抑酸治療對肺纖維化大鼠的影響研究

舒艷梅，楊興娜，王金梁

特發(fā)性肺纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是一種局限于肺部的慢性進(jìn)行性纖維化性間質(zhì)性肺炎［1］，其組織病理學(xué)和/或胸部高分辨率CT 特征性表現(xiàn)為尋常型間質(zhì)性肺炎（UIP），主要病理表現(xiàn)為彌漫性肺泡損傷和肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，最終導(dǎo)致肺泡結(jié)構(gòu)破壞，形成肺纖維化和蜂窩肺。IPF 患者主要臨床表現(xiàn)為刺激性干咳、進(jìn)行性加重的呼吸困難等，少數(shù)患者表現(xiàn)為逐步、可預(yù)見性的肺功能下降，極少數(shù)患者病情呈快速進(jìn)行性發(fā)展。近年來IPF 發(fā)病率呈逐年上升趨勢，致殘率、病死率較高，預(yù)后較多種癌癥更差，中位生存時間為2.8～4.2 年，肺移植后中位生存時間約為4.5 年，5 年生存率約為20%，故被稱為“類腫瘤疾病”［2］。據(jù)報道，歐洲和北美地區(qū)IPF 發(fā)病率為（2.8～9.3）/10 萬［3］。

目前，臨床尚無能有效逆轉(zhuǎn)肺纖維化過程的藥物。近年來，多項研究表明IPF 患者常合并胃食管反流（gastroesophageal reflux disease，GERD）［4-7］，而GERD所致的反復(fù)微小吸入可能與IPF 發(fā)生有關(guān)，肺部微生態(tài)相關(guān)機制研究也提到GERD 是IPF 的危險因素之一［5］。HAN 等［8］研究結(jié)果顯示，約56.4%的IPF 患者存在GERD。MOLYNEAUX 等［9］學(xué)者發(fā)現(xiàn)，IPF 急性加重患者多表現(xiàn)為彎曲桿菌屬增多，而彎曲桿菌屬主要來自消化道，推測可能是由于消化系統(tǒng)內(nèi)容物的潛在微小誤吸所致。但多數(shù)IPF 患者為“隱性反流”，GERD 的臨床癥狀并不明顯，因此易被漏診或誤診。近年來隨著24 h食管pH 監(jiān)測儀應(yīng)用于臨床，人們逐漸發(fā)現(xiàn)GERD 可能對IPF 產(chǎn)生影響。2011 年，LEE 等［10］通過回顧性分析204 例IPF 患者病例資料發(fā)現(xiàn)，抑酸治療與IPF 患者生存時間延長有關(guān)，但目前其具體作用機制尚未完全明確。本研究旨在探討抑酸治療對肺纖維化大鼠的影響，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 2017-06-21 至2017-08-17，選取36只普通級雄性健康SD 大鼠，體質(zhì)量150～200 g，由河南科技大學(xué)模式動物研究室提供，普通環(huán)境飼養(yǎng)。

1.2 主要試劑 博來霉素試劑（河南天池生物科技有限公司生產(chǎn)），醋酸潑尼松（哈藥集團(tuán)制藥四廠生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字H23020185），鹽酸雷尼替?。ò⑻鼐S斯制藥有限公司生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字H44021231），丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒（南京建成生物工程研究所生產(chǎn)），烏拉坦溶液（河南科技大學(xué)模式動物研究室提供），鹽酸溶液（河南科技大學(xué)模式動物研究室提供）。

1.3 分組及造模 將36 只健康雄性SD 大鼠隨機分為對照組（n=10）、肺纖維化組（n=6）、雷尼替丁組（n=10）及潑尼松組（n=10）。肺纖維化組、雷尼替丁組及潑尼松組大鼠均一次性經(jīng)鼻滴入博來霉素7 μg/g 建立肺纖維化模型［11］，對照組大鼠經(jīng)鼻滴入相同劑量0.9%氯化鈉溶液。造模后，雷尼替丁組大鼠予以鹽酸雷尼替丁30 mg·kg-1·d-1連續(xù)灌胃28 d［12］，潑尼松組大鼠予以醋酸潑尼松6 mg·kg-1·d-1［13］連續(xù)灌胃28 d，對照組大鼠予以相同劑量0.9%氯化鈉溶液連續(xù)灌胃28 d。造模后7 d 隨機選取肺纖維化組1 只大鼠處死，造模后14 d 隨機選取肺纖維化組1 只大鼠處死，造模后28 d 將肺纖維化組剩余4 只大鼠全部處死，行肺組織病理切片觀察肺纖維化情況以驗證是否造模成功。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 取材 造模后28 d，四組大鼠均采用20%烏拉坦溶液（5 ml/kg）腹腔注射麻醉，經(jīng)腹主動脈抽取動脈血檢測血清MDA 水平及動脈血氧分壓（PaO2）；腹主動脈放血處死大鼠，開胸取出肺組織后用0.9%氯化鈉溶液漂洗數(shù)次，采用4%多聚甲醛液固定肺組織，常規(guī)石蠟包埋，進(jìn)行HE 染色。

