基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討四妙丸治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的 作用機(jī)制

陳慧 龐學(xué)豐 李玉玲 吳燕紅 黃政治 林菊 陳玲

【摘 要】目的：基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，對(duì)四妙丸治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制進(jìn)行探討和研究。

方法：通過(guò)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)以口服生物利用度和類藥性為限定條件，對(duì)四妙丸所含化學(xué)成分進(jìn)行篩選并預(yù)測(cè)作用靶點(diǎn);通過(guò)GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)檢索類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病相關(guān)的靶點(diǎn)，將四妙丸預(yù)測(cè)靶點(diǎn)與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎相關(guān)靶點(diǎn)導(dǎo)入VENNY 2.1軟件，得到共同靶點(diǎn)，即四妙丸作用類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的靶點(diǎn);通過(guò)Cytoscape 3.7.0軟件構(gòu)建成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，并利用軟件中Network Analyzer插件分析網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)度和介數(shù)中心度;最后，通過(guò)DAVID在線分析工具對(duì)靶標(biāo)進(jìn)行基因本體（GO）功能富集分析和生物途徑（KEGG）通路富集分析。結(jié)果：四妙丸共收集52個(gè)有效化合物，并作用于14個(gè)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎相關(guān)的靶點(diǎn)。成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖顯示前列腺素G/H合成酶2、轉(zhuǎn)錄因子AP-1及腫瘤壞死因子是四妙丸治療RA的關(guān)鍵靶點(diǎn)，GO功能富集分析顯示126個(gè)生物過(guò)程、8個(gè)細(xì)胞組成、5個(gè)分子功能，KEGG通路富集分析顯示35條通路。結(jié)論：四妙丸通過(guò)一氧化氮生物合成過(guò)程的正調(diào)節(jié)、鈣調(diào)蛋白1-單加氧酶活性的正調(diào)節(jié)、發(fā)熱的正調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)等生物過(guò)程，并涉及細(xì)胞因子活性、生長(zhǎng)因子活性、酶結(jié)合等分子功能發(fā)揮治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的作用，且腫瘤壞死因子信號(hào)通路的調(diào)控是四妙丸治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的關(guān)鍵機(jī)制之一。

【關(guān)鍵詞】 關(guān)節(jié)炎，類風(fēng)濕;四妙丸;網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);作用機(jī)制

On the Mechanism of Simiao Wan（四妙丸）in the Treatment of Rheumatoid Arthritis Based on Network Pharmacology

CHEN Hui，PANG Xue-feng，LI Yu-ling，WU Yan-hong，HUANG Zheng-zhi，LIN Ju，CHEN Ling

【ABSTRACT】Objective：Based on the network pharmacological method，to explore the mechanism of

Simiao Wan（四妙丸）in the treatment of rheumatoid arthritis.Methods：The chemical constituents of Simiao Wan were screened and the targets were predicted by TCMSP database with oral bioavailability and pharmacokinetics as the limiting conditions.The targets related to rheumatoid arthritis were retrieved by GeneCards database，and the predicted targets of Simiao Wan and targets related to rheumatoid arthritis were put into the VENNY 2.1 software to get the common targets，namely the targets of Simiao Wan for rheumatoid arthritis.The component-target network was constructed by Cytoscape 3.7.0 software，to analyze the network node degree and the median centrality by using Network Analyzer plug-in software.Finally，functional enrichment analysis of gene ontology and KEGG pathway enrichment analysis were made by DAVID.Results：A total of 52 effective compounds were collected from Simiao Wan and acted on 14 targets related to rheumatoid arthritis.Component-target network showed that prostaglandin G/H synthase 2，transcription factor AP-1 and tumor necrosis factor were the key targets of Simiao Wan in the treatment of rheumatoid arthritis.GO functional enrichment analysis showed 126 biological processes，8 cell components and 5 molecular functions.KEGG pathway enrichment analysis showed 35 pathways.Conclusion：Simiao Wan can play a role in the treatment of rheumatoid arthritis through the positive regulation of nitric oxide biosynthesis，calmodulin-1-monooxygenase activity，positive regulation of fever，inflammatory reaction and other biological processes，involving the molecular functions of cytokine activity，growth factor activity，enzyme binding，and so on.The regulation of signal pathway is one of the key mechanisms of Simiao Wan in the treatment of rheumatoid arthritis.

