巴戟天不同炮制品對大鼠肝藥酶CYP3A的影響

陳 紅，蔡真真，林麗虹，張清華，程再興

（福建中醫(yī)藥大學藥學院，福建 福州 350122）

CYP3A參與臨床約50%藥物的代謝，是最重要的P450酶之一。同時CYP 3A被誘導或抑制是藥物產(chǎn)生代謝性相互作用的主要原因。研究藥物對CYP3A的影響，可以預測藥物間的相互作用，從而提高療效，減少不良反應［1-2］。巴戟天為茜草科植物巴戟天Morinda officinalis How的干燥根，有補肝腎、強筋骨、祛風濕的作用，為“四大南藥”之一，臨床中除用生巴戟天飲片外，還有鹽巴戟天和制巴戟天飲片，其不同飲片的功效和臨床應用各有側(cè)重?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)其除具有與功效相關(guān)的鎮(zhèn)痛、抗炎、抗風濕等藥理作用外，還有抗腫瘤、抗抑郁等作用［3-5］。對于巴戟天在肝藥酶方面的影響還未見報道，本文通過采用肝微粒體體外溫孵法及定量PCR和Western blot技術(shù)，觀察巴戟天不同炮制品對CYP3A活性、蛋白及mRNA表達的影響，為巴戟天臨床配伍用藥和深入研究其炮制原理提供實驗依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 SPF級雄性SD大鼠，體質(zhì)量180～220 g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，許可證號 SCXK（滬）2012-0002。

1.2 實驗藥材 巴戟天產(chǎn)自福建永定，經(jīng)福建中醫(yī)藥大學藥學院范世明高級實驗師鑒定為茜草科植物巴戟天的干燥根及其炮制品，符合2015版《中國藥典》的要求。

1.3 試劑與儀器 苯甲基磺酰氟化物（PMSF，美國Sigma-aldrich公司）；二硫蘇糖醇（DTT，美國 Sigma-aldrich 公司）；UPLC（美國 Agilent公司）；Elix超純水系統(tǒng)（美國 Milipore公司）；solutionA、B（還原型輔酶 A、B溶液，美國BD biosciences公司）；睪酮、6β-羥基睪酮（日本nacalaitesque公司，純度＞98%）；吉非貝齊（內(nèi)標，美國Sigma-Aldrich公司，純度＞98%）；乙腈（色譜純，德國 Merck公司）；一抗（1∶3 000，兔抗鼠抗體，美國 Abcam公司）；二抗（1∶1 000，羊抗兔抗體，美國 Santa Cruz公司）；BT25S型精密電子天平（北京賽多利斯科學儀器有限公司）；CS150NX型超高速離心機（日本Hitachi公司）；pH計（瑞士 Mettler Toledo公司）；酶標儀（美國 BIORAD公司）；MS3digital型渦旋振蕩器（德國IKA公司）；5810R型高速離心機（德國Eppendorf公司），垂直電泳系統(tǒng)（美國Bio Rad公司）；ABI 7500 PCR擴增儀（美國Applied biosystems公司）。

2 實驗方法

2.1 供試液的制備 分別稱取巴戟天不同飲片，用10倍量水浸泡30 min后煎煮30 min，過濾后再加5倍量水煎煮30 min，合并煎煮液，減壓濃縮，1 000 r／min 離心 5 min，去沉淀，得濃度為 0.2 g／mL（生藥重／藥液體積，下同）藥液，取部分稀釋成0.1 g／mL 和 0.5 g／mL 濃度的藥液，低溫保存?zhèn)溆茫?］。

2.2 動物分組及給藥 將110只大鼠隨機分為：空白對照組、誘導劑苯巴比妥0.1 g／kg劑量組和生／制／鹽巴戟天 2.0、1.0、0.5 g／kg 劑量組，連續(xù)灌胃給藥7 d（空白對照組給予等量的水）。

2.3 肝微粒體制備 大鼠連續(xù)給藥7 d后，用烏拉坦（50%w／v，每只約 0.6 mL）腹腔注射麻醉，用冰冷的肝臟沖洗液從肝門靜脈在體沖洗肝臟至土黃色，剪取同部位肝臟組織（5.0±0.5）g置于沖洗液中，在4℃冷庫將其切碎，用冰冷的勻漿緩沖液勻漿。勻漿液10 400 r／min離心15 min；取上層35 000 r／min離心1 h，得肝微粒體。所得肝微粒體均勻混懸于 250 mmol／mL 蔗糖中，置于-80 ℃保存?zhèn)溆茫?］。肝微粒體總蛋白濃度采用考馬斯亮藍法進行測定。

