電針內(nèi)關(guān)穴對(duì)缺氧誘導(dǎo)心肌損傷SD大鼠HIF-1α及VEGF的影響

修春英 ，陳 白 ，趙莉莉 ，汪 欣

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬康復(fù)醫(yī)院，福建 福州350003；2.福建省康復(fù)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州350003）

心血管疾病的發(fā)生是多種不良因素長(zhǎng)期相互作用的結(jié)果，已成為危害人類(lèi)健康、導(dǎo)致疾病和死亡的一個(gè)主要原因，而缺氧誘導(dǎo)的心肌損傷是心血管疾病的主要致病因素之一［1］。前期研究表明，針刺手厥陰心包經(jīng)穴位對(duì)急性缺氧下心功能損傷具有調(diào)節(jié)作用［2］，而 缺氧誘導(dǎo)因 子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是機(jī)體缺氧反應(yīng)中的關(guān)鍵作用因子。由此推測(cè)，手厥陰心包經(jīng)的針刺效應(yīng)可能與調(diào)控HIF-1α、VEGF相關(guān)。在此基礎(chǔ)上，本研究通過(guò)建立大鼠慢性缺氧模型，觀察針刺心包經(jīng)內(nèi)關(guān)穴對(duì)HIF-1α、VEGF的影響，從而探討其療效機(jī)制，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物與分組 SD大鼠60只，體質(zhì)量160～200 g，由福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)為SCXK（閩）2012-0001。隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、內(nèi)關(guān)組，每組20只。

1.2 主要儀器與試劑 低氧混合氣體（12%O2，88%N2，福州中銘工業(yè)氣體有限公司）；Trizol Reagent（美國(guó) Invitrogen 公司）；SYBY Premix Ex TaqTM、Prime-Script逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本TakaRa公司）；大鼠VEGF定量酶聯(lián)檢測(cè)試劑盒（南京建成生物工程研究所）；ALLEGRA 64R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)Beckman公司）；7500 Fast Real-Time PCR System（美國(guó)Applied Biosystems公司）；CODA型全自動(dòng)酶免分析儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；WQ-10D1型多用電子穴位測(cè)定治療儀（北京市海淀東華電子儀器廠）；1寸華佗牌一次性使用無(wú)菌針灸針 （蘇州醫(yī)療用品廠有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 模型建立 參照文獻(xiàn)［3］的造模方法，將模型組和內(nèi)關(guān)組大鼠置于低氧艙內(nèi)，持續(xù)通入低氧混合氣體（12%O2，88%N2）12 h，隨后通入空氣 12 h，連續(xù)12 d；對(duì)照組在相同的艙體內(nèi)通入空氣。低氧艙內(nèi)壓強(qiáng)、溫度和濕度保持一致，CO2濃度維持在0～0.8%范圍內(nèi)。

2.2 電針參數(shù) 建立模型后內(nèi)關(guān)組進(jìn)行電針內(nèi)關(guān)穴干預(yù)，每日1次，每次30 min，連續(xù)5 d。疏密波，刺激頻率10／20 Hz，強(qiáng)度以肢體出現(xiàn)輕微顫動(dòng)為度［4-5］。

2.3 觀察指標(biāo)及方法

2.3.1 實(shí)時(shí)定量 PCR法檢測(cè) HIF-1α、VEGF的mRNA表達(dá) ① 采用Trizol法抽提大鼠心肌組織的總RNA，通過(guò)OD260／OD280值進(jìn)行 RNA純度及含量的測(cè)定。取2 μg總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。引物序列如下：HIF-1α：上游引物5'-CAAAACACACAG CGAAGC-3'，下游引物 5'-TCAACCCAGACATATCC ACC-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度 473 bp；VEGF：上游引物5'-CCTTGCTGCTCTACCTCCAC-3'，下游引物 5'-ACTC CAGACCTTCGTCGTTG-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度 240 bp；βactin：上游引物 5'-CATCACTATCGGCAATGAGC-3'，下游引物5'-GACAGCACTGTGTTGGCATA-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度156 bp。② 去除基因組DNA：用DNase I消化RNA樣品，去除其中可能含有的基因組DNA。RNA純化及質(zhì)量檢測(cè)：用RNA純化試劑盒純化RNA，紫外吸收測(cè)定法測(cè)RNA濃度，變性瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA純度及完整性。③cDNA合成：逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。④ 實(shí)時(shí)定量PCR：將配好的混合液加到PCR Array對(duì)應(yīng)的每個(gè)孔中，然后置PCR Array于實(shí)時(shí)定量PCR儀進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min后，94℃變性30 s，62℃退火1 min，72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)后 72℃維持5 min。數(shù)據(jù)分析：采用ΔΔCt方法，先計(jì)算每個(gè)樣本的 ΔCt，ΔΔCt＝ΔCt（組別）－ΔCt（正常對(duì)照組），最后通過(guò)2-ΔΔCt計(jì)算各組別與對(duì)照組對(duì)應(yīng)基因的表達(dá)差異。