【Keywords】 arthritis，rheumatoid;Simiao Wan（四妙丸）;network pharmacology;mechanism of action

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoed arthritis，RA）是一種以滑膜增生、關(guān)節(jié)破壞為主要特征的自身免疫系統(tǒng)疾病，臨床上常見(jiàn)對(duì)稱性小關(guān)節(jié)腫痛，發(fā)病過(guò)程中常伴關(guān)節(jié)外表現(xiàn)的結(jié)締組織病變。有研究顯示，RA在全球的發(fā)病率為0.5%～1.0%，我國(guó)患病率為0.42%[1]。臨床顯示，女性RA患病率顯著高于男性。隨著病情的發(fā)展，可能會(huì)導(dǎo)致殘疾。西醫(yī)學(xué)治療RA主要運(yùn)用非甾體抗炎藥、改善病情抗風(fēng)濕藥及糖皮質(zhì)激素等，這些藥物雖能緩解病情，但不良反應(yīng)頗多。四妙丸是治療濕熱阻絡(luò)型RA的經(jīng)典方劑，不僅能減輕濕熱阻絡(luò)型RA患者的癥狀，改善患者各項(xiàng)指標(biāo)及關(guān)節(jié)功能，而且不良反應(yīng)發(fā)生率低[2-3]。

四妙丸出自清·張秉成《成方便讀》，由蒼術(shù)、黃柏、牛膝、薏苡仁組成。生物堿是黃柏最重要的活性物質(zhì)，具有抗菌、改善關(guān)節(jié)軟骨代謝免疫抑制及抑制細(xì)胞免疫反應(yīng)等多方面的作用[4]。蒼術(shù)在《神農(nóng)本草經(jīng)》中被列為上品[5]，具有抗炎，抗腫瘤，免疫調(diào)節(jié)，改善消化系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)功能等多方面的藥理作用[6-7]。牛膝具有抗炎、鎮(zhèn)痛、調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤、抗骨質(zhì)疏松等藥理作用[8]。薏苡仁具有鎮(zhèn)痛、抗炎、抗血栓形成、提高機(jī)體免疫力、抗腫瘤等作用[9]?，F(xiàn)代藥理學(xué)對(duì)四妙丸中單藥的作用研究頗多，但對(duì)于四妙丸治療RA的多成分、多靶點(diǎn)、多通路作用機(jī)制研究尚不全面。本文基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，從分子水平闡明四妙丸的有效化合物、有效化合物和靶點(diǎn)以及靶點(diǎn)和疾病之間的機(jī)制，進(jìn)一步為四妙丸治療RA的作用機(jī)制提供方法依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1 研究方法

1.1 四妙丸所含化合物的收集與篩選 通過(guò)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)（TCMSP）收集四妙丸中蒼術(shù)、黃柏、牛膝、薏苡仁的化合物，并以口服生物利用度（OB）≥30%和類藥性

（DL）≥0.18[10]為限定條件對(duì)所收集到的化合物進(jìn)行篩選。

1.2 四妙丸所含化合物作用靶點(diǎn)的預(yù)測(cè) 對(duì)1.1中化合物的作用靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，并去重。由于部分預(yù)測(cè)靶點(diǎn)名稱不規(guī)范，所以將預(yù)測(cè)靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 10.5數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行校正，選擇“homo sapiens”，獲得預(yù)測(cè)靶點(diǎn)及對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)基因名。

1.3 RA發(fā)病靶點(diǎn)檢索及四妙丸作用RA相關(guān)靶點(diǎn)的預(yù)測(cè) 通過(guò)GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)檢索RA發(fā)病相關(guān)的靶點(diǎn)，取得分≥20分的靶點(diǎn)。將四妙丸預(yù)測(cè)靶點(diǎn)與RA相關(guān)靶點(diǎn)導(dǎo)入VENNY 2.1軟件，得到共同靶點(diǎn)，即四妙丸作用RA的靶點(diǎn)。

1.4 四妙丸所含化合物作用RA相關(guān)靶點(diǎn)相互作用的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將每個(gè)化合物與其作用的RA靶點(diǎn)相聯(lián)系，通過(guò)Cytoscape 3.7.0軟件進(jìn)行四妙丸的成分-RA相關(guān)靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建并繪制網(wǎng)絡(luò)圖，并利用軟件中的Network Analyzer插件分析網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)度和介數(shù)中心度。

