熱環(huán)境下黃羽肉雞心臟MCEE基因表達(dá)分析

張權(quán) 羅毅康 張柏海

摘要：為研究熱應(yīng)激對黃羽肉雞生長性能的影響，對新廣黃公雞和懷鄉(xiāng)公雞進(jìn)行熱應(yīng)激處理，分析其對黃羽肉雞體質(zhì)量、心臟相對質(zhì)量和心臟MCEE基因表達(dá)的影響。試驗(yàn)隨機(jī)選取新廣黃公雞和懷鄉(xiāng)公雞各60羽，每個(gè)品種隨機(jī)分6組，每組10羽。每個(gè)品種的前3組于22～28日齡時(shí)，每天進(jìn)行熱處理[（38±1 ）℃，8 h/d，7 d，試驗(yàn)組];每個(gè)品種的后3組于22～28日齡時(shí)處于室溫[（25±1 ）℃，對照組]。分別測定新廣黃公雞和懷鄉(xiāng)公雞21、28日齡體質(zhì)量。于28日齡時(shí)隨機(jī)抽取每組公雞各2羽，每個(gè)品種試驗(yàn)組和對照組各6羽，測定心臟絕對質(zhì)量并采集心臟左心室組織用于提取總RNA。MCEE基因相對表達(dá)量采用2-ΔΔCT法，利用單因素方差分析其顯著性;雙因素方差分析黃羽肉雞體質(zhì)量和心臟相對質(zhì)量顯著性。結(jié)果表明，新廣黃公雞和懷鄉(xiāng)公雞21、28日齡體質(zhì)量以及28日齡心臟絕對質(zhì)量顯著高于懷鄉(xiāng)公雞（P<0.05），心臟相對質(zhì)量差異不顯著（P>0.05）。熱環(huán)境處理7 d后，28日齡新廣黃公雞體質(zhì)量試驗(yàn)組顯著低于對照組（P<0.05），而28日齡懷鄉(xiāng)公雞試驗(yàn)組與對照組差異不顯著（P>0.05）;心臟相對質(zhì)量差異不顯著（P>0.05）。新廣黃公雞心臟MCEE基因相對表達(dá)量顯著高于懷鄉(xiāng)公雞（P<0.05）。熱環(huán)境顯著降低新廣黃公雞心臟MCEE基因相對表達(dá)量（P<0.05），而對懷鄉(xiāng)公雞心臟MCEE基因相對表達(dá)量影響不顯著（P>0.05）。初步研究說明，熱環(huán)境顯著降低新廣黃公雞體質(zhì)量及心臟MCEE基因表達(dá)水平，而對懷興公雞無顯著影響（P>0.05）。MCEE基因表達(dá)與黃羽肉雞生長速度相關(guān)，在黃羽肉雞其他組織器官的表達(dá)有待進(jìn)一步研究。

關(guān)鍵詞：黃羽肉雞;熱應(yīng)激;心臟相對質(zhì)量;MCEE基因表達(dá)

中圖分類號： S831.1 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）13-0049-03

全球氣候變暖正在影響全球肉雞業(yè)[1]。在過去的幾十年中，通過遺傳選擇，肉雞的生產(chǎn)性能，特別是在生長率方面得到了顯著改善[2]。然而，與生長緩慢的肉雞相比，高環(huán)境溫度對生長迅速的肉雞的不利影響更大[3-5]，尤其是這些快大型肉雞的體質(zhì)量[6]。黃羽肉雞是亞洲特別是我國很受歡迎的家禽品種，其生長速度慢于商品肉仔雞，具有獨(dú)特的肉味。以往對雞的研究表明，快速生長的肉雞會出現(xiàn)左心室損傷的癥狀[7]，而左心室衰竭會導(dǎo)致抽血功能喪失[8]。鳥類有一個(gè)有效的心血管系統(tǒng)，提供營養(yǎng)和熱量的代謝需求。然而，迄今為止，黃羽肉雞對熱應(yīng)激反應(yīng)的研究還很有限。

