)志結(jié)扎成功；120 min后再灌注，當(dāng)心肌顏色逐漸由白變紅，心電圖ST段逐漸回落50%以上，T波逐漸恢復(fù)，標(biāo)志再灌注成功。假手術(shù)組大鼠只在結(jié)扎點(diǎn)穿線不結(jié)扎。

1.5 分組及給藥 ①篩選正常心電圖大鼠，按隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為假手術(shù)組、模型組、小紅參低、中、高劑量組、復(fù)方丹參片組，共計(jì)6組，每組8只。②大鼠給藥劑量按人體表面積的0.018計(jì)算。小紅參乙酸乙酯提取物低、中、高劑量組按等效量1∶3∶5計(jì)，給藥濃度分別為56.7、170、280 mg/kg；復(fù)方丹參片組按生藥量給予300 mg/kg；假手術(shù)組和模型組按1 mL/100 g給藥容積灌胃給藥，每天1次，連續(xù)14 d。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 血清中NO、eNOS含量的檢測 各組再灌注2 h后，從腹主動脈取血5 mL置于肝素抗凝管中，靜置30 min后，以3 500 r/min離心10 min，吸取上清液，保存于-80℃待測。按照試劑盒說明書檢測NO的含量和eNOS的活性。

1.6.2 心肌組織中ROS、ATP、CAT、T-AOC含量的檢測取出心臟，使用預(yù)冷的生理鹽水清洗干凈后，在冰上勻漿并配置為10%的心肌組織勻漿液，以3 500 r/min離心10 min，吸取上清液，保存于-80℃待測。嚴(yán)格按照試劑盒說明書檢測心肌組織中ROS、ATP、CAT和T-AOC的含量。

1.6.3 心肌細(xì)胞線粒體能量代謝障礙相關(guān)指標(biāo)的檢測取200 mg新鮮的心肌組織，使用生理鹽水清洗后勻漿、研磨；根據(jù)線粒體提取試劑盒嚴(yán)格操作，從大鼠心臟組織中分離出完整、純化的線粒體；然后采用超微量ATP酶測試盒檢測大鼠心肌細(xì)胞中Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶的活力，使用線粒體跨膜電位檢測試劑盒（JC-1）檢測大鼠心肌凋亡細(xì)胞線粒體膜電位的變化，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)采用SPSS17.0軟件進(jìn)行分析，采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用單因素方差（One-Way ANOVA）分析。以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小紅參對大鼠血清e(cuò)NOS活性及NO含量的影響與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清e(cuò)NOS的活性及NO的含量明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，復(fù)方丹參片組和小紅參各劑量組均能明顯升高大鼠血清中eNOS的活性及NO的含量（P＜0.05），結(jié)果見表1。

2.2 小紅參對氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的影響 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌組織中ROS的含量明顯升高，CAT和T-AOC的含量明顯下降（P＜0.05）；與模型組比較，復(fù)方丹參片組和小紅參各劑量組均能降低大鼠心肌組織中ROS的含量，升高CAT和T-AOC的水平（P＜0.05），其中以復(fù)方丹參片組和小紅參中、高劑量組較為顯著，見表2。

表1 小紅參對大鼠血清e(cuò)NOS活性及NO含量的影響（±s，n=8）

表1 小紅參對大鼠血清e(cuò)NOS活性及NO含量的影響（±s，n=8）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05

組別 給藥劑量/（mg·kg-1）eNOS/（Kat·L-1）NO/（μmol·L-1）假手術(shù)組 - 232.04±3.91 58.16±2.33模型組 - 75.79±2.27* 25.36±0.93*復(fù)方丹參片組 300 251.81±4.28# 54.39±2.62#小紅參低劑量組 56.7 132.89±2.82# 31.50±2.70#小紅參中劑量組 170 190.96±3.42# 44.05±2.60#小紅參高劑量組 280 240.39±1.77# 52.47±5.20#

