別嘌呤醇治療慢性心力衰竭大鼠的治療效果及機(jī)制

孫桂芳 王孝微 張 靜

慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)時(shí)缺血缺氧、神經(jīng)體液因子釋放增加，導(dǎo)致機(jī)體活性氧(reactive oxygen species，ROS)產(chǎn)生過多，抗氧化能力降低，出現(xiàn)氧化應(yīng)激[1～3]。ROS包括超氧陰離子、羥自由基等產(chǎn)物，導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡、肥厚，心臟膠原合成，參與心肌重構(gòu)及心臟功能障礙[4,5]。

黃嘌呤氧化酶(xanthine oxidase，XO)是機(jī)體產(chǎn)生ROS的主要酶之一[6]。研究證實(shí)，CHF時(shí)心臟XO表達(dá)及活性增強(qiáng)，導(dǎo)致心肌ROS生成過多[7,8]。ROS作用于細(xì)胞膜脂質(zhì)，產(chǎn)生代謝終產(chǎn)物丙二醛(malondialdehyde，MDA)。別嘌呤醇(allopurinol，ALLO) 抑制XO，減少超氧陰離子、過氧化氫等ROS產(chǎn)物。本研究應(yīng)用大劑量異丙腎上腺素(isoproterenol,ISO)建立CHF動(dòng)物模型，給予ALLO治療，觀察心臟結(jié)構(gòu)及功能、心臟XO活性及MDA含量變化，以評價(jià)其治療效果并探究機(jī)制[9]。

材料與方法

1.CHF動(dòng)物模型建立及實(shí)驗(yàn)分組：36 只Wistar 雄性大鼠, 體質(zhì)量180～220g,哈爾濱獸醫(yī)研究所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。28 只大鼠腹部皮下注射 ISO(美國Sigma公司)，劑量為340mg/kg，間隔24h，重復(fù)注射1次，隨機(jī)分為CHF組及ALLO組，每組14只。8只大鼠腹部皮下注射0.9%氯化鈉注射液作為對照組。ALLO組自實(shí)驗(yàn)第3天起每天給予ALLO(廣東彼迪藥業(yè)有限公司)灌胃，劑量為50mg/kg。CHF組、對照組給予0.9%氯化鈉注射液灌胃，連續(xù)8周。

2.心臟彩超檢查：8周后，大鼠給予戊巴比妥鈉(上海生物化學(xué)制藥廠)腹腔注射，劑量為40mg/kg。麻醉后取平臥位，應(yīng)用Vevo 770型號超聲心動(dòng)儀(加拿大Visual sonics公司)檢查。探頭置于左側(cè)胸前，取得二維超聲心動(dòng)圖左室長軸切面，在此切面上將取樣線置于腱索水平獲得M型超聲左心室波群，測量左心室收縮末內(nèi)徑(left ventricular end-systolic diameter，LVDs)、舒張末內(nèi)徑(left ventricular end-diastolic diameter，LVDd)，記錄左心室射血分?jǐn)?shù) (left ventricular ejection fraction，LVEF)、短軸縮短率(left ventricular fractional shortening，LVFS)。測量3個(gè)不同的心動(dòng)周期，每個(gè)指標(biāo)取均值。

3.測量左心室重量/體質(zhì)量：分離出左心室, 用電子天平(浙江東新儀器設(shè)備有限公司)稱重, 計(jì)算左心室重量/體質(zhì)量。液氮保存左心室心肌，-80℃冰箱保存。

4.左心室病理檢查：截取左心室室間隔中間段心肌, 以4%多聚甲醛溶液固定24h以上，常規(guī)石蠟包埋，均勻間斷切片5～10張，層厚5μm，行HE染色。

5.左心室超微結(jié)構(gòu)檢查：取左心室心內(nèi)膜心肌，經(jīng)3%戊二醛前固定、1%鋨酸后固定，丙酮梯度脫水，環(huán)氧樹脂常規(guī)包埋，制作超薄切片，醋酸軸、枸椽酸鉛雙重染色，應(yīng)用JEM-1220型號透射電鏡(日本電子公司)觀察心肌超微結(jié)構(gòu)。

6.測定心肌蛋白含量：采用考馬斯亮藍(lán)法。用電子天平稱重心肌組織，小剪刀剪碎，迅速置于冰浴中的微型手動(dòng)勻漿器中，加入組織重量9倍的4℃ 0.9%氯化鈉注射液，研磨10min制成勻漿，以3000r/min離心15min，然后取上清液用0.9%氯化注射液配制成2%的組織勻漿，按照考馬斯亮藍(lán)蛋白測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)步驟進(jìn)行測定。

7.測定心肌XO活性：基于底物次黃嘌呤，在XO的催化下，生成過氧化氫，然后借助過氧化酶的作用，與對羥基苯甲酸和氨基安替比林反應(yīng)，形成有色醌亞胺，通過其吸收峰值的變化，來定量分析黃嘌呤氧化酶的活性。取心肌組織勻漿液，按照XO測試盒(南京建成生物工程研究所)說明書進(jìn)行測定。

8.測定心肌MDA含量：利用硫代巴比妥酸與MDA反應(yīng)，生成硫代巴比妥酸反應(yīng)物質(zhì)(thiobarbituric acid reactants，TBARS)。按照TBARS測試盒(南京建成生物工程研究所)說明書步驟檢測心肌組織勻漿液MDA 的含量。單位為納摩爾/毫克(nmol/mg)。