MCEE基因是丙酸代謝通路基因，編碼丙二酰輔酶A表位異構(gòu)酶，是丙酰輔酶A代謝為丁二酰輔酶A的重要的代謝途徑，是研究人類丙酸血癥的主要候選基因[9]。缺乏甲基丙二酰輔酶A導(dǎo)致機(jī)體組織和體液中積累甲基丙二酸，并表現(xiàn)出繼發(fā)性代謝紊亂，如高血糖、高氨血癥和間歇性低血糖[10]。丙酸代謝通路基因與模式動物代謝相關(guān)疾病的關(guān)系已被廣泛研究[9，11-13]，但在家禽中尚無報(bào)道。本研究從熱應(yīng)激反應(yīng)角度出發(fā)，研究黃羽肉雞體質(zhì)量、心臟相對質(zhì)量及心臟MCEE基因的表達(dá)，分析熱應(yīng)激對黃羽肉雞的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

新廣黃公雞和懷鄉(xiāng)公雞分別來自廣東省佛山市新廣畜牧發(fā)展有限公司和廣東省信宜市盈富農(nóng)業(yè)有限公司懷鄉(xiāng)公雞保種場，各60羽1日齡公雛。每個(gè)品種隨機(jī)分6組，每組10羽，飼養(yǎng)管理?xiàng)l件一致，自由采食與飲水。每個(gè)品種的前3組于 22～28日齡時(shí)，每天進(jìn)行熱處理（38±1） ℃ 8 h后溫度降至室溫（25±1） ℃的條件下飼養(yǎng)（試驗(yàn)組）;每個(gè)品種后3組于 22～28日齡時(shí)處于室溫（25±1） ℃的條件下飼養(yǎng)（對照組）。分別測定新廣黃公雞和懷鄉(xiāng)公雞21、28日齡體質(zhì)量。于28日齡時(shí)隨機(jī)抽取每組公雞各2羽，每個(gè)品種試驗(yàn)組和對照組各共6羽，頸部放血處死，測定心臟絕對質(zhì)量并采集心臟左心室組織于液氮保存，用于提取總RNA（核糖核酸）。

1.2 總RNA的提取與逆轉(zhuǎn)錄

雞心臟組織總RNA提取參見Trizol試劑說明書的操作步驟進(jìn)行，RNA濃度和純度用Nanodrop紫外分光光度計(jì)檢測，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，根據(jù)BeyoRTTM Ⅱ cDNA（互補(bǔ)脫氧核糖核酸）合成試劑盒說明書進(jìn)行RNA逆轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA于-20 ℃用于熒光定量PCR檢測。

1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)NCBI中雞MCEE和GAPDH基因mRNA（信使RNA）序列（NM_001293217.1和NM_204305.1），采用引物在線設(shè)計(jì)軟件Primer 3（http：//primer3.ut.ee）設(shè)計(jì)引物，引物序列信息見表1。引物由金唯智（廣州）生物科技公司合成。

1.4 熒光定量PCR

運(yùn)用SYBR Green Ⅰ染料法，進(jìn)行熒光定量PCR檢測，以GAPDH為內(nèi)參基因，檢測MCEE基因表達(dá)量。熒光定量PCR反應(yīng)體系：2×SYBR綠色熒光染料PCR混合液（2×SYBR Green Ⅰ PCR Mix）7.5 μL，10 μmol/L上下游引物各0.5 μL，1.0 μL 500 ng/μL cDNA，去RNA酶水（RNase-free Water）至15.0 μL。PCR反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

利用SPSS 19.0軟件分析黃羽肉雞體質(zhì)量和心臟相對質(zhì)量顯著性。MCEE基因相對表達(dá)量采用2-ΔΔCT法計(jì)算，利用SPSS 19.0軟件分析其顯著性。數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 熱環(huán)境對黃羽肉雞體質(zhì)量和心臟的影響

由圖1可見，新廣黃公雞21、28日齡體質(zhì)量以及28日齡心臟絕對質(zhì)量顯著高于懷鄉(xiāng)公雞（P<0.05），28日齡心臟相對質(zhì)量差異不顯著。熱環(huán)境處理7 d后，28日齡新廣黃公雞絕對體質(zhì)量試驗(yàn)組顯著低于對照組（P<0.05），而28日齡懷鄉(xiāng)公雞試驗(yàn)組與對照組差異不顯著（P<0.05）。試驗(yàn)組新廣黃公雞和懷鄉(xiāng)公雞心臟絕對質(zhì)量均顯著低于對照組（P<0.05），心臟相對質(zhì)量差異不顯著（P>0.05）。結(jié)果表明，高溫環(huán)境顯著影響快速型黃羽肉雞（新廣黃公雞）的生長速度，對慢速型黃羽肉雞（懷鄉(xiāng)公雞）影響不顯著（P>0.05），對黃羽肉雞心臟相對質(zhì)量無顯著影響（P>0.05）。