表2 小紅參對大鼠心肌組織中相關(guān)氧化指標(biāo)的影響（±s，n=8）

表2 小紅參對大鼠心肌組織中相關(guān)氧化指標(biāo)的影響（±s，n=8）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05

組別 給藥劑量/（mg·kg-1）ROS T-AOC/（U·mL-1）假手術(shù)組 - 8.63±0.27 76.42±1.69模型組 - 4.38±0.22*復(fù)方丹參片組 300 8.19±0.26#小紅參低劑量組 56.7 4.85±0.4#小紅參中劑量組 170 5.47±0.45#143.7±2.62*89.36±2.59#131.33±2.77#122.68±4.08#小紅參高劑量組 280 7.64±0.32#108.12±2.88#CAT/（U·mL-1）51.7±1.3 28.7±1.14*47.57±1.11#31.93±1.2#36.87±2.45#45.1±3.79#

2.3 小紅參對能量代謝ATP及ATP酶的影響 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌組織中Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶和 ATP的含量明顯下降（P＜0.05）；與模型組比較，小紅參低劑量組在升高Na+-K+-ATP酶時(shí)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，復(fù)方丹參片組和其余的小紅參各劑量組均能升高大鼠心肌組織中Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶和 ATP的含量（P＜0.05），見表3。

2.4 小紅參對心肌細(xì)胞線粒體膜電位的影響 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠的心肌細(xì)胞線粒體膜電位明顯下降（P＜0.05）；與模型組比較，小紅參低劑量組對大鼠心肌細(xì)胞線粒體膜電位升高沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，復(fù)方丹參片組和其余的小紅參各劑量組均能明顯升高大鼠心肌細(xì)胞線粒體膜電位（P＜0.05），見表4。

表3 小紅參對心肌組織中能量代謝ATP酶及ATP的影響（±s，n=8）

表3 小紅參對心肌組織中能量代謝ATP酶及ATP的影響（±s，n=8）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05

組別 給藥劑量/（mg·kg-1）ATP/[mol·（g·prot）-1]假手術(shù)組 - 6.46±0.26 Na+-K+-ATP酶/[U·（mg·prot）-1]6.79±0.11模型組 -2.36±0.17*復(fù)方丹參片組 300 5.44±0.37#小紅參低劑量組 56.7 2.72±0.24#小紅參中劑量組 170 3.62±0.17#4.55±0.12*6.46±0.09#4.73±0.36 4.91±0.16#小紅參高劑量組 280 4.53±0.29#6.14±0.45#Ca2+-ATP酶/[U·（mg·prot）-1]3.81±0.11 2.71±0.15*3.68±0.2#2.97±0.17#3.08±0.13#3.45±0.17#

表4 小紅參對心肌細(xì)胞線粒體膜電位的影響（±s，n=8）

表4 小紅參對心肌細(xì)胞線粒體膜電位的影響（±s，n=8）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05

組別給藥劑量/（mg·kg-1）正常細(xì)胞/%假手術(shù)組 - 32.36±1.4模型組 - 12.42±0.37*復(fù)方丹參片組 300 30.37±2.23#小紅參低劑量組 56.7 14.18±2.14小紅參中劑量組 170 25.64±1.87#小紅參高劑量組 280 28.39±1.05#

3 討論

缺血性心臟病為臨床上常見的心血管疾病，已成為引起全球人口死亡的第一位因素，隨著人口老齡化，發(fā)病率越來越高，嚴(yán)重影響人類健康和生活[10]。MIRI是針對心肌缺血區(qū)血液再灌注時(shí)出現(xiàn)的一類重要病理損傷。心肌缺血后，及時(shí)恢復(fù)缺血心肌組織的血流，可有效減輕心肌組織的損傷，但再灌注后產(chǎn)生的大量活性氧自由基（ROS）可引起超氧化物自由基、過氧化氫（H2O2）、羥基自由基等增多，對細(xì)胞膜和蛋白造成直接損害，導(dǎo)致心肌細(xì)胞發(fā)生功能障礙或壞死[11]。過氧化氫酶（CAT）是天然的抗氧化酶，可催化H2O2產(chǎn)生O2和H2O，對機(jī)體的氧化/抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作用?？偪寡趸芰Γ═-AOC）可反映機(jī)體內(nèi)總體的抗氧化水平，其含量可決定機(jī)體的抗氧化能力[12]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)小紅參可降低MIRI大鼠中ROS水平，并提高CAT和T-AOC活性，表明小紅參對MIRI大鼠具有較好的抗氧化能力。

