SAM系小鼠生命進程和生存質(zhì)量評價以及壽命分析

樊 蕊 杜 倩 郝云濤 徐美虹 李 勇

隨著生活水平和醫(yī)療保健技術(shù)的不斷提高和完善，人類的平均壽命逐漸延長，中國已邁入了老齡社會。老年人的身心健康和生活質(zhì)量引起了科學界的高度關(guān)注。為此，如何對衰老進行客觀量化的評價，進而據(jù)此采取有效的措施延緩衰老，提高生存質(zhì)量，已成為當今世界性的重大醫(yī)學課題。

衰老是人口老齡化面臨的首要問題。衰老是一種正常而復雜的生物學過程，是所有生物的共同特征，衰老表現(xiàn)為組織和功能衰退，適應性和抵抗力減退。為了充分深入地研究衰老機制以及延緩衰老的方法，衰老相關(guān)疾病動物模型的研究有著十分重要的價值。目前建立的大鼠、小鼠等嚙齒類動物的衰老模型包括自然衰老模型，D-半乳糖所致衰老模型，去胸腺衰老模型，臭氧損傷衰老模型，SAMP系小鼠衰老模型等，且各模型均有其優(yōu)勢及不足[1～4]。

快速老化小鼠(senescence accelerated mouse, SAM)是日本京都大學Takeda教授經(jīng)過20多年精心培育得到的一種近交系衰老模型鼠，包括SAMP(senescence accelerated prone mouse, SAMP)和SAMR(senescence accelerated resistant mouse, SAMR)兩種品系[5]。SAMP在進入成熟期(約4～6月齡)后迅速出現(xiàn)行動反應遲緩、被毛光澤減退、脫毛、皮膚潰瘍、眼周損害、角膜潰瘍、白內(nèi)障、脊柱彎曲等老化特征，SAMR表現(xiàn)為正常衰老，一般作為SAMP的正常對照。SAMP8是SAMP系中的一個亞系，主要以學習記憶能力障礙為老化特征，其壽命約為12.1個月，是目前比較理想的自然衰老模型小鼠[6,7]。

目前學者對于SAMP8小鼠的研究多集中在腦退化方面，而對于其衰老的評價以及老齡小鼠的生存質(zhì)量并未見報道，同時對于該模型小鼠的實際壽命也未見具體報道[8,9]。在對衰老的研究中，衰老的評價是衰老研究領(lǐng)域中的關(guān)鍵問題和難點問題。本研究對SAM系小鼠喂養(yǎng)終生，對其衰老的進程以及生存質(zhì)量予以探析，對于其壽命予以統(tǒng)計，以期對充分恰當?shù)膽迷撃Ｐ托∈筇峁├碚撘罁?jù)，同時對衰老的評價提供思路和參考。

材料與方法

1.材料：4月齡SPF級雄性SAMP8小鼠20只，相同月齡的SAMR1小鼠25只，由北京大學醫(yī)學部實驗動物中心提供,實驗動物生產(chǎn)許可證號為SCXK(京)2016- 0010，屏障環(huán)境動物房,實驗動物使用許可證號為SYXK(京)2016-0041，單籠單只飼養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境溫度21～23℃，濕度50%～60%。喂飼普通小鼠生長飼料，所有動物自由飲水進食。動物喂養(yǎng)及實驗嚴格按照 《北京市實驗動物管理條例》執(zhí)行，并經(jīng)過北京大學醫(yī)學部倫理學委員會審核通過 (批準號: LA2017017)。

2.動物一般狀態(tài)觀察及體格指標測定：每周觀測并記錄動物的活動度、毛發(fā)光澤、攝食量、飲水量、體質(zhì)量。

3.臟器指數(shù)：各組小鼠飼養(yǎng)臨近至壽命終點時，小鼠稱重后脫頸椎處死，無菌快速剝離腓腸肌及其他肌肉，記錄腓腸肌質(zhì)量、其他肌肉質(zhì)量。分別稱重小鼠的心臟、肝臟、腎臟、脾臟、胸腺，計算臟器指數(shù)。臟器指數(shù)(g/kg)=臟器重(g)/體質(zhì)量(kg)。

