大蒜降壓肽的制備及超濾分離

宋凱強(qiáng),劉鵬莉,鄭振佳,喬旭光

(山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東省高校食品加工技術(shù)與質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東泰安 271018)

大蒜(AlliumsativumL.)具有抗氧化、抗菌、改善免疫功能、降血糖、防癌和預(yù)防心血管疾病等功效[1-3]。大蒜蛋白的組成有半胱氨酸、組氨酸、賴氨酸、丙氨酸、精氨酸和天冬氨酸等多種氨基酸[4]。目前將蛋白水解制備成不同種類的活性肽并進(jìn)行相應(yīng)的單體制備、結(jié)構(gòu)解析和活性評(píng)價(jià)是蛋白領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[5-10]。

降壓肽又稱血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(angiotensin converting enzyme,ACE)抑制肽,其作用機(jī)制主要為降低在腎素-血管緊張素系統(tǒng)中起關(guān)鍵功能的ACE的活性而起到降壓效果[11],于1965年首次被Ferreira從蛇毒中發(fā)現(xiàn)后[12],在綠豆、乳清蛋白、魚類和微藻等的酶水解產(chǎn)物中也發(fā)現(xiàn)了ACE抑制肽[13-16]。目前市面上常見的降壓藥均有一定的副作用,如引起哮喘、痛風(fēng)和雙側(cè)腎動(dòng)脈狹窄等病癥[17],而食源性ACE抑制肽因其作用穩(wěn)定、副作用極小等優(yōu)點(diǎn)在近年的功能性食品領(lǐng)域中被關(guān)注[18]。

超濾是一種以壓力差為推動(dòng)力的膜分離方法,利用超濾膜截留大分子物質(zhì),透過小于膜孔徑的溶劑和小分子物質(zhì)的性質(zhì)來(lái)分離物料[19]。因操作過程中節(jié)能、環(huán)保且易于控制,因而在污水治理、食品加工、醫(yī)藥和治療等方面已獲得廣泛應(yīng)用[20]。因降壓肽分子量較小,而酶解產(chǎn)物體系中存在部分降壓活性低或無(wú)降壓活性的大分子物質(zhì),所以可通過除去這些大分子物質(zhì)來(lái)富集降壓肽,提高降壓活性,超濾是最常用的方法[21-22]。超濾膜的膜通量作為膜分離過程中的一個(gè)重要工藝參數(shù),影響著處理效率、運(yùn)行成本和超濾膜的使用壽命,常被選作超濾工藝優(yōu)化的指標(biāo)[23]。

本研究以大蒜蛋白為原料,通過酶解方法制備降壓肽,研究不同酶的作用效果,優(yōu)化酶解參數(shù),對(duì)酶解產(chǎn)物進(jìn)行初步分離,探索其對(duì)ACE的抑制效果及分離組分的氨基酸組成及分子量分布,為大蒜蛋白質(zhì)的深度開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大蒜蛋白(蛋白含量為82.36%±0.26%) 實(shí)驗(yàn)室自制;ACE 美國(guó)Sigma公司;堿性蛋白酶(≥200 U/mg)、風(fēng)味蛋白酶(≥20 U/mg)、復(fù)合蛋白酶(100 U/mg)、胰蛋白酶1∶250(>250 U/mg)、中性蛋白酶(60 U/mg) 北京索萊寶科技有限公司;N-[3-(2-呋喃基)丙烯酰]-L-苯丙氨酰-甘氨酰-甘氨酸(N-[3-(2-furylacryloyl)]-L-phenyalanyl-glycyl-glycine,FAPGG)、木瓜蛋白酶(≥3 U/mg)、胃蛋白酶(>3000 U/mg) 上海麥克林生化科技有限公司。

