Nrf-2/HO-1通路在糖尿病大鼠神經(jīng)病理性痛中的作用

劉康，趙博，周芳，謝恒韜，黎梅

糖尿病神經(jīng)病理性疼痛是糖尿病最常見的慢性并發(fā)癥之一，多以自發(fā)痛、誘發(fā)痛、痛覺過敏、痛覺超敏及異常性疼痛為特征[1,2]。其機(jī)制不清，尚無有效的治療。研究糖尿病神經(jīng)病理性痛的發(fā)病機(jī)制對(duì)于獲取更為有效的治療措施，降低糖尿病并發(fā)癥及死亡率，改善患者生存質(zhì)量，降低醫(yī)療成本，都具有重要的意義。核轉(zhuǎn)錄因子紅細(xì)胞系-2相關(guān)因子-2（nuclear factor erythroid-2 related factor-2，Nrf-2）信號(hào)通路作為對(duì)抗外來異物和氧化損傷的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，在機(jī)體各個(gè)系統(tǒng)的應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。在外界應(yīng)激下，Nrf-2通過誘導(dǎo)II相解毒酶的表達(dá)，激活血紅素氧合酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）、谷胱甘肽 S-移酶酶（glutathione S-transferase，GSTs）、谷氨酰半胱氨酸合成酶（glutamyl cysteine synthethase，GCS）等最終起到保護(hù)作用[3,4]。糖尿病神經(jīng)病理性痛中脊髓部位Nrf-2表達(dá)減少，穩(wěn)定性下降，Nrf-2依賴的抗氧化產(chǎn)物HO-1的表達(dá)亦減少[5]。進(jìn)而導(dǎo)致微環(huán)境異常，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的表型和結(jié)構(gòu)及功能狀態(tài)發(fā)生不可逆損傷，形成神經(jīng)痛的病理學(xué)基礎(chǔ)[6]。本研究擬觀察Nrf-2/HO-1通路在糖尿病神經(jīng)病理性痛中的作用。

1材料與方法

2結(jié)果

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

清潔級(jí)健康成年雄性SD大鼠24只，體質(zhì)量200～220 g，購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為3組，各8只：對(duì)照組（C組）、糖尿病組（D組）、糖尿病+Nrf-2激動(dòng)劑tBHQ組（DT組）。tBHQ（美國Selleck公司）為Nrf-2特異性激動(dòng)劑。腹腔注射1%鏈脲佐菌素-檸檬酸鹽緩沖液（美國Sigma公司）60 mg/kg，3 d后于尾靜脈采血檢測血糖，血糖≥16.7 mmol/L為大鼠糖尿病模型制備成功，飼養(yǎng)周期為6周。DT組于糖尿病模型制備成功后第3天，腹腔注射tBHQ 30 mg/kg至42 d。

與C組相比，D組MWT在2周后即明顯降低，MNCV在4周后明顯降低（均P＜0.05）。與D組相比，DT組MWT在2周后即高于D組，但仍低于C組（均P＜0.05）；MNCV在4周后高于D組，但仍低于C組（均P＜0.05）見表1。

1.2 指標(biāo)測定

1.2.1 機(jī)械痛閾（mechanical withdrawal threshold，MWT） 將大鼠置于底帶孔的有機(jī)玻璃籠中，分別于第2，4，6周采用Von Frey測痛儀（美國Stoelting公司）刺激大鼠后肢足底中部2 s，出現(xiàn)縮足反應(yīng)時(shí)計(jì)數(shù)。

1.2.2 坐骨神經(jīng)導(dǎo)速率（sciatic nerve conduction velocity，MNCV） 分別于第2，4，6周測定。將雙針電極置于大鼠右側(cè)坐骨切跡處，于同側(cè)踝關(guān)節(jié)坐骨神經(jīng)經(jīng)過部位和大鼠足趾第一骨間肌肉處分別放置雙針電極，測定大鼠MNCV。

1.2.3 病理結(jié)構(gòu)觀察 6周后每組取4只大鼠深麻醉下開胸，心尖部穿刺行主動(dòng)脈灌流，4%多聚甲醛灌注固定，取L4-6脊髓節(jié)段行Nissl染色，光鏡下（×400）觀察腓腸神經(jīng)病理學(xué)結(jié)果。取腓腸神經(jīng)，2.5%戊二醛固定后再用1%四氧化鋨固定，梯度丙酮脫水后，環(huán)氧樹脂包埋，制成超薄切片，醋酸雙氧鈾及檸檬酸鉛雙重染色，透射電鏡下觀察腓腸神經(jīng)超微結(jié)構(gòu)。

1.2.4 相關(guān)蛋白表達(dá)水平檢測 6周后每組余下4只大鼠處死后取L4-6脊髓，裂解液提取蛋白，測定蛋白濃度。電泳分離目的蛋白，轉(zhuǎn)膜后，脫脂奶粉室溫封閉。分別加入Nrf-2、HO-1抗體（1∶1000，美國CST公司），4℃孵育過夜。次日加二抗（1∶10000，美國LI-COR公司）孵育1 h后TBST清洗，掃膜后讀取灰度值，Odessay軟件進(jìn)行分析。目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參條帶灰度值的比值反映目的蛋白表達(dá)水平。

表1 3組大鼠MWT及MNCV比較（±s）

表1 3組大鼠MWT及MNCV比較（±s）

注：與C組比較，①P＜0.05；與D組比較，②P＜0.05

組別 只數(shù)MWT/g 2 w 4 w 6 w C組D組DT組88814.3±1.97.2±1.3①8.8±1.6①②13.3±2.05.2±1.2①8.2±1.4①②13.7±1.63.7±1.1①8.4±1.5①②組別C組D組DT組MNCV/(m/s)2 w 53.6±2.951.2±2.249.4±3.34 w 52.0±3.440.3±2.5①45.3±3.1①②6 w 52.2±3.535.2±2.8①44.6±3.2①②

