納豆激酶豆乳液體發(fā)酵條件優(yōu)化

倪楠 辛志宏 許斌 張麗靜 王艷 江均平 王鳳忠 李淑英

（1. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；2. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，南京 210095）

血栓對(duì)人體健康存在極大威脅，其由不溶性纖維蛋白、沉積的血小板、積聚的白細(xì)胞和陷入的紅細(xì)胞組成。目前為止，納豆激酶（Nattotkinase）是微生物中唯一的纖維蛋白溶解酶［1］，它可預(yù)防血栓形成，還能抗高血壓和動(dòng)脈粥樣硬化［2］。將它與野櫻莓、紅參和經(jīng)紫外線照射的香菇復(fù)配，復(fù)合產(chǎn)物具有消炎和抗氧化作用，從而能改善胰島素分泌，緩解2型糖尿病癥狀及其并發(fā)癥［3］。除了溶栓能力外，最近的研究表明納豆激酶也可能對(duì)平滑肌活動(dòng)有神經(jīng)保護(hù)作用，對(duì)阿爾茨海默癥［4］、低血壓和玻璃體視網(wǎng)膜疾病的治療也具有潛在的作用［5］。

當(dāng)前市面上納豆激酶的主要來源是鮮納豆，在納豆的深加工方面，納豆激酶軟糖、壓片糖果和膠囊等產(chǎn)品相繼出現(xiàn)［6］。藥品方面，由于納豆激酶分離純化工藝還不完善，納豆激酶針劑的生產(chǎn)還處于探索階段［7］。隨著人們對(duì)納豆激酶認(rèn)識(shí)的深入和需求量的增加，如何提高產(chǎn)酶量并實(shí)現(xiàn)規(guī)模化生產(chǎn)是納豆激酶產(chǎn)業(yè)化首先需要考慮的問題，同時(shí)也需要尋找降低成本的方法。提高生產(chǎn)菌種產(chǎn)酶方面的研究相對(duì)較多，包括高產(chǎn)菌種篩選［8］、誘變［9］、培養(yǎng)基［10］和發(fā)酵條件優(yōu)化［11］等。相對(duì)于傳統(tǒng)固體納豆發(fā)酵而言，液體發(fā)酵生產(chǎn)納豆激酶在工藝上更可控［12］，易實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)，且更利于進(jìn)一步富集純化納豆激酶。如今應(yīng)用液體發(fā)酵工藝生產(chǎn)納豆激酶已成為趨勢，發(fā)酵原料從最初的化學(xué)試劑，逐漸過渡到純天然食品原料［13-14］和加工副產(chǎn)物［15-17］等。以谷物、豆類或其加工副產(chǎn)物等作為發(fā)酵原料既能減少生產(chǎn)成本，同時(shí)也能借助發(fā)酵原料本身具備的營養(yǎng)成分，使發(fā)酵產(chǎn)物的營養(yǎng)價(jià)值更多樣，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行發(fā)酵條件的優(yōu)化是不錯(cuò)的選擇。

本試驗(yàn)的目的在于彌補(bǔ)前期優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的不足。在前期優(yōu)化中［18］，單因素水平間距較小，結(jié)果中能反應(yīng)的問題較局限且最優(yōu)條件不夠明顯，因此本研究在前期優(yōu)化的基礎(chǔ)上對(duì)因素順序及因素水平稍作調(diào)整，同樣以大豆為原料，制備的豆乳為發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行液體發(fā)酵工藝優(yōu)化。運(yùn)用單因素和正交試驗(yàn)對(duì)發(fā)酵時(shí)間、裝液量、初始pH和接菌量進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳工藝參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 大豆，市售；納豆枯草芽孢桿菌，實(shí)驗(yàn)室篩選［19］。

1.1.2 試劑 尿激酶（10 000 IU/mg，10 mg）、凝血酶（1 000 U）纖維蛋白原（1.0 g），均為Sigma公司產(chǎn)品；蛋白胨、酵母提取物，均為英國Oxoid公司產(chǎn)品；氯化鈉、瓊脂粉等，均購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備 電子分析天平（AL204），梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；pH計(jì)（FE28），梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；生化培養(yǎng)箱（LRH-250），上海一恒科學(xué)儀器有限公司；超凈工作臺(tái)（ZHJH-011128），上海智城分析儀器制造有限公司；離心機(jī)（3K15），曦瑪離心機(jī)（揚(yáng)州）有限公司；生化培養(yǎng)箱（LRH-250），常州中成儀器制造；高壓滅菌鍋（GI36T），致微（廈門）儀器有限公司；恒溫?fù)u床（RH-QA），常州中誠儀器制造有限公司；豆?jié){機(jī)（RD-808T），合肥榮事達(dá)小家電有限公司。