DMJ-60流動(dòng)分析儀、卷式超濾膜元件 濟(jì)南博納生物技術(shù)有限公司;SCIENTZ-12N冷凍干燥機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司;ZW-A型微量振動(dòng)器 常州智博瑞儀器制造有限公司;DH6000 Ⅱ電熱恒溫培養(yǎng)箱 天津泰斯特儀器有限公司;SpectraMax M5多功能酶標(biāo)儀 美國(guó)Molecular Devices公司;L8900型氨基酸分析儀 日本日立公司;DAWN HELEOS II 18角度激光光散射凝膠滲透色譜系統(tǒng) 美國(guó)WYATT技術(shù)公司;Agilent 1100高效液相色譜儀 美國(guó)Agilent公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大蒜降壓肽制備用酶的篩選 參考黎觀紅的方法[24]。參照產(chǎn)品供應(yīng)商提供的酶最適反應(yīng)條件:堿性蛋白酶(45 ℃,pH10.5)、風(fēng)味蛋白酶(55 ℃,pH7.0)、復(fù)合蛋白酶(53 ℃,pH8.0)、木瓜蛋白酶(55 ℃,pH7.0)、胰蛋白酶(37 ℃,pH7.6)、中性蛋白酶(40 ℃,pH7.0)和胃蛋白酶(37 ℃,pH1.5),用去離子水配制大蒜蛋白懸濁液(底物濃度為40 g/L),于90 ℃下水浴10 min,超聲(功率為150 W,頻率為40 kHz)10 min。將其分別于上述各酶的最適反應(yīng)溫度下保溫10 min,用0.5 mol/L的鹽酸溶液/氫氧化鈉溶液調(diào)至對(duì)應(yīng)各酶的最適反應(yīng)pH,向蛋白液中加入酶底比(Enzyme/substrate,E/S)為4%的酶,充分振蕩后水浴酶解(反應(yīng)過程中不斷加入標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液/氫氧化鈉溶液以保持pH)。分別在反應(yīng)0.25、0.50、1.00、1.50、2.50、3.50、5.00、6.50 h時(shí)取出,于100 ℃下水浴10 min滅酶,冷卻,4000 r/min離心10 min,收集上清液測(cè)定ACE抑制率。

1.2.2 ACE抑制率的測(cè)定 參照Holmquist和Li的方法[25-26],考察ACE抑制率評(píng)價(jià)降壓肽活性。其中,緩沖液和反應(yīng)物分別為80 mmol/L pH8.3的HEPES-NaOH(含0.3 mol/L NaCl)和緩沖液配制的1 mmol/L FAPGG。

將1.2.1中的各酶解液按1∶30比例加去離子水稀釋,分別取40 μL稀釋后的酶解液、37 ℃預(yù)熱15 min的50 μL反應(yīng)物和10 μL現(xiàn)配制的ACE水溶液(0.1 U/mL),加入酶標(biāo)板中混合,快速放入酶標(biāo)儀中測(cè)定340 nm下的吸光度,記為c1,將酶標(biāo)板置于37 ℃培養(yǎng)箱中30 min后,再次測(cè)定340 nm下的吸光度,記為c2。空白對(duì)照使用40 μL緩沖液代替酶解液,記空白初始的吸光度為d1,30 min后的吸光度為d2,可知空白吸光度的減少量是D=(d1-d2),酶解液孔吸光度的減少量是C=(c1-c2),進(jìn)而可得所測(cè)酶解液的ACE抑制率為:

ACE抑制率(%)=(1-C/D)×100

此外,以ACE抑制率為縱坐標(biāo),log待測(cè)液濃度為橫坐標(biāo),進(jìn)行回歸分析可得IC50。

1.2.3 水解度的測(cè)定 參考Taylor的方法[27]。取5 mL 1.2.1中的酶解液與50 mL蒸餾水混勻后,以0.1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)pH至7.0。加入10 mL 38%(v/v)甲醛溶液并在室溫下放置5 min,以0.1 mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至pH8.5。水解度(Hydrolysis Degree,DH)的計(jì)算公式如下,其中,樣品總氮經(jīng)凱氏定氮法(GB 5009.5-2016)測(cè)得。

DH(%)=[(V×c×0.014)/N]×100

其中,V為使用0.1 mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積(mL);c為氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度(mol/L);0.014為氮毫克當(dāng)量;N為樣品總氮(g)。