結(jié) 果

1.CHF動(dòng)物模型建立情況：8周后CHF組大鼠存活9只，存活率為64.3%。ALLO組大鼠存活11只，存活率為78.6%。兩組存活率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。CHF組LVEF<50%，證實(shí)CHF模型成立。

2.心臟彩超檢查：與對照組比較，CHF組及ALLO組LVDs、LVDd增加(P<0.05)，LVEF、LVFS降低(P<0.05)。與CHF組比較，ALLO組LVDs、LVDd降低(P<0.05)，LVEF、LVFS升高(P<0.05)，詳見表1。

表1 心臟彩超檢查結(jié)果

3.左心室重量/體質(zhì)量：與對照組比較，CHF組、ALLO組顯著升高(P<0.05)，分別為1.61±0.20、2.12±0.18、1.85±0.16mg/g。ALLO組顯著低于CHF組(P<0.05)。

4.左心室HE染色：與對照組比較，CHF組心內(nèi)膜下心肌水腫，散在凝固性壞死，膠原沉積。ALLO組心肌水腫、壞死及膠原沉積較CHF組改善(圖1)。

5.心肌超微結(jié)構(gòu)檢查：CHF組肌節(jié)崩解、消失，線粒體腫脹、嵴斷裂。ALLO組上述病變改善(圖2、圖3)。

6.心臟XO活性及MDA含量測定：與對照組比較，CHF組、ALLO組心臟XO活性、MDA含量顯著升高(P<0.05)。ALLO組XO活性、MDA含量顯著低于CHF組(P<0.05)，詳見表2。

討 論

大鼠皮下注射大劑量ISO，激動(dòng)心臟β-腎上素能受體，出現(xiàn)心肌細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激、炎性介質(zhì)釋放、Ca2+超載等多種損傷，導(dǎo)致心肌急性壞死，產(chǎn)生心肌重構(gòu)及心臟功能障礙[10,11]。CHF組心臟XO活性及MDA含量增加，證實(shí)氧化應(yīng)激參與CHF。與對照組比較，ISO注射8周后存活大鼠心肌病理顯示壞死、纖維化、肌節(jié)崩解及線粒體破壞，左心室肥厚并擴(kuò)張以及收縮功能降低，說明CHF模型成立。

表2 心臟XO活性及MDA含量

應(yīng)用ALLO治療CHF大鼠，減輕心肌水腫、壞死、纖維化、超微結(jié)構(gòu)損傷，降低左心室重量/體質(zhì)量、LVDs、LVDd，提高左心室收縮功能，說明ALLO有效治療CHF。本研究給予CHF大鼠ALLO治療8周，減輕左心室肥厚及擴(kuò)張，表明其逆轉(zhuǎn)心肌重構(gòu)，阻遏了CHF的病理生理進(jìn)程。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)ALLO改善心肌梗死大鼠非梗死區(qū)域心肌重構(gòu)，ALLO提高左心室容量負(fù)荷過重大鼠心臟收縮功能[12，13]。臨床研究證實(shí)ALLO有效治療CHF患者[7，14，15]。

機(jī)體通過多條途徑產(chǎn)生ROS，包括兒茶酚胺單胺氧化酶途徑、線粒體電子呼吸鏈途徑、NADPH氧化酶途徑、XO途徑等[16]。其中XO是心肌產(chǎn)生ROS的主要酶之一[6]。XO作用于次黃嘌呤、黃嘌呤，生成尿酸、過氧化氫、超氧陰離子等產(chǎn)物。過氧化氫、超氧陰離子這些ROS產(chǎn)物使磷脂分子中不飽和脂肪酸氧化生成過氧化脂質(zhì)，產(chǎn)生毒性終產(chǎn)物MDA[17]。MDA損傷生物膜，引起蛋白質(zhì)、核酸等生命高分子的交聯(lián)聚合，是反映氧自由基損傷的指標(biāo)之一[18]。ALLO降低CHF大鼠心臟XO活性和MDA含量，表明ALLO拮抗XO降低CHF心臟膜脂過氧化。

MDA損傷心肌細(xì)胞膜、線粒體等細(xì)胞器生物膜。ALLO減少CHF大鼠心臟MDA，改善心肌水腫及線粒體腫脹，有助于減少心肌壞死及纖維化，從而抑制左心室肥厚及擴(kuò)張等代償性反應(yīng)。既往研究證實(shí)MDA破壞心臟線粒體結(jié)構(gòu)，干擾心臟能量代謝，導(dǎo)致肌漿網(wǎng)Ca2+攝取異常，出現(xiàn)心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載，引起心臟收縮及舒張功能異常[19,20]。本研究中ALLO提高CHF大鼠LVEF是否與改善心臟能量代謝及心肌細(xì)胞Ca2+通路有關(guān)，需要進(jìn)一步研究證實(shí)。今后開展的研究可觀察ALLO對CHF心臟線粒體呼吸鏈復(fù)合物的活性變化來評價(jià)其對能量代謝的影響，以及應(yīng)用膜片鉗和熒光探針鈣圖像分析技術(shù)記錄心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度變化來探究對Ca2+通路的影響。本研究顯示ALLO可抑制心臟XO活性，延緩CHF進(jìn)展，為其治療提供新的手段。