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    小地老虎不同組織表達(dá)差異揭示其翅發(fā)育機(jī)制

    2019-10-24 09:11:12鄭偉剛靳明輝SwapanChakrabarty肖彬蕭玉濤袁海濱
    生物技術(shù)通報(bào) 2019年10期
    關(guān)鍵詞:差異基因胸部成蟲

    鄭偉剛 靳明輝 Swapan Chakrabarty 肖彬 蕭玉濤 袁海濱

    (1. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院,長春 130118;2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)基因組研究所,深圳 518120)

    小地老虎(Agrotis ipsilon)、棉鈴蟲(Helicoverpa armigera)、帝王蝶、黏蟲(Mythimna separata)、稻飛虱(Nilaparvata lugens)、玉米螟(Ostriniafurnacalis、Ostrinia nubilalis)及東亞飛蝗(Locusta migratoria manilensis(Meyen))等都屬于遷飛性昆蟲[1-6]。遷飛是動物種群對棲息地資源發(fā)生季節(jié)性或偶然性變化時(shí)進(jìn)化出的一種適應(yīng)性對策,昆蟲的遷飛行為嚴(yán)重影響人類的生產(chǎn)和生活,如危害農(nóng)作物,造成農(nóng)作物大量減產(chǎn)、傳播人和牲畜的疾病等。影響昆蟲遷飛的因素眾多,包括生存環(huán)境、激素調(diào)控、遺傳因素等,而翅發(fā)育是昆蟲遷飛的一個(gè)重要影響因素。昆蟲翅膀的進(jìn)化對昆蟲覓食、求偶、避敵、抵御外界不良環(huán)境等起到重要作用[7-8]。隨著果蠅等模式昆蟲的深入研究,一系列與翅發(fā)育有關(guān)的信號通路逐漸被揭示出來,如Wnt、Hedgehog、Decapentaplegic(Dpp)、Hippo和 c-Jun N-terminal Kinase(JNK)等信號通路,其中Wnt通路是昆蟲翅發(fā)育的關(guān)鍵信號通路。

    Wnt信號通路包含3種Wnt信號傳導(dǎo)通路:經(jīng)典Wnt通路,非經(jīng)典Wnt /鈣通路以及非經(jīng)典planar cell polarity通路[9-11],這 3種途徑都是通過Wnt蛋白配體與Frizzled(Fz)家族受體結(jié)合而激活的。經(jīng)典Wnt通路引起基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié),并且被認(rèn)為部分地被SPATS1基因負(fù)調(diào)節(jié)[11]。非經(jīng)典planar cell polarity通路調(diào)控細(xì)胞骨架,骨架決定細(xì)胞的形狀。非經(jīng)典Wnt /鈣通路,調(diào)控細(xì)胞內(nèi)的鈣。Decapentaplegic(Dpp)信號通路中,Dpp是參與果蠅發(fā)育的關(guān)鍵形態(tài)發(fā)生素,也是第一個(gè)經(jīng)過驗(yàn)證的分泌形態(tài)發(fā)生素[12-13]。早期果蠅胚胎和15個(gè)成蟲器的正確形成和發(fā)育需要Dpp調(diào)控,這些組織將生長發(fā)育為成年果蠅中的四肢和其他器官和結(jié)構(gòu)。DPP在調(diào)節(jié)組織的生長和器官組織大小方面起著重要的作用[12,14]。Hedgehog(Hh)信號通路在控制細(xì)胞增殖、組織模式形成、干細(xì)胞維持和發(fā)育方面發(fā)揮著多種作用[15-18]。Hedgehog信號通路是一種向胚胎細(xì)胞傳遞信息的信號通路,這些信息是胚胎細(xì)胞分化所必需的。胚胎的不同部位具有不同濃度的Hedgehog基因信號蛋白。該通路在成蟲個(gè)體中也有作用。Hippo信號通路也被稱為Salvador或者Warts通路,通過調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡來控制動物的器官大小。該通路的名字來源于它的一個(gè)關(guān)鍵信號元件——蛋白激酶Hippo(Hpo)[19-20]。該基因的突變導(dǎo)致組織過度生長,或類似“河馬”表型。