1.2.4 大蒜降壓肽酶解制備工藝優(yōu)化

1.2.4.1 單因素實(shí)驗(yàn) 固定其他條件pH10.5,底物濃度40 g/L,E/S 4%,考察溫度(35、40、45、50、55 ℃)對(duì)酶解產(chǎn)物ACE抑制率的影響;固定其他條件溫度45 ℃,底物濃度40 g/L,E/S 4%,考察pH(9.5、10.0、10.5、11.0、11.5)對(duì)酶解產(chǎn)物ACE抑制率的影響;固定其他條件溫度45 ℃,pH10.5,E/S 4%,考察底物濃度(20 g/L、30 g/L、40 g/L、50 g/L、60 g/L)對(duì)酶解產(chǎn)物ACE抑制率的影響;固定其他條件溫度45 ℃,pH10.5,底物濃度40 g/L,考察E/S(2%、3%、4%、5%、6%)對(duì)酶解產(chǎn)物ACE抑制率的影響。

1.2.4.2 響應(yīng)面法優(yōu)化 在單因素考察實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,以溫度(A)、pH(B)、底物濃度(C)和E/S(D)四個(gè)因素為自變量,以ACE抑制率為響應(yīng)值,選擇Design-Expert V 8.0.6.1軟件的Box-Behnken設(shè)計(jì)并進(jìn)行試驗(yàn)。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)的因素水平表Table 1 Factors and levels table of response surface experiment

1.2.5 不同分子量降壓肽超濾分離工藝的優(yōu)化

1.2.5.1 不同組分的ACE抑制活性評(píng)價(jià) 將在1.2.4得到的最佳制備工藝下獲得的酶解液調(diào)pH至7.0后冷凍干燥,取凍干粉以去離子水配成溶液。在超濾的操作條件為壓力0.20 MPa、溫度25 ℃、溶液濃度3%時(shí),以截留分子量為3、6 kDa的超濾膜將酶解產(chǎn)物按分子量(Molecular Weight,MW)分離成MW>6 kDa、3 kDa

1.2.5.2 超濾工藝的優(yōu)化 同1.2.5.1處理得酶解液凍干粉末,配制成不同濃度的溶液進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。超濾的初始條件為:壓力0.20 MPa、溫度25 ℃、溶液濃度3%。固定其他條件,以膜通量為評(píng)價(jià)指標(biāo)分別考察操作壓力(梯度為0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 MPa)、溫度(梯度為5、15、25、35、45 ℃)、溶液濃度(梯度為1%、2%、3%、4%、5%)的影響。

1.2.6 氨基酸組成分析 將1.2.5下獲得的分離組分冷凍干燥,獲得的凍干粉即為測(cè)定樣品。參照GB 5009.124-2016,以外標(biāo)法檢測(cè)樣品液中17種氨基酸的濃度。離子交換柱(4.6 mm×60 mm,3 μm),日立專用離子交換樹脂,分析周期53 min,分離柱柱溫70 ℃,反應(yīng)柱柱溫135 ℃,流動(dòng)相為茚三酮和茚三酮緩沖液,流速0.35 mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)570 nm和440 nm。

參照GB/T 15400-2018,以高效液相色譜法測(cè)定樣品中色氨酸的含量。色譜柱Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm),柱溫25 ℃,流動(dòng)相為乙酸鈉緩沖溶液+甲醇(v∶v=95∶5),流速1.0 mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm。

1.2.7 分子量分布分析 將1.2.5下獲得的分離組分冷凍干燥,獲得的凍干粉即為測(cè)定樣品。參照于志鵬等的高效凝膠過濾色譜法[28]。色譜柱Shodex PROTEIN KW-803(8 mm×300 mm,5 μm),柱溫40 ℃,流動(dòng)相為超純水(含0.02%疊氮化鈉),流速1.0 mL/min。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 不同酶處理后產(chǎn)物的ACE抑制活性評(píng)價(jià)