2.4 Ⅰ相代謝反應體系及分析 在450 μL KPI溶液中分別加入 25 μL Solution A、5 μL Solution B 和10 μL 肝微粒體懸液，37 ℃、150 r／min 下水浴搖床預孵育5 min，再加入10 μL睪酮繼續(xù)孵育7／15 min，取出后立即冰浴并加入4 mL冰冷二氯甲烷終止反應，加入10 μL的2 mmol／L吉非貝齊作為內(nèi)標，3 000 r／min 渦旋 8 min 后，1 000 r／min 離心 15 min，取下層液3.5 mL，置于真空干燥箱中干燥后-20℃保存。分析時加入100 μL乙腈渦旋3 min，再加入100 μL超純水渦旋 3 min，13 000 r／min 離心 30 min，取上清 10 μL，UPLC 進樣分析，代謝速率以 6β-羥基睪酮的生成量進行計算。［8］

2.5 色譜條件 色譜系統(tǒng)：Agilent 1290 Infinity U PLC System，Agilent RRHDSB-C18色譜柱（3.0 mm×100 mm，1.8 m），流動相A乙腈，流動相B水（0～2.5 min，70%～10%B；2.5～4 min，10%～50%B；4～5 min，50%～70%B；5～6 min，70%B），流速 0.4 mL／min，柱溫40℃，檢測波長235 nm，洗脫時間6 min，進樣體積 10 μL。

2.6 Western blot實驗 取10 μg肝微粒體蛋白，用10%SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)印到PVDF膜，再用含有5%脫脂牛奶的TBST封閉2 h。漂洗后將膜與CYP 3A一抗于4℃孵育過夜，用TBST清洗膜3次，每次5 min，加入二抗室溫孵育1 h。采用ECL試劑使膜發(fā)光，并通過Quantity One（Bio-Rad）對蛋白條帶進行熒光定量，結(jié)果采用灰度值進行分析。

2.7 PCR實驗 肝臟組織中總RNA采用TRIzol提取法進行提取，反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄cDNA，于PCR擴增儀進行擴增和檢測。擴增中所需CYP3A引物按照文獻［9］進行設計，CYP3A1：forward primer 5′-GGAAATTCGATGTGGAGTGC-3′，reverse primer 3′-AGGTTTGCCTTTCTCTTGCC-5′；CYP3A2：forward primer 5′-AGTAGTGACGATTCCAACATAT-3′，reverse primer 3′-TCAGAGGTATCTGTGTTTCCT-5′；GADH：forward primer 5′-CTGTGGTCATGAGCCCCT CC-3′，reverse primer 3′-CGCTGGTGCTGAGTATGT CG-5′。 結(jié)果采用 2-ΔΔCT值進行分析。

2.8 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 16.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料符合正態(tài)分布以（）表示，采用單因素方差分析。

3 結(jié) 果

3.1 巴戟天不同炮制品對CYP3A酶活性的影響見表1。

表1 巴戟天不同炮制品對大鼠肝微粒體Ⅰ相代謝體系中6β-羥基睪酮生成速率影響的比較（，n＝3）

表1 巴戟天不同炮制品對大鼠肝微粒體Ⅰ相代謝體系中6β-羥基睪酮生成速率影響的比較（，n＝3）

注：與空白對照組比較，1）P＜0.05；與相應劑量及底物濃度的生巴戟天組比較，2）P＜0.05。

4 M 1.52±0.02 2.49±0.451）2.32±0.311）2.46±0.581）1.70±0.11 2.57±0.091）2.67±0.311）3.40±0.201）2）2.48±0.141）3.31±0.231）2）2.59±0.171）2）10 M 2.23±0.13 3.68±0.101）3.29±0.221）3.28±0.181）2.38±0.16 3.58±0.121）3.75±0.441）2）5.01±0.391）2）3.62±0.081）5.02±0.221）2）3.96±0.161）2）30 M 3.07±0.12 5.38±0.161）4.54±0.171）4.74±0.551）3.37±0.16 4.95±0.371）4.62±0.831）7.26±0.281）2）4.48±0.181）6.59±0.371）2）5.40±0.501）2）組別空白對照組苯巴比妥組生巴戟天組制巴戟天組鹽巴戟天組劑量 ／（g／kg）—0.1 0.5 1.0 2.0 0.5 1.0 2.0 0.5 1.0 2.0生成速率 ／［nmol／（mg·min）］