    小地老虎(Agrotis ipsilon)又名切根蟲、土蠶等,屬于一種世界性的鱗翅目夜蛾科農(nóng)業(yè)害蟲[5,21],也是典型的遷飛性農(nóng)業(yè)害蟲。由于翅是在成蟲階段發(fā)育形成,且屬于昆蟲胸部的組成部分,本試驗(yàn)對小地老虎幼蟲,成蟲頭部、胸部、腹部和進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序,探究可能決定小地老虎翅發(fā)育的關(guān)鍵通路及相關(guān)基因[22-23]。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    小地老虎幼蟲主要來源于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)基因組研究所農(nóng)業(yè)生態(tài)基因組學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室,小地老虎成蟲主要來源于山東長島野外采集。

    1.2 方法

    1.2.1 小地老虎總RNA的提取、文庫構(gòu)建和測序 小地老虎幼蟲6頭作為一個(gè)重復(fù),共取18頭做3組幼蟲整蟲轉(zhuǎn)錄組Ya、Yb、Yc的組織材料,為避免腸道微生物污染,幼蟲整蟲解剖去除圍食膜,再用液氮研磨。小地老虎成蟲每6頭作為一個(gè)重復(fù),分別取頭、胸、腹,做頭(Ta、Tb、Tc)、胸(Xa、Xb、Xc)、腹(Fa、Fb、Fc)轉(zhuǎn)錄組材料。

    取烘干研缽,加入少量乙醇,灼燒防止研缽內(nèi)殘留其他物質(zhì)。待研缽烘干后,加入液氮,將組織樣品加入研缽中研磨至粉狀,取適量放入裝有1 mL TRIzol的RNAase free 1.5 mL離心管中。通常情況下,1 mL TRIzol Reagent 能夠裂解50-100 mg組織樣品。

    向樣品中加入0.2 mL氯仿(每1 mL TRIzol加0.2 mL氯仿)后,用手輕輕搖動15 s左右,使其混合并于常溫孵育2-3 min,然后將樣品于12 000 r/min、4℃條件下進(jìn)行離心15 min。將離心管傾斜為45°并用移液器將水相吸出,然后移入新的離心管,在此過程中應(yīng)盡量避免吸入混合相或者有機(jī)層。取0.5mL 異丙醇(每1 mL TRIzol對應(yīng)0.5 mL異丙醇)加入之前移出的水相樣品中,常溫孵育10 min后在4℃、12 000 r/min條件下,離心10 min,倒掉上清液并留下RNA沉淀。加入1 mL 75%酒精(每1 mL的 TRIzol至少加1 mL的75%乙醇),輕微震蕩混勻后在4℃、7 500 r/min條件下離心5 min,倒掉上清液,只留底部沉淀。風(fēng)干RNA沉淀5-10 min,禁止真空離心RNA沉淀。加入0.02-0.05 mL無核酸酶水,使用移液器反復(fù)吸打,然后在55-60℃條件下水浴10-15 min,使RNA沉淀溶解,將得到的RNA溶液于-80℃條件下長期保存。

    利用 Nanodrop2000 對根據(jù)上述步驟提取出的total RNA,檢測其濃度和純度,利用瓊脂糖凝膠電泳檢測 RNA 完整性,使用Agilent 2100 測定total RNA RIN 值。單次建庫要求RNA 總量 5 μg,濃度≥ 200 μg/mL,OD260/OD2280介于 1.8-2.2 之間。利用Illumina公司的TruSeqTMRNA sample preparation kit完成cDNA文庫的構(gòu)建,并通過Illumina Hiseq 測序平臺的150 paired-end模式進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。