測(cè)得大蒜蛋白的上清液對(duì)ACE的抑制率為0.91%,幾乎無(wú)ACE抑制活性。由圖1可知,經(jīng)7種酶處理后的產(chǎn)物均有不同程度的ACE抑制活性,這說(shuō)明是大蒜蛋白酶解后產(chǎn)生的肽具有ACE抑制效果。在酶解初期,經(jīng)堿性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶處理的產(chǎn)物的ACE抑制活性隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸上升,分別在1.0、3.5、1.0、2.5 h時(shí)達(dá)到最高,對(duì)應(yīng)的ACE抑制率為68.45%、62.72%、63.51%、59.37%。隨著時(shí)間的繼續(xù)延長(zhǎng),ACE抑制率在波動(dòng)中下降,這與Jiang等[29]研究結(jié)果相似。經(jīng)風(fēng)味蛋白酶和胰蛋白酶處理后,產(chǎn)物的ACE抑制活性隨時(shí)間的延長(zhǎng)均呈現(xiàn)先上升后逐漸下降的趨勢(shì),且均于1.5 h時(shí)達(dá)到最高,此時(shí)ACE抑制率分別為34.11%和69.33%,這與Hanafi等[13]和Zarei等[30]的研究結(jié)果較為一致。木瓜蛋白酶的水解產(chǎn)物在0～1.5 h幾乎無(wú)ACE抑制活性(0～1.18%),隨著時(shí)間的繼續(xù)延長(zhǎng)而逐漸上升,在6.5 h時(shí)達(dá)到最高,為27.51%。綜合ACE抑制活性、酶解時(shí)間、經(jīng)濟(jì)成本方面的考慮,選擇以堿性蛋白酶制備大蒜降壓肽。

圖1 不同酶處理后產(chǎn)物的ACE抑制活性評(píng)價(jià)Fig.1 ACE inhibitory activity evaluation ofgarlic protein hydrolysates prepared with different proteases

2.2 ACE抑制活性和水解度隨時(shí)間的變化

圖2是大蒜蛋白經(jīng)堿性蛋白酶在溫度45 ℃、pH10.5、底物濃度40 g/L、E/S 4%反應(yīng)條件下,產(chǎn)物的ACE抑制活性和DH隨時(shí)間的變化曲線。由圖2可知,在0～1.0 h內(nèi),ACE抑制率隨時(shí)間的延長(zhǎng)而迅速增加,在1.0 h時(shí)為12.67%。在1.0～6.5 h,ACE抑制率隨時(shí)間的延長(zhǎng)在波動(dòng)中下降。在0～1.5 h內(nèi),DH迅速增加,之后呈現(xiàn)緩慢上升的趨勢(shì),ACE抑制率和DH隨時(shí)間的變化趨勢(shì)并不相同。推斷其原因?yàn)殡S著時(shí)間的延長(zhǎng),ACE抑制肽被繼續(xù)水解,分解為ACE抑制活性低或無(wú)活性的肽片段、游離氨基酸等,因此在水解的后期呈現(xiàn)水解度上升,而ACE抑制率整體下降的趨勢(shì)[31]。綜合ACE抑制率和水解度考慮,選擇酶解時(shí)間為1.0 h。

圖2 ACE抑制活性和水解度隨時(shí)間的變化Fig.2 changes of DH and ACE inhibitory activity with time

2.3 大蒜降壓肽制備工藝的單因素實(shí)驗(yàn)

2.3.1 溫度對(duì)ACE抑制率的影響 由圖3可知,ACE抑制率在50 ℃達(dá)到最大值(72.74%)后逐漸下降,在35 ℃時(shí)最低,為62.54%,原因可能是溫度過高使酶的次級(jí)鍵斷裂,降低了酶活,因而ACE抑制活性降低,該結(jié)果與Li等[26]的研究一致,因此初步選定溫度為50 ℃。

圖3 溫度對(duì)產(chǎn)物ACE抑制率的影響Fig.3 Effect of temperature on the ACE inhibitory rate of garlic protein hydrolysate