1.5 四妙丸對(duì)RA作用靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 為了獲得四妙丸對(duì)RA作用靶點(diǎn)之間的聯(lián)系，將預(yù)測(cè)的四妙丸作用RA的靶點(diǎn)上傳至STRING 10.5數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//string-db.org），選擇研究物種為人類，設(shè)置靶點(diǎn)之間最低要求聯(lián)系分?jǐn)?shù)為0.4，并隱藏不與其他靶點(diǎn)聯(lián)系的靶點(diǎn)，獲得靶點(diǎn)聯(lián)系網(wǎng)絡(luò)圖。將該圖進(jìn)一步導(dǎo)入Cytoscape 3.7.0軟件進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析并構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。

1.6 四妙丸治療RA預(yù)測(cè)靶點(diǎn)富集分析 運(yùn)用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)，以P < 0.05作為篩選條件獲得靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行基因本體（GO）功能富集分析及生物途徑（KEGG）通路富集分析。選擇生物過(guò)程（biological process）、細(xì)胞組成（cellular component）和分子功能（ molecular function）3個(gè)部分繪圖。使用GraphPad Prism 7.0將GO功能富集分析中生物過(guò)程的前20個(gè)條目、細(xì)胞組成、分子功能的條目做成可視化條形圖。利用Omicshare將得到的KEGG結(jié)果制作成高級(jí)氣泡圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 四妙丸所含化合物的收集與篩選結(jié)果 篩選出四妙丸的活性化合物共52個(gè)，其中黃柏25個(gè)，蒼術(shù)4個(gè)，牛膝17個(gè)，薏苡仁6個(gè)。

2.2 四妙丸所含化合物作用靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)結(jié)果

2.1中52個(gè)化合物共檢索出830個(gè)預(yù)測(cè)靶點(diǎn)，并去重。將預(yù)測(cè)靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 10.5數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行校正，獲得494個(gè)預(yù)測(cè)靶點(diǎn)及對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)基因名。

2.3 RA相關(guān)靶點(diǎn)檢索及四妙丸作用RA相關(guān)靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)結(jié)果 通過(guò)GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)共檢索出3528個(gè)與RA相關(guān)的靶點(diǎn)，相關(guān)度最高的靶點(diǎn)是白細(xì)胞介素（IL）-6，得分為103.41分，相關(guān)度最低的靶點(diǎn)是LOC108684022（FRAXA Repeat Instability Region），得分為0.21分。得分≥20分的靶點(diǎn)共144個(gè)。將四妙丸52個(gè)有效化合物所對(duì)應(yīng)的494個(gè)預(yù)測(cè)靶點(diǎn)與144個(gè)RA相關(guān)靶點(diǎn)導(dǎo)入VENNY 2.1軟件，共得到14個(gè)共同靶點(diǎn)，即四妙丸作用RA的靶點(diǎn)，見(jiàn)圖1。

2.4 四妙丸有效化合物作用RA相關(guān)靶點(diǎn)相互作用的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果 將每個(gè)化合物與其作用的RA靶點(diǎn)相聯(lián)系，通過(guò)Cytoscape 3.7.0軟件做出化合物-靶點(diǎn)聯(lián)系圖，見(jiàn)圖2。利用軟件中自帶的Network Analyzer插件分析網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)度（degree）和介數(shù)中心度（betweenness）。數(shù)值越高，表明所對(duì)應(yīng)化合物或靶點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中越重要。圖2中化合物槲皮素（網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)度= 14，介數(shù)中心度 = 0.374 34）、漢黃芩素（網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)度= 6，介數(shù)中心度 = 0.064 34），靶點(diǎn)前列腺素G/H合成酶2（PTGS2，網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)度 = 27，介數(shù)中心度 = 0.821 94），轉(zhuǎn)錄因子AP-1（JUN，網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)度 = 4，介數(shù)中心度 = 0.013 59），腫瘤壞死因子（TNF，網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)度= 4，介數(shù)中心度=?0.013 59），說(shuō)明它們?cè)诰W(wǎng)絡(luò)中起關(guān)鍵作用，是四妙丸治療RA的主要有效化合物和靶點(diǎn)。