1.2 方法

1.2.1 制作工藝

1.2.1.1 菌種活化 將 -80℃保存的納豆枯草芽孢桿菌轉(zhuǎn)接至LB平板培養(yǎng)基，37℃恒溫培養(yǎng)12 h 備用。

1.2.1.2 種子液培養(yǎng) 挑取種子1環(huán)轉(zhuǎn)接入裝有 20mL 液體 LB 培養(yǎng)基（50 mL 三角瓶），37℃、200 r/min，搖床恒溫培養(yǎng)12 h，取1 mL轉(zhuǎn)接至裝有 100 mL 液體LB培養(yǎng)基（250 mL 三角瓶），37℃、200 r/min，搖床恒溫培養(yǎng)12 h備用。

1.2.1.3 發(fā)酵豆乳制作工藝流程 大豆清洗→浸泡（40℃水浴6 h）→瀝干加水煮制豆乳（豆水比1∶8）→接種（菌液）→發(fā)酵。

1.2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.2.1 單因素試驗(yàn) 采用單因素試驗(yàn)對(duì)發(fā)酵時(shí)間、裝液量、初始pH及接菌量4個(gè)因素進(jìn)行研究，發(fā)酵時(shí)間設(shè)為 12、24、36、48、60、72、84、96和108 h 共9個(gè)水平，裝液量設(shè)為50 mL/500 mL、100mL/500 mL、150 mL/500 mL、200 mL/500 mL、250 mL/500 mL共5個(gè)水平，初始pH設(shè)為2、4、6、8、10 共5個(gè)水平，接菌量設(shè)為1%、2%、3%、4%和5%共5個(gè)水平。每個(gè)處理重復(fù)3次，取平均值。

1.2.2.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以納豆激酶活力作為功能評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用四因素三水平L9（34）正交試驗(yàn)對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，每個(gè)試驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)。正交試驗(yàn)表見表 1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

1.2.3 測定方法

1.2.3.1 樣品制備 取發(fā)酵豆乳樣品15 mL，9 500r/min離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)入空的離心管中。沉淀和上清儲(chǔ)存于4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3.2 尿激酶標(biāo)準(zhǔn)曲線 本試驗(yàn)應(yīng)用的瓊脂糖-纖維蛋白平板法檢測納豆激酶活力，具體方法參見Astrup［20］稍作改進(jìn)，具體如下：稱取1 g瓊脂加到250 mL三角瓶中，量取100 mL PBS（10 mmol/L pH7.2）緩沖液溶解瓊脂，置于微波爐中加熱溶解；待瓊脂冷卻至50℃時(shí)取25 mL于滅菌的離心管中，向離心管中加入800 μL 50 mg/mL的纖維蛋白原溶液及120 μL 10 U/mL的凝血酶，混合均勻后迅速倒入平皿中；37℃生化培養(yǎng)箱反應(yīng)105 min，以形成纖維蛋白凝塊。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：參照奚曉琦［21］的方法。用打孔器打孔，將尿激酶樣品（1 562.5 IU/mL、3 125 IU/mL、6 250 IU/mL、12 500 IU/mL、25 000 IU/mL、50 000 IU/mL）各20 μL點(diǎn)樣于新配置的纖維蛋白平板上，放置10 min后轉(zhuǎn)至37℃生化培養(yǎng)箱反應(yīng)，18 h后取出測定各溶解圈的垂直直徑。上述操作設(shè)定3個(gè)平行組，測量后計(jì)算溶解圈面積，去除點(diǎn)樣孔面積后，取其平均值為橫坐標(biāo)。尿激酶標(biāo)準(zhǔn)溶液對(duì)應(yīng)的活力，取對(duì)數(shù)值，求平均值為縱坐標(biāo)，制作尿激酶酶活標(biāo)準(zhǔn)曲線，得尿激酶標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=0.008 2X+2.849 4，線性相關(guān)系數(shù)為0.996 81。式中，Y表示尿激酶活力的對(duì)數(shù)值，X表示溶解圈面積（mm2）。

1.2.3.3 納豆激酶活力測定 取待測上清20 μL按上述操作上樣、反應(yīng)、測量溶解圈直徑，根據(jù)尿激酶標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算納豆激酶活力。