    1.2.2 轉(zhuǎn)錄組組裝和ORF預(yù)測 對于無參考基因組的轉(zhuǎn)錄組測序和相關(guān)研究,獲得RNA-seq高質(zhì)量測序數(shù)據(jù)后,需要將測序數(shù)據(jù)進(jìn)行組裝,才能進(jìn)行后續(xù)注釋及其他生物學(xué)功能分析。Trinity(http://trinityrnaseq.sourceforge.net/,版本號 :v2.6.6)是目前從頭組裝Illumina 短片段序列比較常用的軟件,本試驗(yàn)在對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾接頭和低質(zhì)量數(shù)據(jù)后,使用Trinity進(jìn)行從頭組裝。使用TransDecoder(https://github.com/TransDecoder/TransDecoder,版本號:5.5.0)軟件識別轉(zhuǎn)錄本序列中候選的編碼區(qū)域,結(jié)合 cd-hit(http://weizhongli-lab.org/cd-hit/,版本號:v4.8.1)進(jìn)行去冗余,得到獨(dú)立基因(Unigene)序列。

    1.2.3 轉(zhuǎn)錄組功能注釋 使用Trinity軟件組裝得到轉(zhuǎn)錄本序列后,要對生物學(xué)相關(guān)問題進(jìn)行探究,就要對這些轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行功能注釋。將拼接所得所有(unigene)序列,使用Interperscan(http://www.ebi.ac.uk/interpro/,版本號:v5)進(jìn)行結(jié)構(gòu)域預(yù)測,使用 Blastp(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)分別與KEGG、eggNOG、NR、Trembl、Swissprot、數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對獲得相應(yīng)的功能注釋信息,然后進(jìn)行KEGG通路富集分析。KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,京都基因和基因組百科全書,http://www.genome.jp/kegg/)是基因組注釋方面的公共數(shù)據(jù)庫。KEGG數(shù)據(jù)庫中豐富的通路信息將有助于我們從系統(tǒng)水平去了解基因的生物學(xué)功能,例如代謝途徑、遺傳信息傳遞以及細(xì)胞過程等一些復(fù)雜的生物功能,這大大提高了該數(shù)據(jù)庫在實(shí)際生產(chǎn)和應(yīng)用中的價(jià)值。根據(jù)與KEGG數(shù)據(jù)庫比對結(jié)果,獲得轉(zhuǎn)錄本對應(yīng)的KO編號,根據(jù)KO編號可以獲得某轉(zhuǎn)錄本可能參與的具體生物學(xué)通路。eggNOG(evolutionary genealogy of genes:Non-supervised Orthologous Groups)數(shù)據(jù)庫包含了豐富的注釋信息,包含了KEGG等數(shù)據(jù)庫信息。Swiss-Prot是一個(gè)手工注釋的非冗余蛋白序列數(shù)據(jù)庫。它結(jié)合了從科學(xué)文獻(xiàn)中提取的信息和生物尿酸評估計(jì)算分析,TrEMBL(翻譯的EMBL核苷酸序列數(shù)據(jù)庫),為那些不在Swiss-Prot中的蛋白質(zhì)提供自動注釋。NR(NCBI 非冗余蛋白庫)為綜合數(shù)據(jù)庫,包括了SwissProt、PIR(Protein information resource)、PRF(Protein research foundation)、PDB(Protein data bank)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中非冗余的數(shù)據(jù)以及從GenBank和RefSeq的CDS數(shù)據(jù)庫中翻譯所得的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)。

    1.2.4 差異表達(dá)基因分析 使用組裝軟件將轉(zhuǎn)錄組組裝好后,利用RSEM(http://deweylab.biostat.wisc.edu/rsem/)進(jìn)行表達(dá)量分析。RSEM利用bowtie的比對結(jié)果進(jìn)行表達(dá)量統(tǒng)計(jì),首先得到每個(gè)樣品比對到每個(gè)基因上的read count數(shù)目,然后對其進(jìn)行TPM數(shù)值轉(zhuǎn)換,TPM數(shù)值可以反映基因的表達(dá)水平。使用R包(edgeR和DESeq)分別對小地老虎轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行基因表達(dá)差異分析,取兩者交集,得到最終差異基因。