2.3.2 pH對(duì)ACE抑制率的影響 由圖4可知,ACE抑制率在pH10.5處達(dá)到最高值(68.65%)后逐漸下降,在pH11.5處最低,為60.48%,機(jī)理推斷為pH的升高影響了酶活性部位的構(gòu)象、酶和底物分子的解離狀態(tài),因而降低了酶活,ACE抑制活性減弱,在對(duì)紫菜ACE抑制肽的研究中也觀察到類似的變化[31],故初步選定pH10.5進(jìn)行后續(xù)研究。

圖4 pH對(duì)產(chǎn)物ACE抑制率的影響Fig.4 Effect of pH on the ACE inhibitory rate of garlic protein hydrolysate

2.3.3 底物濃度對(duì)ACE抑制率的影響 由圖5可知,ACE抑制率在底物濃度40 g/L達(dá)到最高(68.83%)后逐漸下降,在20 g/L時(shí)最低,為51.39%,原因可能是過高的底物濃度抑制了蛋白酶的擴(kuò)散,抑制了酶解反應(yīng),結(jié)合對(duì)小麥胚芽蛋白ACE抑制肽的研究結(jié)果進(jìn)行分析[32],初步選定底物濃度為40 g/L進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

圖5 底物濃度對(duì)產(chǎn)物ACE抑制率的影響Fig.5 Effect of substrate concentration on the ACE inhibitory rate of garlic protein hydrolysate

2.3.4 E/S對(duì)ACE抑制率的影響 由圖6知,E/S為3%時(shí),ACE抑制率達(dá)到最高值(72.01%)后逐漸下降,在E/S為6%時(shí)最低,為60.68%,原因可能是隨著E/S增加,部分對(duì)ACE有抑制作用的肽被進(jìn)一步酶解為活性低甚至無(wú)活性的小肽,參考Huang等[32]研究結(jié)果后選定E/S為3%進(jìn)行下一步研究。

圖6 E/S對(duì)產(chǎn)物ACE抑制率的影響Fig.6 Effect of enzyme/substrate on the ACE inhibitory rate of garlic protein hydrolysate

2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化酶解工藝

2.4.1 Box-Benhnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 以溫度(A)、pH(B)、底物濃度(C)和E/S(D)四個(gè)因素為自變量,以ACE抑制率為響應(yīng)值,利用Design-Expert V 8.0.6.1軟件中的Box-Benhnken設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 The design and results of the response surface experimental

表3 響應(yīng)面二次模型方差分析Table 3 Analysis of variance for response surface quadratic model

注:*表示差異顯著(P<0.05);**表示差異極顯著(P<0.01)。

2.4.2 回歸方程擬合及方差分析 利用Design-Expert V 8.0.6.1軟件對(duì)2.4.1實(shí)驗(yàn)結(jié)果處理分析得回歸方程:

Y=-1597.16667+37.42A+56.59B+16.51C+39.79D-1.29AB-0.02AC-0.38AD-0.64BC+2.82BD-0.20CD-0.21A2+1.40B2-0.09C2-6.65D2

2.4.3 最佳酶解條件的調(diào)整及驗(yàn)證 以Design-Expert V 8.0.6.1軟件分析得到大蒜降壓肽酶解制備的最佳工藝為:溫度49.14 ℃,pH11,底物濃度42.88 g/L,E/S為3.27%,在此條件下,模型預(yù)測(cè)大蒜蛋白酶解產(chǎn)物的ACE抑制率為84.77%。考慮到實(shí)際應(yīng)用過程中操作方便,將工藝條件調(diào)整為溫度50 ℃,pH11,底物濃度45 g/L,E/S為3%,在該條件下進(jìn)行三次重復(fù)實(shí)驗(yàn),大蒜蛋白酶解產(chǎn)物實(shí)際的ACE抑制率為83.91%±0.13%,與模型預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差為1.01%,說(shuō)明響應(yīng)面法優(yōu)化后的工藝可以有效制備大蒜降壓肽。該條件下的IC50為(157.87±0.44) μg/mL。