1.2.3.4 出渣率的測定 上清液和沉淀分別稱重，計(jì)算出渣率。

式中，A表示出渣率（%），m表示沉淀質(zhì)量（g），M表示上清和沉淀總質(zhì)量（g）。

1.2.3.5 發(fā)酵液終點(diǎn)pH值 上清液作為粗酶液測pH。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 采用Excel 2013進(jìn)行作圖，運(yùn)用正交設(shè)計(jì)助手進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)和分析。

2 結(jié)果

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)納豆激酶活力的影響 由圖1-A可知發(fā)酵時(shí)間12-36 h之間，隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，納豆激酶的活力持續(xù)上升，36 h時(shí)出現(xiàn)第一個(gè)峰點(diǎn)，納豆激酶活力高達(dá)536 265.69 IU/mL；36-48 h之間，隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，納豆激酶的活力呈現(xiàn)下降趨勢；72 h處出現(xiàn)第二個(gè)峰點(diǎn)；72 h后酶活力下降。由圖1-B可知，出渣率在12-24 h呈現(xiàn)上升趨勢；24 h后呈現(xiàn)下降趨勢。終點(diǎn)pH值隨著發(fā)酵時(shí)間增加而增加。綜合核心考察指標(biāo)納豆激酶活力和生產(chǎn)成本，選擇36 h作為納豆枯草芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)酶的最佳發(fā)酵周期。

2.1.2 裝液量對(duì)納豆激酶活力的影響 由圖2-A可知，隨著裝液量的增加，納豆激酶活力在裝液量10%-30%區(qū)間內(nèi)顯著下降。由圖2-B可知，出渣率隨著裝液量的增加而增大，終點(diǎn)pH值隨著裝液量的增加而減小，未發(fā)酵豆乳初始pH為6.53，裝液量為10%的發(fā)酵豆乳發(fā)酵終點(diǎn)pH為8.52，產(chǎn)酶量最高，裝液量為50%的發(fā)酵豆乳發(fā)酵終點(diǎn)pH僅為6.03，產(chǎn)酶量最低。從納豆激酶產(chǎn)量考慮，確定最佳裝液量為10%。

2.1.3 初始pH對(duì)納豆激酶活力的影響 由圖3-A可知，初始pH為6時(shí)，發(fā)酵終點(diǎn)pH為8.67，納豆激酶活力高達(dá)227 520.77 IU/mL。由圖3-B可知，初始pH為2和4時(shí)，終點(diǎn)pH未有變化；初始pH為6和8時(shí)，終點(diǎn)pH均較高；初始pH為10時(shí)，終點(diǎn)pH有少許下降。出渣率在初始pH為4的條件下稍有上升，初始pH為6和8的條件下均較低，說明菌對(duì)豆渣的利用轉(zhuǎn)化率高。從納豆激酶產(chǎn)量考慮，確定初始pH為6。

2.1.4 接菌量對(duì)納豆激酶活力的影響 由圖4-A可知當(dāng)接菌量為2%時(shí)，產(chǎn)酶活力高達(dá)142 375.77IU/mL；由圖4-B可知出渣率均較低，菌對(duì)豆渣的利用好，變化幅度較以上3個(gè)因素的結(jié)果?。唤K點(diǎn)pH均在8以上，產(chǎn)酶量均較高。從納豆激酶產(chǎn)量考慮，確定接菌量為2%。

圖1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)納豆激酶活力、出渣率和終點(diǎn)pH的影響

2.2 正交試驗(yàn)

上述單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，發(fā)酵時(shí)間、裝液量、初始pH和接菌量對(duì)發(fā)酵液產(chǎn)納豆激酶活力均有影響。由于上述幾個(gè)因素間存在交互作用，故設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)以確定其最適發(fā)酵條件。表2為正交試驗(yàn)結(jié)果。正交試驗(yàn)表明，四個(gè)因素對(duì)納豆激酶活力的影響主次順序?yàn)椋航泳浚狙b液量＞初始pH＞發(fā)酵時(shí)間。理論優(yōu)化方案為A1B1C1D3，即發(fā)酵時(shí)間30 h、裝液量5%、初始pH5.5、接菌量2.5%。正交試驗(yàn)表中無此理論配方，配方1與理論配方最接近。為了考察理論配方與實(shí)際配方之間的差異，需進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