2.5 四妙丸對(duì)RA作用靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果 根據(jù)1.5中要求，STRING 10.5數(shù)據(jù)庫(kù)獲得14個(gè)靶點(diǎn)之間共81條聯(lián)系的網(wǎng)絡(luò)圖。將圖導(dǎo)入Cytoscape 3.6.1軟件進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析得出聯(lián)系其他靶點(diǎn)個(gè)數(shù)排名前6位的靶點(diǎn)依次是血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A（VEGFA，13個(gè)）、TNF（13個(gè)）、IL-6（13個(gè)）、JUN（13個(gè)）、IL-1B（12個(gè)）、PTGS2（12個(gè)）。四妙丸對(duì)RA作用靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)圖見(jiàn)圖3。

2.6 四妙丸治療RA預(yù)測(cè)靶點(diǎn)富集分析結(jié)果 把生物過(guò)程中前20條目、分子功能和細(xì)胞組成的條目繪制成條形圖，見(jiàn)圖4。

其中生物過(guò)程分析得到126個(gè)條目，細(xì)胞組成分析得到8個(gè)條目，分子功能得到5個(gè)條目。在生物過(guò)程分析中，一氧化氮（NO）生物合成過(guò)程的正調(diào)節(jié)、鈣調(diào)蛋白1-單加氧酶活性的正調(diào)節(jié)、發(fā)熱的正調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)、ERK1和ERK2級(jí)聯(lián)的正調(diào)節(jié)等排位靠前;在細(xì)胞組成分析中，主要包括細(xì)胞外空間、細(xì)胞外區(qū)域、質(zhì)膜外側(cè)等;在分子功能分析中，包括細(xì)胞因子活性、生長(zhǎng)因子活性、酶結(jié)合、內(nèi)肽酶活性及金屬內(nèi)肽酶活性。KEGG通路富集分析顯示共35條通路，取前20條通路制作KEGG高級(jí)氣泡圖見(jiàn)圖5，結(jié)果顯示，四妙丸治療RA的機(jī)制中TNF信號(hào)通路被顯著性富集。其中四妙丸作用于TNF通路排名靠前的化合物為槲皮素和漢黃芩素，見(jiàn)表1。與TNF信號(hào)通路相關(guān)的靶點(diǎn)有9個(gè)，分別是VCAM-1、IL-6、TNF、CCL-2、PTGS-2、JUN、IL-1B、MMP-3、SELE，其中PTGS2（網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)度 = 27，介數(shù)中心度 = 0.821 94）。節(jié)點(diǎn)度和介數(shù)中心度數(shù)值較高，是TNF通路中的關(guān)鍵靶點(diǎn)。此外，JUN（網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)度 = 4，介數(shù)中心度 = 0.013 59）和TNF（網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)度= 4，介數(shù)中心度= 0.013 59）也是該通路的主要靶點(diǎn)，與RA發(fā)生的機(jī)制密切相關(guān)。見(jiàn)表2。

3 討 論

RA是一種以關(guān)節(jié)滑膜炎癥為主要病理表現(xiàn)的慢性自身免疫性疾病。本研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素及漢黃芩素是四妙丸至關(guān)重要的有效化合物，TNF、IL-6、VEGFA、PTGS2、JUN是四妙丸治療RA的關(guān)鍵靶點(diǎn)。有研究表明，100，200，400 mg·kg-1的槲皮素灌胃能明顯減輕急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠的關(guān)節(jié)炎癥反應(yīng)，且對(duì)肝功能無(wú)損害[11]。槲皮素也能下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶-13/金屬蛋白酶組織抑制劑-1的比例，促進(jìn)抑制軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的降解，保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨[12]。此外，槲皮素還有綜合抗氧化能力，能通過(guò)多種途徑對(duì)多種腫瘤均具有抗癌特性[13]。大量體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究顯示，漢黃芩素能抑制誘導(dǎo)型一氧化氮合酶和環(huán)氧合酶-2（COX-2）的誘導(dǎo)，以及選擇性地抑制COX-2來(lái)減NO和前列腺素E2（PGE2）的產(chǎn)生，從而發(fā)揮抗炎作用[14-15]。

在四妙丸作用RA的14個(gè)靶點(diǎn)中，有2組靶點(diǎn)之間的聯(lián)系程度較高。第1組靶點(diǎn)是TNF、IL-6、IL-1B，均屬于炎性細(xì)胞因子，在RA滑膜病變中起核心作用。第2組靶點(diǎn)是VEGF，有強(qiáng)大的促血管增生和增強(qiáng)血管通透性的功能。滑膜血管翳是RA的基本病理改變，是在慢性滑膜炎的基礎(chǔ)上形成的。它的形成與VEGF及其受體介導(dǎo)的血管新生密切相關(guān)，并存在于RA整個(gè)病理過(guò)程中。這2組靶點(diǎn)能較好地闡釋四妙丸治療RA的作用機(jī)制。