2.5 超濾分離的工藝優(yōu)化

2.5.1 不同組分的ACE抑制活性評(píng)價(jià) 超濾技術(shù)對(duì)大分子與小分子物質(zhì)的分離效果較好,常用于多肽的初步分離。膜通量因關(guān)系到超濾的經(jīng)濟(jì)成本、運(yùn)行能耗等,常被選作工藝優(yōu)化的指標(biāo)[23]。

表4 不同超濾分離組分的ACE抑制活性評(píng)價(jià)Table 4 ACE inhibitory activity evaluation of ultrafiltration separation fractions

注:不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

以截留分子量為3、6 kDa的超濾膜分離酶解液(按2.4最佳工藝下制備且已調(diào)pH至7)得到MW>6 kDa、3 kDa

2.5.2 超濾工藝參數(shù)的確定

2.5.2.1 操作壓力的確定 由圖7知,同一操作時(shí)間下膜通量均隨壓強(qiáng)的升高而增加,分析原因?yàn)椴僮鲏毫Φ纳呤谷芤捍┻^超濾膜的速率增加;同一壓強(qiáng)下,膜通量隨時(shí)間的延長(zhǎng)先呈現(xiàn)不同程度的下降后趨于穩(wěn)定,是超濾過程中產(chǎn)生的濃差極化與膜污染造成的[34],這均與張艷萍等[35]的研究結(jié)果相似。0.30與0.25 MPa下穩(wěn)定后的膜通量相近,分別為7.40、7.20 L/(m2·h),0.10～0.20 MPa時(shí)后期膜通量一直較低,范圍為(4.35～6.60) L/(m2·h),超濾的總效率不高。考慮實(shí)際生產(chǎn)中較高壓力下進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的超濾增加了能源消耗和膜污染,選擇以0.25 MPa為操作壓力,操作時(shí)間為25 min時(shí),膜通量為(7.60±0.03) L/(m2·h)。

圖7 不同操作壓力下的膜通量隨時(shí)間的變化Fig.7 Flux of membrane changes over time in different operating pressure

2.5.2.2 溫度的確定 由圖8知,同一操作時(shí)間下,膜通量均隨溫度的升高而增加,這是由于溫度升高時(shí),溶液的粘度變小,擴(kuò)散系數(shù)變大,濃差極化現(xiàn)象削弱,因而膜通量隨之上升,這與程緣等[36]的研究結(jié)果一致。因45 ℃與機(jī)器的最高工作溫度55 ℃較為接近,還可能引起蛋白質(zhì)的變性,35 ℃易滋長(zhǎng)微生物,而25 ℃接近室溫,若用于工業(yè)生產(chǎn)上節(jié)省了加熱料液的能耗且后期膜通量穩(wěn)定時(shí)與35、45 ℃較為相近,25、35和45 ℃對(duì)應(yīng)膜通量6.62、6.80、7.00 L/(m2·h),因此選擇25 ℃為超濾溫度,操作時(shí)間25 min時(shí),膜通量為(6.72±0.26) L/(m2·h)。

圖8 不同溫度下的膜通量隨時(shí)間的變化Fig.8 Flux of membrane changes over time in different temperature

2.5.2.3 溶液濃度的確定 由圖9知,同一時(shí)間下,膜通量隨溶液濃度的升高而降低,這是由于當(dāng)溶液濃度升高時(shí),溶液的粘度變大,擴(kuò)散系數(shù)降低,濃差極化和凝膠層易在膜表面產(chǎn)生,因而膜通量降低,這與朱靜靜等[37]的研究結(jié)果相似。當(dāng)溶液濃度為1%～2%時(shí),溶液中的肽含量較低,整體的超濾效率不高,當(dāng)溶液濃度為3%～5%時(shí),后期膜通量相近,3%、4%和5%分別對(duì)應(yīng)膜通量6.60、6.55、6.50 L/(m2·h),但溶液濃度的提高也加重了膜污染,從經(jīng)濟(jì)及超濾效率考慮,選擇超濾的溶液濃度為4%,操作時(shí)間25 min時(shí),膜通量為(6.60±0.13) L/(m2·h)。