4.爬網(wǎng)實驗：分別在小鼠16周齡、45周齡和84周齡時，將小鼠放在垂直的金屬網(wǎng)上，金屬網(wǎng)(長度1.5m，寬帶0.5m)置于距地面0.5m處，記錄每只小鼠在金屬網(wǎng)上停留時間。為了表征小鼠的運動障礙，根據(jù)爬網(wǎng)實驗中爬網(wǎng)的時間進行轉(zhuǎn)化并進行評分，分值賦值如下：當爬網(wǎng)時間≤3s，運動障礙評分3分；當爬網(wǎng)時間3.1～5.0s，運動障礙評分2分；當爬網(wǎng)時間5.1～7.0s，運動障礙評分為1分；當爬網(wǎng)時間≥7.1s，運動障礙評分為0分。

5.老化度評分：采用日本京都大學竹田俊男和細川昌則教授制定的老化度評分標準，并結(jié)合小鼠的運動能力進行適當修改，分別將小鼠外在形體及行為的老化改變從外觀衰老(光澤及粗糙程度、脫毛程度)、組織病變(皮膚潰病、眼周損害、白內(nèi)障、陰莖、腫瘤、斷尾)、體態(tài)衰老(脊柱后凸、顫抖)、反應退化(反應性、被動逃避)及運動障礙(爬網(wǎng)能力)13項進行綜合評價，再根據(jù)嚴重程度不同，將每項指標標定分值，客觀進行評分，分值越高則老化度越高。[10]

結(jié) 果

1.SAM小鼠體質(zhì)量變化：隨著SAM小鼠周齡的增加，其體質(zhì)量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，SAMP8小鼠體質(zhì)量的變化大體趨勢與SAMR1小鼠相似，但是在整個生命周期中，整體體質(zhì)量均低于SAMR1小鼠。SAMR1小鼠在30周齡前，其體質(zhì)量呈現(xiàn)增加的趨勢(體質(zhì)量增加期Ⅰ)，在周齡達到35周后，體質(zhì)量出現(xiàn)小幅度降低后又出現(xiàn)明顯的增加(體質(zhì)量增加期Ⅱ)，SAMR1小鼠在45周齡時，體質(zhì)量達到最大為41g，45周齡后體質(zhì)量持續(xù)下降(體質(zhì)量下降期Ⅰ)，在55～70周，體質(zhì)量基本恒定(體質(zhì)量恒定期)，當體質(zhì)量經(jīng)歷小幅度增加后(體質(zhì)量增加期Ⅲ)，74周后體質(zhì)量急劇下降(體質(zhì)量下降期Ⅱ)。而在SAMR1小鼠體質(zhì)量增加期Ⅰ這段時間，SAMP8小鼠體質(zhì)量反復變化，且隨著周齡增加，SAMP8并未出現(xiàn)體質(zhì)量恒定期，反而在此期間，SAMP8小鼠體質(zhì)量小幅度降低，詳見圖1。

圖1 SAMR1和SAMP8小鼠生命周期體質(zhì)量的變化

2.SAM小鼠攝食量、飲水量的變化：從整體趨勢看，SAMP8小鼠攝食量高于SAMR1小鼠。SAM小鼠在剛進入成熟期(16周)后，進食量急劇增加，當達到20周齡后，SAM小鼠進食量降低，當SAMR1和SAMP8小鼠周齡達到30周后，其進食量又一次急速增加，均在34周達到其最大進食量，分別為52克/周，45.5克/周，隨后其攝食量出現(xiàn)下降，SAMR1小鼠達到45周后，攝食量出現(xiàn)小幅度增加后極速降低，當周齡54周時降至最低攝食量25.7克/周，隨后其攝食量再一次增加至73周，而SAMP8小鼠在34～47周期間，攝食量持續(xù)降低，隨后其攝食量緩慢增加并保持恒定至73周，而在此期間，SAMP8小鼠攝食量高于SAMR1小鼠，當SAMR1小鼠周齡高于74周后，其攝食量降低后有小幅度增加，而74周后 SAMP8小鼠攝食量持續(xù)下降。