2.3.2 ELISA法檢測(cè)VEGF蛋白的含量 將心肌組織按1∶6加入勻漿緩沖液研磨成組織勻漿，10 000 r／min離心10 min，取上清，勻漿液置-20℃冰箱貯存?zhèn)溆?。檢測(cè)方法按試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，用全自動(dòng)酶免分析儀測(cè)定結(jié)果，檢測(cè)波長(zhǎng)為450 nm。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料符合正態(tài)分布以（）表示，采用單因素方差分析，在方差齊性的情況下，兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，方差不齊情況下用Dunnett’s T3檢驗(yàn)。

3 結(jié) 果

3.1 3組大鼠 HIF-1α、VEGF的 mRNA表達(dá)變化比較 見(jiàn)表1。

表1 3組大鼠HIF-1α、VEGF的mRNA 表達(dá)變化比較（）

表1 3組大鼠HIF-1α、VEGF的mRNA 表達(dá)變化比較（）

注：與正常對(duì)照組比較，1） P＜0.01；與模型組比較，2） P＜0.01。

組別正常對(duì)照組模型組內(nèi)關(guān)組n 20 20 20 HIF-1α 1 1.81±0.541）3.41±0.321）2）VEGF 1 2.17±0.811）3.50±0.171）2）

3.2 3組大鼠VEGF蛋白水平變化比較 見(jiàn)表2。

表2 3組大鼠VEGF蛋白水平變化比較（）

表2 3組大鼠VEGF蛋白水平變化比較（）

注：與正常對(duì)照組比較，1） P＜0.01；與模型組比較，2） P＜0.01。

組別正常對(duì)照組模型組內(nèi)關(guān)組n 20 20 20 VEGF／（μg／L）1.80±0.19 2.25±0.271）2.61±0.251）2）

4 討 論

缺氧是臨床常見(jiàn)的病理類(lèi)型，不僅見(jiàn)于傳統(tǒng)的高原環(huán)境缺氧，隨著現(xiàn)代生活方式的改變，生活中有氧運(yùn)動(dòng)不足再加上環(huán)境污染，人類(lèi)已不知不覺(jué)處在慢性缺氧的環(huán)境中。研究表明，缺氧誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)與高血壓病、動(dòng)脈粥樣硬化、缺血性心臟病等多種心血管疾病密切相關(guān)，并導(dǎo)致心臟受累而引發(fā)缺血性心臟病、肺源性心臟病和貧血性心臟?。?-7］。HIF-1α是目前發(fā)現(xiàn)具唯一特異在低氧狀態(tài)下發(fā)揮活性的轉(zhuǎn)錄因子，在缺氧誘導(dǎo)基因的表達(dá)調(diào)節(jié)過(guò)程中起關(guān)鍵作用［8］。VEGF是一種高度特異性的促血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子，具有增加血管通透性及促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增殖和血管形成的作用。HIF-1α能使VEGF的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)增強(qiáng)，增加血管生成，使血液到達(dá)缺氧部位，從而降低因缺氧帶給機(jī)體的損傷［9］。

基于缺氧在心血管疾病過(guò)程的重要性，慢性缺氧模型成為模擬心血管疾病的常用動(dòng)物模型。本研究通過(guò)持續(xù)通入低氧混合氣體的方法制備慢性缺氧的模型，結(jié)果顯示在慢性缺氧的環(huán)境中，大鼠心肌組織的HIF-1α、VEGF的mRNA的表達(dá)增加，同時(shí)VEGF的蛋白含量增加，證實(shí)了慢性缺氧下心肌組織的應(yīng)激反應(yīng)。

《靈樞·經(jīng)脈》曰：“心主手厥陰心包絡(luò)之脈，起于胸中，出屬心包絡(luò)?！苯?jīng)脈所過(guò)，主治所及，研究證實(shí)，針刺手厥陰心包經(jīng)穴位具有良好的心肌保護(hù)效應(yīng)［10］。前期研究顯示，循手厥陰心包經(jīng)取穴，電針內(nèi)關(guān)穴、天泉穴對(duì)缺氧狀態(tài)下的心功能具有良好的調(diào)節(jié)作用［2，11］。 鑒于以上的相關(guān)研究和前期研究，本研究選取內(nèi)關(guān)穴作為研究手厥陰心包經(jīng)的代表穴位。內(nèi)關(guān)穴作為手厥陰心包經(jīng)的絡(luò)穴、八脈交會(huì)穴，是臨床手厥陰心包經(jīng)治療心血管疾病最常用、最具代表意義的穴位。本研究結(jié)果顯示，針刺內(nèi)關(guān)穴能增加HIF-1α、VEGF的mRNA表達(dá)，同時(shí)心肌組織的VEGF蛋白含量也明顯升高，表明內(nèi)關(guān)穴可以通過(guò)調(diào)節(jié)對(duì)HIF-1α、VEGF的mRNA的表達(dá)，從而增加血管生成，提高機(jī)體對(duì)缺氧的耐受性，對(duì)缺氧誘導(dǎo)的心肌損傷具有保護(hù)作用。

綜上所述，針刺手厥陰心包經(jīng)內(nèi)關(guān)穴具有對(duì)抗缺氧誘導(dǎo)心肌損傷的作用，其作用機(jī)制可能與介導(dǎo)HIF-1α、VEGF的調(diào)控相關(guān)，從而為臨床應(yīng)用手厥陰心包經(jīng)防治心肌缺氧所致疾病提供部分理論依據(jù)。