圖2 裝液量對(duì)納豆激酶活力、出渣率和終點(diǎn)pH的影響

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

圖3 初始pH對(duì)納豆激酶活力、出渣率和終點(diǎn)pH的影響

圖4 接菌量對(duì)納豆激酶活力、出渣率和終點(diǎn)pH的影響

將理論配方（A1B1C1D3）和實(shí)際配方（A1B1-C1D1）進(jìn)行產(chǎn)納豆激酶活力驗(yàn)證，理論配方酶活為498 088.32 IU/mL，實(shí)際配方酶活為660 184.14 IU/mL。理論配方酶活與實(shí)際配方酶活相差較大，兩種配方區(qū)別在于接菌量的不同，理論配方酶活低于實(shí)際配方酶活，原因可能為接菌量過大不利于產(chǎn)酶。因此，最優(yōu)組合確定為發(fā)酵時(shí)間30 h、裝液量5%、初始pH5.5、接菌量1.5%，該條件下納豆激酶活力為660 184.14 IU/mL，是優(yōu)化前（79 434.68 IU/mL）的8.31倍。

3 討論

發(fā)酵時(shí)間、裝液量、初始pH和接菌量均會(huì)影響納豆枯草芽孢桿菌的納豆激酶表達(dá)量。隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，納豆激酶逐漸積累，營養(yǎng)物質(zhì)的減少和代謝廢物的增多會(huì)限制微生物的生長［22］，納豆激酶的產(chǎn)生后期會(huì)受到一定的限制。終點(diǎn)pH值隨著發(fā)酵時(shí)間增加而增加，推測可能是發(fā)酵過程中納豆激酶及其堿性蛋白酶類產(chǎn)生，同時(shí)也可能是蛋白質(zhì)等大分子被分解產(chǎn)生堿性化合物等所致。裝液量影響溶氧量，溶氧對(duì)納豆激酶的產(chǎn)生影響很大，氧是納豆激酶合成的決定性因素［23］。溶氧越高，越利于菌體生長和產(chǎn)酶。裝液量越小，菌對(duì)豆渣的利用率越高，出渣率就低，同時(shí)堿性納豆激酶產(chǎn)量高，終點(diǎn)pH就高；而裝液量大時(shí)，菌體的通氣量受限，進(jìn)而影響菌體生長代謝和產(chǎn)酶，渣的利用率較少，納豆激酶產(chǎn)量就低，發(fā)酵終點(diǎn)pH低。pH影響菌體生長，也可以影響菌體產(chǎn)酶，偏中性對(duì)納豆枯草芽孢桿菌的生長和產(chǎn)酶都較合適。極酸環(huán)境下菌體不生長，也不產(chǎn)酶。極堿環(huán)境下，菌體可少量生長并能少量產(chǎn)酶。接菌量過高或過低都不利于菌體生長，接菌量過低時(shí)，菌體無法充分生長，接菌量過高時(shí)，營養(yǎng)物質(zhì)不足以滿足菌體的生長和代謝［24］，同時(shí)可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞生長過快，有害產(chǎn)物積累，進(jìn)而影響納豆激酶的合成［25］。

配合發(fā)酵液上清分析，酶活較低的發(fā)酵豆乳上清較清澈且顏色較淺，而酶活相對(duì)高的發(fā)酵豆乳上清均不透明且顏色深。原因可能為，當(dāng)菌的生命活動(dòng)只是剛開始利用一部分豆乳滿足自身生長和代謝時(shí)，發(fā)酵液中酶活較低且色素產(chǎn)生少，此情況發(fā)生在發(fā)酵初期、裝液量高和初始pH低時(shí)。當(dāng)菌開始大量產(chǎn)生納豆激酶時(shí)，色素相繼大量產(chǎn)生，豆乳中的營養(yǎng)成分分解轉(zhuǎn)化，不良風(fēng)味也加重。

綜上，納豆枯草芽孢桿菌利用豆乳生產(chǎn)納豆激酶是一個(gè)動(dòng)態(tài)變化的過程，由于溶氧量影響納豆枯草芽孢桿菌活力，初始pH影響納豆枯草芽孢桿菌對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和代謝，接菌量的多少又影響納豆枯草芽孢桿菌對(duì)豆乳的利用速度，發(fā)酵至一定時(shí)間代謝物的積累、發(fā)酵豆乳pH的變化又會(huì)隨時(shí)影響菌體生長和產(chǎn)酶。因而只有當(dāng)這些因素組合并且條件合適時(shí)，才能實(shí)現(xiàn)納豆激酶產(chǎn)量的最大化。