1.4.2 肺纖維化嚴(yán)重程度 結(jié)合肺組織HE 染色結(jié)果，按照SZAPIEL 等［14］提出的方法評估肺纖維化嚴(yán)重程度，肺纖維化嚴(yán)重程度判定標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 肺纖維化嚴(yán)重程度判定標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Criteria for severity of pulmonary fibrosis

1.4.3 血清MDA 水平 取大鼠腹主動脈血，4 000 r/min離心10 min（離心半徑13.5 cm），留取血清并置于-20 ℃環(huán)境下保存待測，采用TBA 法配制試劑，嚴(yán)格按照MDA 試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.4.4 PaO2采用經(jīng)低分子肝素鈣肝素化的注射器抽取大鼠腹主動脈血，頂端使用肝素帽封閉，冷藏環(huán)境下15 min 內(nèi)送至河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科重癥監(jiān)護(hù)室，采用美國雅培I-STAT1300-G 型血氣分析儀檢測PaO2，以評估肺氧合功能。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析；計數(shù)資料分析采用χ2檢驗；等級資料分析采用秩和檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺組織病理學(xué)特征 HE 染色結(jié)果顯示，對照組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)正常，肺泡腔透亮，無明顯充血水腫，肺泡壁薄，肺泡內(nèi)未見明顯滲出，未見明顯急慢性炎性改變及纖維化表現(xiàn)，肺纖維化嚴(yán)重程度（-），見圖1A。肺纖維化組大鼠造模后7 d 部分肺泡腔內(nèi)可見少量滲出及炎性細(xì)胞浸潤，肺纖維化嚴(yán)重程度（+），見圖1B；造模后14 d 有較多肺組織內(nèi)可見炎性細(xì)胞浸潤和少量膠原沉積，肺纖維化嚴(yán)重程度（++），見圖1C；造模后28 d，肺組織內(nèi)可見大量炎性細(xì)胞浸潤，肺泡壁增厚，肺泡間隔增寬，肺泡腔內(nèi)有大量成纖維細(xì)胞增殖及膠原沉積，肺纖維化嚴(yán)重程度（+++），見圖1D，提示造模成功。造模后28 d，雷尼替丁組和潑尼松組大鼠肺泡炎性反應(yīng)及纖維化嚴(yán)重程度均較肺纖維化組減輕，見圖1E～1F。

2.2 肺纖維化嚴(yán)重程度、血清MDA 水平及PaO2實驗過程中雷尼替丁組1 只大鼠死亡，潑尼松組3 只大鼠死亡。造模后28 d 四組大鼠肺纖維化嚴(yán)重程度及血清MDA 水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；肺纖維化組、雷尼替丁組、潑尼松組大鼠肺纖維化嚴(yán)重程度劣于對照組，血清MDA 水平高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；雷尼替丁組、潑尼松組大鼠肺纖維化嚴(yán)重程度優(yōu)于肺纖維化組，血清MDA 水平低于肺纖維化組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。造模后28 d四組大鼠PaO2比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，見表2）。

表2 四組大鼠造模后28 d 肺纖維化嚴(yán)重程度、血清MDA 水平及PaO2比較Table 2 Comparison of severity of pulmonary fibrosis，serum MDA level and PaO2 in the four groups 28 days after modeling

3 討論

圖1 四組大鼠肺組織病理學(xué)特征（HE 染色，×400）Figure 1 Pathological features of pulmonary tissue in the four groups

IPF 是特發(fā)性間質(zhì)性肺炎的常見類型，常起病隱匿，好發(fā)于中老年人群，臨床癥狀輕重不一，大多數(shù)患者表現(xiàn)為緩慢、逐步、可預(yù)見的肺功能下降；少數(shù)患者反復(fù)發(fā)生急性加重；極少數(shù)患者表現(xiàn)為進(jìn)行性加重的呼吸困難，可嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。IPF 的主要病理表現(xiàn)為明顯纖維化或結(jié)構(gòu)改變，伴或不伴有蜂窩肺，肺間質(zhì)內(nèi)膠原過度沉積和纖維母細(xì)胞過度增殖，斑片狀肺實質(zhì)纖維化和成纖維細(xì)胞灶形成。目前，IPF 的具體發(fā)病機制尚未完全明確，且尚無能有效逆轉(zhuǎn)肺纖維化過程的藥物。