脊髓Nissl染色顯示：C組神經(jīng)細(xì)胞排列較為均勻，細(xì)胞器結(jié)構(gòu)清晰；D組神經(jīng)細(xì)胞胞體縮小，排列松散，核周染色質(zhì)溶解伴局部水腫；DT組部分神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)大致正常，部分神經(jīng)細(xì)胞縮小，病理損傷較D組減輕，見圖1。

圖1 3組大鼠脊髓細(xì)胞Nissl染色（光學(xué)顯微鏡，×400）

腓腸神經(jīng)電鏡顯示：C組髓鞘排列均勻，軸突內(nèi)可見正常形態(tài)的線粒體；D組部分脫髓鞘明顯，排列局部紊亂，少部分軸突變性，Schwann細(xì)胞增生；DT組髓鞘排列均勻，局部排列紊亂，軸突內(nèi)可見正常形態(tài)線粒體，脫髓鞘程度輕微，見圖2。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0軟件處理數(shù)據(jù)。符合正態(tài)分布以及方差齊性的計(jì)量資料以（±s）表示，單因素方差分析；計(jì)數(shù)資料以率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖2 3組大鼠腓腸神經(jīng)電鏡結(jié)構(gòu)

與C組比較，D組和DT組的Nrf-2、HO-1表達(dá)均降低（均P＜0.05）；與D組比較，DT組Nrf-2、HO-1表達(dá)升高（均P＜0.05），見圖3，表2。

圖3 3組大鼠Nrf-2、HO-1蛋白western blot檢測條帶

表2 3組大鼠Nrf-2、HO-1蛋白表達(dá)水平比較（±s）

表2 3組大鼠Nrf-2、HO-1蛋白表達(dá)水平比較（±s）

注：與C組比較，①P＜0.05；與D組比較，②P＜0.05

組別C組D組DT組只數(shù)444 Nrf-2/GAPDH 1.00±0.000.56±0.11①0.77±0.09①②HO-1/GAPDH 1.00±0.000.47±0.13①0.82±0.11①②

3討論

本研究采用腹腔注射鏈脲佐菌素的方法制備大鼠糖尿病模型，飼養(yǎng)2周后通過檢測大鼠MWT確定糖尿病神經(jīng)病理性痛模型制備成功。應(yīng)用作為金標(biāo)準(zhǔn)的脊髓Nissl染色及腓腸神經(jīng)電鏡均從細(xì)胞結(jié)構(gòu)進(jìn)一步證實(shí)模型制備成功。

HO-1是重要的內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激機(jī)制，激活HO-1對(duì)抗機(jī)體氧化損傷是目前的研究熱點(diǎn)[7]。研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用HO-1激動(dòng)劑可提高組織中HO-1活性，有效減輕糖尿病神經(jīng)病理性痛。HO-1在糖尿病狀態(tài)下呈不穩(wěn)定狀態(tài)，這可能與糖尿病狀態(tài)下HO-1上級(jí)信號(hào)通路調(diào)控相關(guān)[8]。糖尿病可以激活機(jī)體內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激蛋白Nrf-2的表達(dá)進(jìn)而激活抗氧化反應(yīng)元件，發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用[9]。當(dāng)遇到高血糖和氧自由基刺激時(shí)Nrf-2磷酸化，活化的Nrf-2進(jìn)入細(xì)胞核，與小Maf蛋白（small Maf proteins，Maf）結(jié)合成異二聚體，調(diào)節(jié)下游抗氧化蛋白HO-1的表達(dá)，提高細(xì)胞抗氧化應(yīng)激的能力[10]。因此，Nrf2/HO-1信號(hào)通路的激活對(duì)緩解糖尿病神經(jīng)病理性痛起到了關(guān)鍵性作用。

本研究結(jié)果表明，糖尿病大鼠神經(jīng)病理性痛脊神經(jīng)中Nrf-2、HO-1表達(dá)降低，同時(shí)MWT、MNCV降低，病理損傷嚴(yán)重。當(dāng)給予Nrf-2激動(dòng)劑后，Nrf-2、HO-1表達(dá)升高，同時(shí)伴有MWT、MNCV升高，病理學(xué)損傷減輕。提示Nrf-2/HO-1通路的激活減輕了糖尿病神經(jīng)病理性疼痛。

高血糖可引起脊髓膠質(zhì)細(xì)胞活化，活化后的膠質(zhì)細(xì)胞通過釋放促炎癥細(xì)胞因子引起神經(jīng)性疼痛，導(dǎo)致大鼠MWT和MNCV的降低[11]。本研究結(jié)果表明，糖尿病大鼠MWT和MNCV降低，且隨著糖尿病病程的進(jìn)展，MWT和MNCV進(jìn)一步降低。在給予Nrf-2激動(dòng)劑后，大鼠痛閾值和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)傳導(dǎo)速度升高。提示糖尿病大鼠神經(jīng)病理性疼痛的機(jī)制可能與Nrf-2/HO-1通路的激活有關(guān)。

綜上所述，Nrf-2/HO-1通路參與了糖尿病大鼠神經(jīng)病理性疼痛的進(jìn)展，激活Nrf-2的表達(dá)可能是減輕糖尿病大鼠神經(jīng)病理性疼痛的有效方法之一。