    2 結(jié)果

    2.1 原始測序數(shù)據(jù)質(zhì)控

    測序小地老虎幼蟲,成蟲頭、胸和腹部,各3個(gè)樣本,共計(jì)12個(gè)樣本。小地老虎幼蟲共測數(shù)據(jù)19.59 G,小地老虎成蟲頭部20.73 G,小地老虎成蟲胸部21.36 G,小地老虎成蟲腹部21.32 G,共計(jì)數(shù)據(jù)量82.99 G,質(zhì)控去掉Adapter和低于Q20的數(shù)據(jù)后最終得到78.67 G(表1)。

    2.2 轉(zhuǎn)錄組組裝和ORF預(yù)測

    使用 Trinity(http://trinityrnaseq.sourceforge.net/)軟件,對小地老虎轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行組裝。最終組裝得到轉(zhuǎn)錄組243.4 M,最長序列27.4 K,平均長度0.6 K,N50 0.7 K,denove轉(zhuǎn)錄組組裝結(jié)果GC含量為39.66%(表2)。使用TransDecoder對轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行ORF 預(yù)測,并去冗余后,得到37 744個(gè)unigenes。轉(zhuǎn)錄組組裝長度頻數(shù)分布(圖1),圖1-A為轉(zhuǎn)錄本(Transcripts)組裝長度頻數(shù)分布,在200-500范圍內(nèi)的轉(zhuǎn)錄本比例最多,為67.59%,其次為在500-1 000范圍內(nèi)的轉(zhuǎn)錄本比例為22.03%。圖1-B為Unigenes組裝長度頻數(shù)分布,在500-1 000范圍內(nèi)的轉(zhuǎn)錄本比例最多,為33.83%,其次為在200-500范圍內(nèi)的比例為30.29%。

    表1 小地老虎轉(zhuǎn)錄組測序原始數(shù)據(jù)及質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

    表2 轉(zhuǎn)錄組denovo組裝結(jié)果統(tǒng)計(jì)

    2.3 小地老虎轉(zhuǎn)錄組功能注釋

    使用Interperscan進(jìn)行結(jié)構(gòu)域預(yù)測,共有20 522個(gè)unigenes預(yù)測出結(jié)構(gòu)域信息。將拼接所得獨(dú)立基因,使用Blastp分別與NR、Sport、Trembl、KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對,比對后取besthit獲得相應(yīng)的注釋信息。

    KEGG 數(shù)據(jù)庫注釋功能基因23 334個(gè),注釋通路373條,KO 6 161個(gè);eggNOG 數(shù)據(jù)路注釋功能基因31 556個(gè),Orthologous Groups(OG,同源群)8 211個(gè);Nr 數(shù)據(jù)庫共注釋功能基因29 971個(gè);Swissprot 數(shù)據(jù)庫注釋功能基因本21 538個(gè);Trembl數(shù)據(jù)庫注釋功能基因32 354個(gè)。各個(gè)數(shù)據(jù)庫功能注釋Venn圖(圖2),其中5個(gè)數(shù)據(jù)庫能夠共同注釋到的基因有18 345個(gè)。5個(gè)數(shù)據(jù)庫分別注釋出了本數(shù)據(jù)庫特有基因,其中Trembl數(shù)據(jù)庫注釋出的特有基因最多,為426個(gè),KEGG數(shù)據(jù)庫注釋出的特有基因最少,有15個(gè)(圖2)。