圖9 不同溶液濃度下的膜通量隨時(shí)間的變化Fig.9 Flux of membrane changes over time in different solution concentration

2.5.2.4 超濾優(yōu)化工藝的驗(yàn)證 優(yōu)化后的超濾工藝為:操作壓力0.25 MPa,溫度25 ℃,溶液濃度4%,在該條件下進(jìn)行三次重復(fù)實(shí)驗(yàn),膜通量相對(duì)較高(操作時(shí)間25 min),為7.32 L/(m2·h)。研究建立的超濾工藝可為大蒜降壓肽的工業(yè)生產(chǎn)提供參考。超濾分離獲得的MW<3 kDa組分的IC50為(63.27±0.25) μg/mL。

2.6 分離組分氨基酸組成分析

由表5知,MW<3 kDa組分的單種氨基酸中天冬氨酸和谷氨酸含量很高,分別是21.66、14.12 mg/100 mL,和之前的報(bào)道諸多降壓肽(如源于魚類和貝類的)均含有豐富的天冬氨酸、谷氨酸相似[38-39]。疏水性氨基酸含量較高,為32.86 mg/100 mL,與之前研究證實(shí)的疏水性氨基酸的側(cè)鏈可與ACE受體緊密結(jié)合,因而ACE抑制活性較強(qiáng)相符[40]。堿性氨基酸和脯氨酸含量分別為17.03、7.10 mg/100 mL,利于降壓肽呈現(xiàn)較高的ACE抑制活性[41]。酸性氨基酸含量最高,為35.78 mg/100 mL,與沙丁魚蛋白的研究(經(jīng)堿性蛋白酶處理獲得的降壓肽主要由酸性氨基酸組成)類似[42]。

表5 MW<3 KDa組分的氨基酸組成分析Table 5 Amino acid compositions of MW<3 kDa fraction

注:疏水性氨基酸為Ala、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Trp、Tyr、Val,芳香族氨基酸為Phe、Trp、Tyr,酸性氨基酸為Asp、Glu,堿性氨基酸為Arg、His、Lys。

2.7 分離組分的分子量分布分析

MW<3 KDa組分的分子量分布如圖10所示?？芍?400～1900、1900～2000、2000～2500、2500～2700、2700～3000、3000～4500 Da各部分比例分別為3.70%、3.60%、49.50%、21.50%、15.00%、4.5%,主要集中在2000～2500 Da部分,這與大豆降壓肽的研究結(jié)果相似[43]。

圖10 MW<3 kDa組分的分子量分布Fig.10 Molecular weight distribution of MW<3 kDa fraction

3 結(jié)論

本研究確定堿性蛋白酶來(lái)制備大蒜降壓肽,最佳制備工藝為酶解時(shí)間為1 h,溫度50 ℃,pH11,底物濃度45 g/L,酶底比3%,此時(shí)產(chǎn)物ACE抑制率為83.91%±0.13%,半抑制濃度為(157.87±0.44) μg/mL。通過測(cè)定比較不同組分的ACE抑制活性,定位降壓肽主要集中在分子量小于3 kDa的組分,對(duì)相應(yīng)的超濾工藝優(yōu)化后為:0.25 MPa的操作壓力,25 ℃的溫度,4%的溶液濃度,此時(shí)膜通量相對(duì)較高為7.32 L/(m2·h),IC50為(63.27±0.25) μg/mL,該組分的氨基酸分析表明天冬氨酸、谷氨酸含量及疏水性氨基酸、酸性氨基酸含量豐富,分子量分布顯示2000～2500 Da部分占比最高。通過該研究可以確定大蒜降壓肽的酶解制備工藝,有效定位大蒜降壓肽的分子量的范圍,同時(shí)為工業(yè)化生產(chǎn)大蒜降壓肽提供了技術(shù)參考。