在GO富集生物過(guò)程和分子功能中，NO生物合成過(guò)程的正調(diào)節(jié)、細(xì)胞因子活性具有顯著意義并排位第一。NO是一種高度反應(yīng)性的細(xì)胞毒性自由基，在各種疾病中都與組織損傷有關(guān)。在體外，NO對(duì)軟骨細(xì)胞的功能有害，包括抑制膠原蛋白和蛋白聚糖的合成，加快細(xì)胞凋亡。有研究顯示，RA患者血清及關(guān)節(jié)液中NO含量增高，說(shuō)明NO與RA的發(fā)病密切相關(guān)[16-17]。關(guān)節(jié)滑膜中高濃度的NO不僅使滑膜和軟骨組織損傷，并且使血管壁的通透性增加而引起滲出，滑膜腫脹、充血，使進(jìn)入組織中的巨噬細(xì)胞及中性粒細(xì)胞等釋放活性細(xì)胞因子共同參與滑膜的損傷。由于RA患者關(guān)節(jié)滑膜液中存在高濃度的TNF-α、IL-1β、IL-6等炎性細(xì)胞因子刺激滑膜組織、滑膜細(xì)胞過(guò)度表達(dá)COX-2，

引起PGE2及NO大量合成和釋放，而四妙丸所含的有效化合物能抑制COX-2在炎癥關(guān)節(jié)的表達(dá)與合成，故能明顯緩解RA患者的臨床癥狀。

TNF信號(hào)通路是四妙丸治療RA發(fā)病機(jī)制的重要通路。TNF因子在調(diào)節(jié)免疫功能的同時(shí)，過(guò)量可造成對(duì)組織的損傷[18]，能與其他促炎性細(xì)胞因子導(dǎo)致骨和軟骨的破壞[19]，也能抑制各種生長(zhǎng)因子對(duì)軟骨細(xì)胞的促有絲分裂作用。本研究發(fā)現(xiàn)，四妙丸能通過(guò)作用于TNF、IL-6、VEGFA、PTGS2、JUN等14個(gè)靶點(diǎn)而對(duì)RA發(fā)揮作用，且有9個(gè)靶點(diǎn)顯著富集到TNF信號(hào)通路，從而推知，四妙丸能通過(guò)調(diào)控TNF信號(hào)通路的表達(dá)，發(fā)揮抗炎鎮(zhèn)痛作用，從而達(dá)到緩解臨床癥狀，治療RA的目的。此外，從圖2中還可以看出，同一種藥物成分往往作用于多個(gè)靶點(diǎn)，每個(gè)靶點(diǎn)至少與2個(gè)以上的化合物相聯(lián)系，例如黃柏與牛膝的藥物成分槲皮素與14個(gè)靶點(diǎn)均有作用，蒼術(shù)與黃柏的藥物成分漢黃芩素與6個(gè)靶點(diǎn)均有聯(lián)系等，這些結(jié)果體現(xiàn)了中藥復(fù)方多成分、多靶標(biāo)的作用特點(diǎn)。

本研究通過(guò)中藥活性成分的篩選、靶點(diǎn)預(yù)測(cè)、網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析，從“藥物-靶點(diǎn)-疾病”關(guān)聯(lián)性對(duì)四妙丸治療RA的相關(guān)作用機(jī)制進(jìn)行分析，找出槲皮素及漢黃芩素是四妙丸至關(guān)重要的有效化合物，TNF、IL-6、VEGFA、PTGS2、JUN是四妙丸治療RA的關(guān)鍵靶點(diǎn)，TNF信號(hào)通路是四妙丸治療RA發(fā)病機(jī)制的重要通路。本研究表明，四妙丸治療RA呈現(xiàn)出的多分子、多靶點(diǎn)協(xié)同作用優(yōu)勢(shì)明顯，并為臨床研究提供方法依據(jù)和理論基礎(chǔ)，將進(jìn)一步加大對(duì)其研究。

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收稿日期：2019-03-24;修回日期：2019-05-08