    圖1 轉(zhuǎn)錄組組裝長度頻數(shù)分布

    2.4 小地老虎轉(zhuǎn)錄組表達(dá)差異分析

    分別使用EdgeR.R和DEseq2.R 進(jìn)行差異分析,并求出差異基因。再將兩種方法得到的差異基因求交集,得到最終的差異基因(圖3)。最終得到小地老虎成蟲頭部樣本與小地老虎胸部樣本轉(zhuǎn)錄組差異基因4 069個(gè),小地老虎成蟲胸部樣本與小地老虎腹部樣本轉(zhuǎn)錄組差異基因6 905個(gè),小地老虎成蟲腹部樣本與小地老虎頭部樣本轉(zhuǎn)錄組差異基因7 777個(gè),小地老虎幼蟲與小地老虎成蟲頭部樣轉(zhuǎn)錄組差異基因5 768個(gè),小地老虎幼蟲與小地老虎成蟲胸部樣轉(zhuǎn)錄組差異基因4 836個(gè),小地老虎幼蟲與小地老虎成蟲腹部樣轉(zhuǎn)錄組差異基因8 917個(gè)。小地老虎成蟲頭部與腹部差異基因最多,小地老虎成蟲頭部與胸部差異基因最少。小地老虎幼蟲與成蟲頭、胸、腹三部分相比,小地老虎幼蟲與成蟲腹部的差異基因最多,與胸部的差異基因最少(圖3)。

    圖2 轉(zhuǎn)錄組不同數(shù)據(jù)庫注釋結(jié)果Venn圖

    圖3 各組樣本DESeq2與EdegR基因差異表達(dá)火山圖和差異基因Venn圖

    通過對小地老虎轉(zhuǎn)錄組KEGG通路富集分析,結(jié)合Interperscan結(jié)構(gòu)域預(yù)測和其他注釋信息得到小地老虎翅發(fā)育機(jī)制相關(guān)通路基因,并進(jìn)行表達(dá)量分析與表達(dá)量差異比較分析,對差異表達(dá)基因繪制小地老虎Wnt信號通路基因表達(dá)熱圖(圖4);并根據(jù)KEGG通路差異基因富集分析繪制小地老虎Wnt信號通路基因圖(圖5)。由小地老虎Wnt相關(guān)基因KEGG通路基因富集分析和表達(dá)量差異比較分析可知,Notum、Frizzled、CaN等53個(gè)元件均被注釋出,但是PRP、GBp、ICAT等17個(gè)元件沒有在小地老虎轉(zhuǎn)錄組中發(fā)現(xiàn)(圖4-5)。Wnt信號通路包含經(jīng)典Wnt通路,非經(jīng)典Wnt /鈣通路以及非經(jīng)典planar cell polarity通路,其中非經(jīng)典Wnt /鈣通路以及非經(jīng)典planar cell polarity通路總基因數(shù)目較少,但是在小地老虎轉(zhuǎn)錄組中注釋出的基因較多,非經(jīng)典Wnt/鈣通路只有一個(gè)元件未注釋出,非經(jīng)典planar cell polarity通路只有兩個(gè)元件未注釋出;非經(jīng)典Wnt /鈣通路,調(diào)控細(xì)胞內(nèi)的鈣,非經(jīng)典planar cell polarity通路調(diào)控細(xì)胞骨架,骨架決定細(xì)胞的形狀。

    圖4 小地老虎Wnt信號通路基因表達(dá)熱圖

    小地老虎胸部組織與頭部組織相比,F(xiàn)rizzled(Fz)、BMP and activin membrane-bound inhibitor(BAMBI)、(CKIα)、casein kinase 1(CKIε)、Axin、Myc proto-oncogene protein(c-myc)、E3 ubiquitinprotein ligase(Siah-1)、glypican 4(Knypek)、serine/threonine-protein phosphatase 2B catalytic subunit(CaN)、cullin 1(Cul1)等在小地老虎胸部組織中都上調(diào)表達(dá),Notum、calcyclin binding protein(SIP)、classical protein kinase C alpha type(PKC)在胸部組織中下調(diào)表達(dá)。小地老虎胸部組織與腹部組織相比,Notum、Dally、Siah-1、CaN等在小地老虎胸部組織中都上調(diào)表達(dá),wingless-type MMTV integration site family、Frizzled、Rac等在小地老虎胸部組織中下調(diào)表達(dá)。小地老虎胸部組織與小地老虎幼蟲組織相比,F(xiàn)rizzled、Dally、SIP、Cul1、Siah-1等上調(diào)表達(dá),Rac、phosphatidylinositol phospholipase C beta(PLC)、Frizzled等下調(diào)表達(dá)(圖5)。