從整體趨勢看，在48周前，SAMP8小鼠飲水量低于SAMR1，而隨著周齡增加，SAMP8飲水量高于SAMR1。SAM小鼠飲水量變化分為8個時期，依次為：飲水量增加期Ⅰ(SAM小鼠，16～20周齡)；飲水量降低期Ⅰ(SAM小鼠，20～33周齡)；飲水量增加期Ⅱ(SAMR1小鼠，33～44周齡；SAMP8小鼠，33～37周齡)；飲水量降低期Ⅱ (SAMR1小鼠，45～49周齡；SAMP8小鼠，37～49周齡)；飲水量增加期Ⅲ(SAM小鼠，49～53周齡)；飲水量恒定期(SAMP8小鼠，53～65周齡；SAMR1小鼠，53～57周齡)；飲水量降低期 Ⅲ(SAMR1小鼠，57～74周齡； SAMP8小鼠，65～75周齡)，詳見圖2。

圖2 SAMR1和SAMP8小鼠生命周期攝食量、飲水量的變化A.攝食量；B.飲水量

表1 臨近壽命終點SAMR1和SAMP8小鼠臟器指數(shù)

3.SAM小鼠臟器指數(shù)：臨近壽命終點的SAMP8小鼠的心臟指數(shù)、肝臟指數(shù)大于SAMR1小鼠，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，而SAMP8小鼠脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)和腎臟指數(shù)小于SAMR1小鼠，其中腎臟指數(shù)差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

4. SAM小鼠骨骼肌含量比較：臨近壽命終點的SAMP8小鼠的腓腸肌和骨骼肌的質(zhì)量均小于SAMR1小鼠，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，成熟期SAMP8小鼠，后肢骨骼肌飽滿，而臨近壽命終點的SAMP8小鼠的后肢肌肉萎縮，并且可以看到脂肪浸潤，與同周齡的SAMR1小鼠的骨骼肌呈現(xiàn)鮮明的對比(圖3)。

5.SAM小鼠衰老評分：老化度評分是從外在形體及行為變化來評定機體的老化程度，反映了機體的衰老征象。從圖4中可以看出，14周齡的SAMP8小鼠僅僅表現(xiàn)為脫毛和毛色失去光澤，而在組織病變、體態(tài)衰老、反應退化和運動障礙方面并無相應的表現(xiàn)。而45周齡的SAM小鼠，SAMP8小鼠在外觀衰老、體態(tài)衰老、反應退化和運動障礙方面得分顯著高于SAMR1小鼠。45周齡的SAMP8和SAMR1小鼠僅在組織病變方面未表現(xiàn)出輕微程度的病變，兩者得分差別微小。臨近壽命終點的SAM小鼠，其運動障礙、外觀衰老、體態(tài)衰老和反應退化方面的表現(xiàn)顯著差于45周齡SAM小鼠，且與同周齡的SAMR1小鼠比較，SAMP8小鼠在外觀衰老、運動障礙以及體態(tài)衰老方面的程度更高。

圖3 SAMR1和SAMP8 臨近壽命終點骨骼肌含量

圖4 SAM小鼠不同時期的衰老評分

6.SAM小鼠壽命分析：由圖5可知，SAMR1小鼠在55～56周齡時，開始出現(xiàn)死亡，此時段死亡比例為5%，但SAMP8小鼠在34～35周齡，便開始出現(xiàn)死亡，此時段死亡比例為7%。在整個生命進程中，SAMP8小鼠在40～60周，其生存率急速下降，而SAMR1小鼠在60～67周，73～80周出現(xiàn)兩個死亡率急速上升期。通過分析，SAMR1小鼠中位數(shù)生存時間為79周，飼養(yǎng)52周(1年)，其累計生存比例為1，飼養(yǎng)60周后，其累計生存比例為0.9，而SAMP8小鼠中位數(shù)生存時間為70周，飼養(yǎng)52周(1年)，其累計生存比例為0.73，飼養(yǎng)60周后，其累計生存比例為0.53。通過生存函數(shù)曲線可以看出整體趨勢，即SAMP8較SAMR1小鼠的生存率下降更快，通過LogRank(Mantel-COX,P=0.5)，Breslow(GeneralizedWilcoxon,P<0.05)，通過Tarone-Ware(P<0.05)分析，可知SAMR1小鼠的生存率顯著高于SAMP8小鼠。