2.2 熱環(huán)境對黃羽肉雞心臟組織MCEE基因表達(dá)的影響

熱環(huán)境對黃羽肉雞心臟組織MCEE基因表達(dá)的影響結(jié)果見圖2。新廣黃公雞對照組心臟MCEE基因相對表達(dá)量顯著高于對照組懷鄉(xiāng)公雞（P<0.05）。熱環(huán)境顯著降低新廣黃公雞心臟MCEE基因相對表達(dá)量（P<0.05），而對懷鄉(xiāng)公雞心臟MCEE基因相對表達(dá)量影響不顯著（P>0.05）。

3 討論與結(jié)論

在熱環(huán)境下，28日齡新廣黃公雞試驗(yàn)組體質(zhì)量顯著低于對照組體質(zhì)量（P<0.05），而28日齡懷鄉(xiāng)公雞試驗(yàn)組與對照組體質(zhì)量差異不顯著（P>0.05）。有研究表明，白羽肉雞在12.8%[14-15];耐熱型高度近交品系[16]暴露在熱環(huán)境（35 ℃、7 h/d、7 d）下時(shí)，體質(zhì)量增加率為58.9%[17]。本研究中，新廣黃公雞在熱環(huán)境條件下，7 d的體質(zhì)量增加率約為59.7%，懷鄉(xiāng)公雞質(zhì)量增加約為45.1%。表明黃羽肉雞具有一定的耐熱能力，且經(jīng)過選育的新廣黃公雞在熱環(huán)境下的增質(zhì)量率較懷鄉(xiāng)公雞高。而熱環(huán)境對懷鄉(xiāng)公雞的增質(zhì)量率無顯著影響，在黃羽肉雞選育中，可以作為耐熱型黃羽肉雞品種。在熱環(huán)境下，雞生產(chǎn)性能的降低與機(jī)體組織器官的各種變化有關(guān)，這些器官變化包括腸道受損、相關(guān)免疫器官和心臟的相對質(zhì)

量減輕[18-19]。本研究發(fā)現(xiàn)，新廣黃公雞和懷鄉(xiāng)公雞在熱環(huán)境條件下，心臟相對質(zhì)量與對照組之間差異不顯著，表明在高溫?zé)岘h(huán)境（32 ℃，2～4周齡）條件下，28日齡體質(zhì)量較室溫下白羽肉雞體質(zhì)量降低約環(huán)境下，黃羽肉雞的心臟生理發(fā)育正常[20]。

MCEE基因是丙酸代謝通路基因，編碼丙二酰輔酶A表位異構(gòu)酶，是丙酰輔酶A代謝為丁二酰輔酶A的重要的代謝途徑。缺乏甲基丙二酰輔酶A突變酶或酶輔因子腺苷鈷胺的患者，在其組織和體液中積累甲基丙二酸，并表現(xiàn)出繼發(fā)性代謝紊亂，如高血糖、高氨血癥和間歇性低血糖[10]。丙酸代謝通路基因與模式動物代謝相關(guān)疾病的關(guān)系已被廣泛研究[9，11-13]，但在家禽中尚無報(bào)道。本研究中，心臟MCEE基因表達(dá)與黃羽肉雞生長速度呈正相關(guān)，且差異顯著?？焖傩忘S羽肉雞心臟MCEE基因表達(dá)受熱環(huán)境影響顯著下降而導(dǎo)致生長速度減慢;慢速型黃羽肉雞心臟MCEE基因表達(dá)受熱環(huán)境影響及其生長速度差異不顯著。

熱環(huán)境顯著降低新廣黃公雞體質(zhì)量及心臟MCEE基因表達(dá)水平，而對懷興公雞無顯著影響。初步表明MCEE基因表達(dá)水平與黃羽肉雞生長速度相關(guān)，在黃羽肉雞其他組織器官的表達(dá)有待進(jìn)一步研究。

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