糖皮質(zhì)激素是治療IPF 的經(jīng)典藥物，能抑制多種免疫效應(yīng)細(xì)胞功能及各種細(xì)胞因子的合成、分泌，從而減輕IPF 患者肺泡炎癥及纖維化，改善患者臨床癥狀，常用于IPF 急性加重期；此外，糖皮質(zhì)激素還可通過選擇性誘導(dǎo)肺內(nèi)炎性細(xì)胞凋亡而改善博來霉素所致肺纖維化模型大鼠肺泡炎性反應(yīng)及肺纖維化程度［15］。

近年來，多項研究表明IPF 患者常合并GERD，而GERD 所致的反復(fù)微小吸入可能與IPF 發(fā)生有關(guān)［4-7］，提示GERD 可能是IPF 的潛在病因。抑酸治療可能會延長IPF 患者生存時間，但具體機制尚未完全明確。雷尼替丁是臨床常見的抑酸藥物，其可有效緩解胃酸過多所致的胃痛、胃灼熱感、反酸等，常用于全身麻醉或大手術(shù)后及衰弱昏迷患者預(yù)防胃酸反流合并吸入性肺炎。本研究選用雷尼替丁作為抑酸藥物，結(jié)果顯示，肺纖維化組、雷尼替丁組、潑尼松組大鼠肺纖維化嚴(yán)重程度劣于對照組，雷尼替丁組、潑尼松組大鼠肺纖維化嚴(yán)重程度優(yōu)于肺纖維化組；HE 染色結(jié)果顯示，造模后28 d 雷尼替丁組和潑尼松組大鼠肺泡炎性反應(yīng)及纖維化嚴(yán)重程度均較肺纖維化組減輕，提示抑酸治療能在一定程度上減輕肺纖維化大鼠肺纖維化嚴(yán)重程度，與糖皮質(zhì)激素作用相似。

正常生理條件下，自由基在機體內(nèi)分布較為廣泛，僅極少量自由基與氧結(jié)合轉(zhuǎn)變成氧自由基而參與機體生理反應(yīng)、生化反應(yīng)、免疫反應(yīng)等；此外，氧自由基還能與不飽和脂肪酸相互作用而使脂質(zhì)微循環(huán)紊亂，導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性和完整性遭到破壞，進(jìn)而引起細(xì)胞結(jié)構(gòu)及功能改變，最終形成脂質(zhì)過氧化物。MDA 是過氧化脂質(zhì)的主要代謝產(chǎn)物，其水平變化可直接反映組織中脂質(zhì)過氧化程度及間接反映氧自由基含量［16-18］，此外還可衡量機體氧化應(yīng)激反應(yīng)程度［19-20］。本研究結(jié)果顯示，造模后28 d 肺纖維化組、雷尼替丁組、潑尼松組大鼠血清MDA 水平高于對照組，雷尼替丁組、潑尼松組大鼠血清MDA 水平低于肺纖維化組，提示抑酸治療能在一定程度上減輕肺纖維化大鼠脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，與糖皮質(zhì)激素作用相似。PaO2是評估肺氧合功能的臨床指標(biāo)之一。本研究結(jié)果顯示，造模后28 d 四組大鼠 PaO2比較無統(tǒng)計學(xué)差異，提示抑酸治療對肺纖維化大鼠肺氧合功能無明顯影響，分析其原因可能與樣本量較小、實驗條件及實驗周期有限有關(guān)。

綜上所述，抑酸治療能在一定程度上減輕肺纖維化大鼠肺纖維化嚴(yán)重程度及脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，但對肺氧合功能無明顯影響，與糖皮質(zhì)激素作用相似；但本研究為動物實驗，僅提供了初步實驗數(shù)據(jù)；此外，肺纖維化發(fā)病機制較為復(fù)雜，因此抑酸治療對肺纖維化的影響仍有待進(jìn)一步研究證實。

作者貢獻(xiàn)：舒艷梅、楊興娜、王金梁進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計；舒艷梅、楊興娜進(jìn)行研究的實施與可行性分析，進(jìn)行數(shù)據(jù)收集、整理、分析；舒艷梅進(jìn)行結(jié)果分析與解釋，負(fù)責(zé)撰寫論文；舒艷梅、王金梁進(jìn)行論文的修訂；王金梁負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校，對文章整體負(fù)責(zé)，監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。