圖5 SAM小鼠累積生存函數(shù)圖

討 論

機體功能下降和紊亂，同時伴隨著生理學、解剖學方面的變化和對體內(nèi)外環(huán)境適應力和代償力的減退，此綜合現(xiàn)象稱之為衰老。主要表現(xiàn)為機體學習記憶能力下降，臟器功能減退，皮膚彈性下降等。生存質(zhì)量與多方面信息有關(guān)，目前人類健康相關(guān)的生存質(zhì)量評價包括了生理健康、心理狀態(tài)、獨立能力、社會關(guān)系等方面，對于實驗動物的生存質(zhì)量研究多集中在疾病狀態(tài)下的生存質(zhì)量，多參考體質(zhì)量、攝食量、腫瘤/疾病惡略程度、腓腸肌質(zhì)量、自主活動能力以及生存期等方面，綜合評價其生存質(zhì)量，對于衰老動物的生存質(zhì)量評價鮮有報道。參考疾病狀態(tài)下實驗動物的生存質(zhì)量評價，本文提出了綜合體質(zhì)量、攝食量、內(nèi)臟指數(shù)、骨骼肌質(zhì)量、衰老評分以及壽命幾方面，作為參考指標綜合評價衰老SAM系小鼠生存質(zhì)量，其中衰老評分體系是在參考日本京都大學竹田俊男和細川昌則教授制定的老化度評分標準，并結(jié)合小鼠的運動能力進行適當修改，其可以作為SAMP8小鼠衰老的標準評價指標，且具有SAMP8獨特特征[10]。

動物衰老進程中的體質(zhì)量下降是由于構(gòu)成機體的主要物質(zhì)如蛋白質(zhì)等合成量降低，不足以補充其分解，因此造成結(jié)構(gòu)物質(zhì)不斷損耗，細胞結(jié)構(gòu)受到破壞。由圖1可知，SAM小鼠體質(zhì)量大體變化趨勢為：在達到45周齡前，隨著周齡增加，體質(zhì)量基本呈現(xiàn)增加的趨勢，其中SAMR1小鼠體質(zhì)量持續(xù)增加而SAMP8小鼠體質(zhì)量變化較為曲折。當SAM小鼠達到45周齡后，隨著周齡增加體質(zhì)量呈現(xiàn)下降趨勢，SAMP8小鼠體質(zhì)量的變化趨勢與其攝食量變化的趨勢大致相似，尤其是當SAMP8小鼠37～41周，其攝食量下降，體質(zhì)量也呈現(xiàn)下降的趨勢。在整個生命周期中，SAMR1小鼠的體質(zhì)量始終高于SAMP8小鼠體質(zhì)量?？梢姡瑢賁AMR1小鼠具有正常的衰老特征，其進入衰老的時間晚于同屬的SAMP8小鼠。

衰老的因素很多，研究者認為免疫系統(tǒng)結(jié)構(gòu)老化與功能下降是衰老的主要原因與標志。胸腺是免疫系統(tǒng)的中樞器官，對維持細胞免疫和調(diào)節(jié)免疫反應起重要的作用。其發(fā)育、退化具有顯著的年齡特征。新生兒的胸腺僅為10～15g，而至青春期可達30～40g，此后開始退化，到老年期幾乎全部被脂肪組織所替代[11]。因此，在機體衰老的進程中，胸腺功能的衰退最為明顯，因此，胸腺衰老被看作是老化過程中最重要的標志之一[12]。研究表明，脾臟的代謝隨年齡增長而減弱，因此，胸腺和脾臟的萎縮，代表機體免疫功能減弱，可加速衰老進程[11]。而腎臟是機體衰老過程中變化最為顯著的器官之一，可作為表征衰老的指標之一。在本實驗中，SAMP8小鼠胸腺、脾臟指數(shù)均低于SAMR1小鼠，但差異無統(tǒng)計學意義，提示兩種小鼠胸腺和脾臟萎縮狀況的差異并不明顯。這可能是因為70周齡兩種小鼠均步入衰老時期。而對于D-半乳糖結(jié)合輻射所致昆明小鼠的急性衰老模型中，其胸腺和脾臟指數(shù)顯著降低，這有可能是取材測定時期(20周)并未進入昆明小鼠的老年期[13]。本實驗發(fā)現(xiàn)SAMP8小鼠腎臟指數(shù)顯著低于SAMR1小鼠(P<0.05)，這表明70周齡的SAMP8衰老程度較SAMR1小鼠更為明顯。