前期優(yōu)化以發(fā)酵時(shí)間、裝液量、接菌量和初始pH進(jìn)行了單因素和正交試驗(yàn)。但由于接菌量和初始pH的因素間距設(shè)置較小，接菌量未設(shè)置過大，初始pH未涉及極酸，因而結(jié)果能反應(yīng)的問題較局限。同時(shí)考慮到發(fā)酵過程應(yīng)先考慮環(huán)境是否適宜菌種生存，再考慮接多少菌的問題。基于此，本試驗(yàn)在前期優(yōu)化的基礎(chǔ)上，調(diào)整因素順序和因素水平。單因素試驗(yàn)結(jié)果與前期結(jié)果一致，正交試驗(yàn)中前3個(gè)因素水平與前期優(yōu)化設(shè)置一致，初始pH因前期研究得到偏中性適合納豆枯草芽孢桿菌產(chǎn)酶，因而該因素水平依然設(shè)置為5.5、6、6.5，接菌量的因素水平稍拉大，3個(gè)水平設(shè)置為1.5%、2%和2.5%（前期研究為1.75%、2%和2.25%）。最終確定的最佳工藝與前期研究不同之處在于接菌量，本次的最適接菌量為1.5%，前一次為1.75%。由此可推斷，接菌量對(duì)產(chǎn)酶的影響很大，而正交試驗(yàn)中，各因素對(duì)酶活影響最大的就是接菌量，因此認(rèn)為推斷正確，結(jié)合驗(yàn)證試驗(yàn)也可說明接菌量的重要性。在最佳發(fā)酵條件下，產(chǎn)酶量達(dá)660 184.14 IU/mL，是優(yōu)化前（79 434.68 IU/mL）的8.31倍，是前期研究（429 869.34 IU/mL）的1.54倍［18］。通過本實(shí)驗(yàn)研究既節(jié)約了成本也提高了納豆激酶的表達(dá)量，對(duì)納豆激酶的規(guī)?；a(chǎn)具有顯著指導(dǎo)意義。

本試驗(yàn)成功優(yōu)化了豆乳制備納豆激酶的工藝，但在提高酶活的過程中，也同時(shí)產(chǎn)生了限制產(chǎn)業(yè)發(fā)展的問題，如納豆不良風(fēng)味加重，這種不良風(fēng)味也被形容為氨臭味或霉腐味，同時(shí)發(fā)酵液顏色由乳黃色變成深褐色。不良風(fēng)味伴隨深褐色色素的產(chǎn)生直接影響食欲。目前對(duì)納豆風(fēng)味的報(bào)道中，針對(duì)不良風(fēng)味的較少，對(duì)不良風(fēng)味的成因和解決更是鮮有報(bào)道。納豆風(fēng)味方面，不同學(xué)者得出的結(jié)論稍有差異，這與納豆制作工藝和檢測方法有密切關(guān)聯(lián)。另外，深褐色色素可能是由大豆蛋白質(zhì)以及它分解的多肽類與還原糖在大豆發(fā)酵過程中發(fā)生美拉德反應(yīng)所生成，也稱蛋白黑素或類黑精［26］。類黑精具有廣泛生理功能，如抗氧化、抗腫瘤、抗菌與抗炎作用等［27］。若此色素對(duì)納豆感官影響很大，可考慮脫色或提取純化該物質(zhì)。綜上，目前亟待解決的是納豆不良風(fēng)味的問題，納豆不良風(fēng)味的解決僅停留在輔料添加［28-29］、工藝優(yōu)化［30］和原料篩選等方面［31-32］，探索產(chǎn)生不良風(fēng)味的分子機(jī)制才是從根本上解決問題的方法，這也是最值得深入研究的科學(xué)問題。

4 結(jié)論

本研究通過單因素和正交試驗(yàn)確定了最佳發(fā)酵條件：發(fā)酵時(shí)間30 h，裝液量5%，初始pH5.5，接菌量1.5%。在此發(fā)酵條件下，酶活可高達(dá)660 184.14 IU/mL，是優(yōu)化前（79 434.68 IU/mL）的8.31倍，是前期最佳工藝下納豆激酶表達(dá)量（429 869.34 IU/mL）的1.54倍。與前期全豆豆乳最佳工藝條件相比，通過調(diào)整初始pH和接菌量的先后順序，可以在更低接菌量（前期研究，最佳接菌量為1.75%）的基礎(chǔ)上，顯著增加納豆激酶表達(dá)量。