3.2 巴戟天不同炮制品對CYP3A酶蛋白和mRNA表達的影響 見表2。

4 討 論

P450酶的被誘導或抑制與藥物間產(chǎn)生的代謝性相互作用密切相關(guān)，當P450酶被抑制時會導致共服藥物代謝減慢，血藥濃度出現(xiàn)不可預期的升高，引發(fā)副作用甚至引起嚴重不良反應，當被誘導時又可導致共服藥物代謝加快而使藥效降低。P450蛋白和mRNA表達水平的變化是引起酶活性變化的主要機制。在大鼠肝臟中CYP3A主要包括CYP3A1、CYP3A2和CYP3A23等亞型，其中CYP3A1和CYP3A2是最主要的亞型，并參與多數(shù)臨床用藥的代謝過程［1-2，10］。

中藥在采用藥汁或輔料炮制后可能會產(chǎn)生對P450作用的增強或減弱，從而改變組方用藥后的效果，同時也可能會導致自身某些成分代謝的加快或減慢而改變藥理作用。巴戟天主要含有水晶蘭苷等環(huán)烯醚萜類、甲基異茜草素等蒽醌類和巴戟天多糖及揮發(fā)油等，通過鹽和甘草汁制后環(huán)烯醚萜類和蒽醌類等成分都會發(fā)生變化，進而導致生、鹽、制巴戟天功效發(fā)生變化［11-15］。

表2 巴戟天不同炮制品對大鼠肝微粒體CYP3A蛋白和肝組織CYP3A mRNA表達水平影響的比較（，n＝3）

表2 巴戟天不同炮制品對大鼠肝微粒體CYP3A蛋白和肝組織CYP3A mRNA表達水平影響的比較（，n＝3）

注：與空白對照組比較，1）P＜0.05；與相應劑量及底物濃度的生巴戟天組比較，2）P＜0.05。

蛋白表達水平1.00±0.00 3.44±0.121）3.15±0.081）3.57±0.581）2.30±0.041）2.19±0.351）1.94±0.172）2.66±0.171）2.30±0.361）2.57±0.881）4.03±1.591）2）CYP3A1 1.00±0.00 3.82±0.211）3.14±0.081）3.57±0.561）2.31±0.041）2.30±0.361）2.57±0.881）4.03±1.591）2）2.19±0.351）1.94±0.172）2.66±0.211）CYP3A2 1.00±0.00 2.98±0.091）2.20±0.021）1.69±0.01 1.96±0.011）2.11±0.081）2.11±0.031）2）2.11±0.021）2.14±0.081）3.29±1.141）2.15±0.931）組別空白對照組苯巴比妥組生巴戟天組制巴戟天組鹽巴戟天組劑量 ／（g／kg）—0.1 0.5 1.0 2.0 0.5 1.0 2.0 0.5 1.0 2.0 mRNA表達水平

本文研究結(jié)果表明：生巴戟天在《中國藥典》規(guī)定的3～10 g（人用量，下同）劑量范圍內(nèi)對大鼠肝藥酶CYP3A活性有誘導作用，當達到20 g的劑量時對CYP3A不具有誘導作用。而制巴戟天和鹽巴戟天在5、10、20 g的劑量下對CYP3A均有誘導作用，而且制巴戟天隨著劑量的增加誘導作用增強，鹽巴戟天在10 g劑量下的誘導作用最強。生巴戟天經(jīng)過甘草汁制后，在5、10 g劑量下對CYP3A的誘導作用未發(fā)生明顯變化，在20 g的劑量下誘導作用明顯增；經(jīng)用鹽炮制后，在5 g劑量下誘導作用也未發(fā)生明顯變化，在10、20 g的劑量下誘導作用明顯增強。巴戟天各種炮制品均可誘導CYP3A蛋白和CYP3A1和CYP3A2 mRNA的表達增加。

以上結(jié)果說明巴戟天在炮制前后對CYP3A均有一定的誘導作用，用甘草汁和鹽炮制后誘導作用進一步增強，尤其是甘草汁制巴戟天隨著用藥量的增加誘導作用也隨之增強，主要機理可能與其可誘導CYP3A蛋白及CYP3A1、CYP3A2 mRNA的表達增加有關(guān)。炮制后誘導作用的增強將會進一步加速某些成分在體內(nèi)的代謝，從而導致抗炎鎮(zhèn)痛、祛風濕作用減弱，而補腎助陽作用被突出出來。但由于中藥成分體系的復雜性，還需要進一步明確巴戟天不同功效的主要物質(zhì)基礎及其體內(nèi)過程等相關(guān)內(nèi)容，才能更進一步的揭示巴戟天采用鹽和甘草汁炮制的原理。