隨著年齡增加，骨骼肌中蛋白質(zhì)合成量不足，細胞結(jié)構(gòu)破壞后氧化磷酸化功能受損，ATP合成減少，導致體力下降。人體從成熟到衰老，骨骼肌質(zhì)量的下降，肌力減退。到60～70歲，人體肌肉質(zhì)量下降25%～30%，小鼠與大鼠肌肉質(zhì)量下降10%～25%[14]。本實驗中，與成熟的SAMP8小鼠后肢肌肉比較，70周齡的SAM小鼠后肢肌肉含量降低，并且同周齡的SAM小鼠，SAMP8小鼠肌肉質(zhì)量明顯低于SAMR1小鼠，并且可以清晰的看到，SAMP8小鼠后肢肌肉存在脂肪浸潤的現(xiàn)象。在衰老過程中，肌肉之間脂肪和連接物質(zhì)不斷增多，肌纖維面積萎縮，而收縮物質(zhì)，尤其是2型肌纖維顯著減少，從而導致肌肉體積和重量隨年齡性增加而降低[15]。

本實驗中還對SAM小鼠的運動障礙的程度進行了評價，隨著SAMP8小鼠進入成熟期，其爬網(wǎng)能力隨著周齡的增加隨之降低，其運動障礙程度明顯高于同周齡的SAMR1小鼠。研究發(fā)現(xiàn)，由于在衰老過程中肌肉內(nèi)部性質(zhì)發(fā)生了變化，造成肌肉萎縮，肌肉力量下降，人類從30～80歲，肌肉力量下降30%～40%[16]。84周齡的SAM8小鼠運動障礙程度明顯高于同周齡SAMR1小鼠，而成熟期的SAMP8小鼠未見明顯的運動障礙，兩者的后肢肌肉含量的差異可由圖4清晰的看到。

本研究發(fā)現(xiàn)45周齡的SAM小鼠，SAMP8小鼠在外觀衰老、體態(tài)衰老、反應退化和運動障礙的程度顯著高于SAMR1小鼠，表明SAMP8小鼠在經(jīng)過成熟期(4月齡)后進入快速衰老而出現(xiàn)明顯的衰老現(xiàn)象，其現(xiàn)象與前期報道結(jié)果一致[17]。45周齡的SAM小鼠僅在組織病變方面，兩者未表現(xiàn)出任何組織病變。隨著飼養(yǎng)時間的延長，SAM小鼠衰老程度增加，當飼養(yǎng)至84周時，SAPM8小鼠SAPM8表現(xiàn)出明顯的外觀衰老、體態(tài)衰老和運動障礙。

有研究報道，SAMP8平均生存期為12～13個月，4～6月齡后開始出現(xiàn)衰老征象，故9月齡已進入老化階段[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，SAMP8小鼠在34～35周齡，便開始出現(xiàn)死亡，當進入 SAMP8小鼠在40～60周之間，其生存率急速下降，對比圖1和圖2，發(fā)現(xiàn)40～60周這段時間，小鼠攝食量和體質(zhì)量也呈現(xiàn)下降的趨勢，此時間段符合文獻中報告的平均生存期限。本研究分析顯示，SAMR1小鼠中位數(shù)生存時間為79周，而SAMP8小鼠中位數(shù)生存時間為70周，可見，本研究報道的SAMP8小鼠的中位數(shù)生存時間長于前期文獻報道[19]。而本研究分析，SAMP8小鼠飼養(yǎng)52周(12個月)，其累計生存比例為0.73，飼養(yǎng)60周后，其累計生存比例為0.53。其最長壽命長于文獻中報道的12～13個月。有研究報道，二甲雙胍對延長SAMP8雄性小鼠的壽命起到積極的作用。通過中劑量組二甲雙胍干預的SAMP8小鼠12月齡生存率達到70%，而在本實驗中發(fā)現(xiàn)，即使不經(jīng)過任何干預，自然生長的SAMP8小鼠12月齡的生存比例為0.73[20]。與自然衰老的ICR小鼠比較，其飼養(yǎng)26個月，其累計生存比例為0.50[20]。自然衰老的Wistar大鼠半數(shù)生存出現(xiàn)在 92.5周?？梢?，SAMP8小鼠作為研究衰老的模型鼠。

綜合相關(guān)研究分析，SAMP8小鼠壽命的延長的機制值得進一步研究，并且將在后續(xù)實驗中開展延長壽命的營養(yǎng)干預措施研究。