一氧化氮合酶（NOS）是產(chǎn)生一氧化氮（NO）的唯一限速酶，其生物活性可分為內(nèi)皮型NOS（eNOS）、神經(jīng)元型NOS（nNOS）和誘導(dǎo)型NOS（iNOS）。其中eNOS主要表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞，其催化生成的NO不僅可調(diào)節(jié)機(jī)體的氧化應(yīng)激和炎癥水平，還可激活sGC/cGMP通路，起到降血壓和舒張血管的作用[13-14]。研究發(fā)現(xiàn)，eNOS基因的高表達(dá)可減少心肌缺血/再灌注24 h后的心肌梗死面積，使用eNOS抑制劑干預(yù)后，eNOS的心肌保護(hù)作用被抑制[15-16]。因此，在MIRI過程中，心肌細(xì)胞損害程度與冠狀動脈內(nèi)皮損傷后導(dǎo)致eNOS的表達(dá)下降，NO的釋放減少密切相關(guān)[17]。實(shí)驗(yàn)中給予小紅參干預(yù)后，MIRI大鼠eNOS活性增強(qiáng)，NO的含量也隨之升高，表明小紅參可通過調(diào)節(jié)MIRI大鼠體內(nèi)eNOS和NO水平發(fā)揮抗心肌缺血/再灌注損傷的作用。

目前認(rèn)為MIRI的始動環(huán)節(jié)可能與能量代謝障礙有關(guān)。ATP作為心肌細(xì)胞的直接供能物質(zhì)，在心肌細(xì)胞節(jié)律性收縮時(shí)需要消耗大量的ATP，ATP含量的減少將會導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡或壞死，加劇MIRI[18]。然而，心肌細(xì)胞中90%的ATP來源于線粒體，線粒體作為釋放能量的場所，其產(chǎn)生的電子通過呼吸鏈復(fù)合體傳遞，進(jìn)而產(chǎn)生的線粒體膜電位在呼吸鏈復(fù)合體和O2的參與下，促使線粒體ATP合成酶生成ATP。線粒體膜電位是維持線粒體結(jié)構(gòu)和功能的根本，目前認(rèn)為線粒體跨膜電位的下降是細(xì)胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)過程中最早發(fā)生的事件[19]。研究發(fā)現(xiàn)在線粒體內(nèi)膜上存在許多Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶，它們具有維持細(xì)胞膜電位的作用。Na+-K+-ATP酶催化ATP分解釋放能量的同時(shí)，可將3個(gè)Na+轉(zhuǎn)出細(xì)胞外，又將2個(gè)K+轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)，以維持細(xì)胞內(nèi)外化學(xué)梯度及電平衡；Ca2+-ATP酶在催化ATP分解釋放能量時(shí)，Ca2+可逆濃度梯度發(fā)生主動跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，以維持心肌正常的收縮功能。若Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶減少，將會導(dǎo)致鈣超載和氧自由基的增加，進(jìn)一步影響線粒體代謝功能[19]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，小紅參干預(yù)MIRI模型大鼠后，可提高線粒體能量代謝ATP酶和心肌細(xì)胞線粒體的膜電位，表明小紅參可調(diào)節(jié)MIRI大鼠體內(nèi)的能量代謝以減輕心肌細(xì)胞的損傷。

綜上所述，小紅參對心肌缺血/再灌注損傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與升高血清中NO水平、抗氧化及改善線粒體能量代謝有關(guān)，這為臨床使用小紅參防治MIRI提供了藥理學(xué)依據(jù)。