    小地老虎胸部組織相對于頭部、腹部及幼蟲組織,只有Siah-1和CaN全部上調(diào)表達(dá),Notum雖然在小地老虎胸部組織相對于頭部、幼蟲對比中上調(diào)表達(dá),但在小地老虎胸部組織相對腹部組織中下調(diào)表達(dá)。SIP同時(shí)在小地老虎胸部相對于頭部和腹部比較中下調(diào)表達(dá)。

    非經(jīng)典planar cell polarity通路中,小地老虎胸部相對于頭部有表達(dá)差異的基因全部為表達(dá)上調(diào),小地老虎胸部相對于腹部有表達(dá)差異的基因全部為表達(dá)下調(diào)。非經(jīng)典planar cell polarity通路中,PLC在小地老虎胸部相對于頭部和幼蟲的基因表達(dá)中均為下調(diào),下游元件CaN表現(xiàn)為表達(dá)上調(diào)。

    圖5 小地老虎Wnt信號通路基因圖

    3 討 論

    Wnt信號通路相關(guān)基因在小地老虎幼蟲、小地老虎成蟲頭、胸、腹部均有表達(dá)。Wnt信號通路包含3種Wnt信號傳導(dǎo)通路:經(jīng)典Wnt通路,非經(jīng)典Wnt /鈣通路以及非經(jīng)典planar cell polarity通路。非經(jīng)典planar cell polarity通路是通過Wnt與Fz及其共受體結(jié)合而激活的。然后受體結(jié)合Dishevelled(Dsh),Dsh利用其PDZ和DIX結(jié)構(gòu)域與morphogenesis 1(Daam1)的Dishevelled-associated激活因子1形成復(fù)合物。然后Daam1通過鳥嘌呤交換因子激活G-蛋白Rho[24]。Rho激活Rho相關(guān)激酶Rho-associated kinase(ROCK),這是細(xì)胞骨架的主要調(diào)節(jié)因子之一。Dsh還與Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1(Rac1)形成復(fù)合物,并介導(dǎo)profilin與肌動蛋白的結(jié)合[25]。Rac1激活JNK,也可導(dǎo)致肌動蛋白聚合。丙氨酸與肌動蛋白結(jié)合可導(dǎo)致細(xì)胞骨架和原腸胚的重組。經(jīng)典Wnt通路相關(guān)基因有一些在小地老虎轉(zhuǎn)錄組中未被注釋到,這可能與小地老虎的發(fā)育有關(guān),有些基因沒有表達(dá),也有可能與物種有關(guān),小地老虎可能不含有某些基因。同時(shí)這些在小地老虎腹部表達(dá)的基因可能參與一些基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控,這也是此信號通路的主要功能。

    Wnt信號通路相關(guān)基因在小地老虎幼蟲和成蟲不同組織表達(dá)差異揭示小地老虎可能的翅發(fā)育機(jī)制,非經(jīng)典planar cell polarity通路調(diào)控細(xì)胞骨架,決定骨架細(xì)胞的形狀,Rac在小地老虎腹部相對小地老虎胸部上調(diào)表達(dá),Rac也能間接影響JNK,從而影響一些基因的轉(zhuǎn)錄。非經(jīng)典Wnt /鈣通路中,小地老虎胸部相對于頭部、腹部和小地老虎幼蟲,CaN、Siah-1都表現(xiàn)為上調(diào)表達(dá),CaN在肌肉形成和功能的基本過程中起著重要的作用[26],因此小地老虎成蟲胸部CaN的表達(dá)可能與其肌肉功能有關(guān)。本次試驗(yàn)的小地老虎成蟲為處于遷飛狀態(tài)的小地老虎成蟲,胸部肌肉相關(guān)基因表達(dá)較高與其生物性狀相適應(yīng)。

    Wnt信號通路相關(guān)基因在小地老虎幼蟲、成蟲頭、胸、腹部的表達(dá)存在差異,小地老虎胸部組織與頭部組織、腹部組織和小地老虎幼蟲組織相比,CaN、Siah-1相關(guān)基因都顯著上調(diào)表達(dá)。這些基因有可能在其他昆蟲中也會有類似現(xiàn)象。對于昆蟲翅發(fā)育相關(guān)基因的研究主要集中于昆蟲羽化之前,本試驗(yàn)表明,在昆蟲羽化后一些翅發(fā)育相關(guān)基因會繼續(xù)在成蟲胸部表達(dá),也可能與翅部肌肉等組織的發(fā)育和代謝有關(guān)。這些對于昆蟲或者對于遷飛昆蟲的研究可能提供一些研究思路。近年來,隨著illumina、pacbio、nonapore等高通量測序技術(shù)的迅猛發(fā)展,以及CRISPR-Cas9技術(shù)的不斷發(fā)展,越來越多的科學(xué)問題通過基因組測序成功解決,也為研究昆蟲遷飛相關(guān)基因功能解析提供了新的技術(shù)方法[27]。

    另外,影響昆蟲翅發(fā)育相關(guān)通路還有Decapentaplegic(Dpp)、Hedgehog、Hippo信號通路等。Dpp是參與果蠅發(fā)育的關(guān)鍵形態(tài)發(fā)生素,Dpp也是第一個(gè)經(jīng)過驗(yàn)證的分泌形態(tài)發(fā)生素[12-13]。Hedgehog(Hh)信號通路在控制細(xì)胞增殖、組織模式形成、干細(xì)胞維持和發(fā)育方面發(fā)揮著多種作用[15-18]。Hippo信號通路也被稱為Salvador或者Warts通路,通過調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡來控制動物的器官大小。該通路的名字來源于它的一個(gè)關(guān)鍵信號元件——蛋白激酶Hippo(Hpo)[19-20]。該基因的突變導(dǎo)致組織過度生長,或類似“河馬”表型。

    昆蟲翅的進(jìn)化對昆蟲的意義重大,探究影響昆蟲翅生長發(fā)育的相關(guān)通路,有助于了解昆蟲翅的進(jìn)化及發(fā)育的過程。在眾多的昆蟲中,有相當(dāng)一部分為農(nóng)業(yè)害蟲,有些如棉鈴蟲、小地老虎等還是可進(jìn)行遷飛的害蟲,探究昆蟲翅的發(fā)育機(jī)制,可以為揭開昆蟲遷飛面紗并研發(fā)新型防治農(nóng)業(yè)害蟲方法提供幫助。本研究通過對小地老虎轉(zhuǎn)錄組的組裝及注釋,結(jié)合影響果蠅翅發(fā)育相關(guān)通路基因,找到許多潛在與小地老虎翅發(fā)育相關(guān)通路基因,為后續(xù)研究小地老虎翅發(fā)育相關(guān)基因提供了良好的基礎(chǔ)。

    4 結(jié)論

    通過對小地老虎轉(zhuǎn)錄組的組裝及注釋,最終組裝得到轉(zhuǎn)錄組243.4 Mb,組裝出轉(zhuǎn)錄本429 288個(gè),獨(dú)立基因37 744個(gè)。小地老虎Wnt相關(guān)通路中,Notum、Frizzled、CaN等53個(gè)相關(guān)元件被注釋出。Wnt信號通路中的非經(jīng)典planar cell polarity通路中,PlC在小地老虎胸部相對于頭部和幼蟲的基因表達(dá)中均為下調(diào),下游元件CaN、Siah-1在小地老虎胸部相對于頭部、腹部及幼蟲組織的基因表達(dá)中均表現(xiàn)為表達(dá)上調(diào),可能與其肌肉功能有關(guān)。

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