子宮頸細胞人乳頭瘤病毒 L1 殼蛋白的表達與臨床應(yīng)用研究*

周 斌， 蘇學(xué)英， 左新華， 謝福源

(1鷹潭市人民醫(yī)院， 江西 鷹潭 335000； 2四川大學(xué)華西醫(yī)院病理科， 四川 成都 610041； 3鷹潭市中醫(yī)院檢驗科， 江西 鷹潭 335000； 4南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科， 江西 南昌 330006)

宮頸癌是臨床上最為常見的女性惡性腫瘤之一，其發(fā)生率位居女性惡性腫瘤的第2位，僅次于乳腺癌，在一些發(fā)展中國家甚至已經(jīng)躍居于首位[1-2]。在我國，女性宮頸癌發(fā)病率呈現(xiàn)明顯上升趨勢，嚴重威脅女性朋友的生命健康[3]。大量臨床證據(jù)表明，人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)感染是大多數(shù)惡性腫瘤的主要始動因素。據(jù)統(tǒng)計，每年約有6.5%的惡性腫瘤患者與 HPV 感染有關(guān)，在與諸多惡性腫瘤感染相關(guān)的因素中占據(jù)首位[4]。研究揭示，HPV 感染是宮頸癌及其癌前病變發(fā)生的必要條件，分子流行病調(diào)查已發(fā)現(xiàn)宮頸癌標(biāo)本中高危型人乳頭瘤病毒(high-risk human papillomavirus，HR-HPV)DNA 陽性率達到了99.8%[5-7]。目前臨床上針對HPV 感染的預(yù)防已升級為宮頸癌預(yù)防的二級措施。研究表明，HPV L1殼蛋白(capsid protein)是HPV的主要結(jié)構(gòu)蛋白，由晚期轉(zhuǎn)錄基因L1編碼，在所有類型的HPV中高度保守，約占衣殼蛋白的90%以上[8-9]。此外，HPV L1殼蛋白是公認的機體免疫監(jiān)控識別位點以及細胞免疫殺傷HPV的攻擊位點。本研究旨在通過探討HPV L1殼蛋白表達對機體免疫因子以及免疫細胞群體的影響，為進一步闡釋HPV L1殼蛋白表達的檢測對于宮頸細胞惡性轉(zhuǎn)化以及機體細胞免疫狀態(tài)判斷的臨床價值，提供實驗依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 主要試劑與儀器

ThinPrep 2000自動制片系統(tǒng)處理制成薄層涂片(用于婦科宮頸液基細胞學(xué)檢測)及Cervista HPV 檢測系統(tǒng)(用于宮頸細胞高危型人乳頭瘤病毒檢測)均購自HOLOGIC。賽泰?細胞/組織人乳頭瘤病毒檢測試劑盒檢測HPV L1殼蛋白(ADVANCED)；流式細胞儀(Beckman)用于免疫細胞群體(效應(yīng)T細胞、NK細胞、調(diào)節(jié)性T細胞)的檢測，檢測試劑盒購自BD；白細胞介素2(interleukin-2,IL-2)和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的ELISA試劑盒(BD)。

2 調(diào)查對象

鷹潭市人民醫(yī)院2012年7月～2014年12月期間在婦科門診就診婦女280例，年齡22～68歲，平均(38.12±9.48)歲。280例納入研究者參考國際癌癥協(xié)會推薦的TBS(2001)分類標(biāo)準包括5類：上皮內(nèi)病變陰性(negative intraepithelial lesion，NILM)型179例，非典型性鱗狀上皮細胞(atypical squamous cell，ASC)型41例、低度鱗狀上皮內(nèi)病變(low-grade squamous intraepithelial lesion，LISL)型30例、高度鱗狀上皮內(nèi)病變(high-grade squamous intraepithelial lesion，HSIL)型28例和鱗狀上皮癌(squamous-cell carcinoma，SCC)型2例。納入標(biāo)準為：(1)所有患者均符合《〈婦產(chǎn)科抗生素使用指南〉解讀》[10]中有關(guān)于人宮頸乳頭瘤病毒的臨床感染診斷標(biāo)準；(2)所有患者均已有性生活史；(3)均無宮頸錐切、子宮切除及宮頸手術(shù)史；(4)患者無放化療史；(5)研究均經(jīng)患者及其家屬知情同意，并簽署知情同意書，亦均經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會審查通過。排除標(biāo)準為：(1)正處于哺乳期以及妊娠期的女性；(2)合并有嚴重的滴蟲性、霉菌性陰道炎的患者；(3)合并有心腦血管疾病以及肝腎功能不全的患者；(4)有嚴重精神疾病無法配合研究的患者。

3 方法

3.1標(biāo)本收集 檢查前 72 h，受檢者禁止性生活及陰道沖洗，用窺陰器暴露宮頸后，使用棉球輕輕擦去宮頸穹窿與表面的分泌物，將專用薄層液基細胞學(xué)子宮頸刷頭緩緩導(dǎo)入子宮頸管內(nèi)，于子宮頸外口鱗柱狀上皮交界處，以子宮頸外口為中心，順時針均勻旋轉(zhuǎn)7周以后取出，將宮頸脫落細胞標(biāo)本置于專用液基細胞保存瓶送檢。

3.2陰道鏡下活檢及病理 受檢者均行陰道鏡檢查，消毒外陰、陰道和宮頸后，無明顯異常者則于陰道鏡下使用活檢鉗采取3、6、9和12點活檢+宮頸搔刮，對可疑病灶進行定位活檢+宮頸搔刮，組織先行固定后，經(jīng)病理師切片、染色后, 由2位資深病理學(xué)專家在雙盲下進行閱片。根據(jù)WHO 2014 年版國際疾病分類標(biāo)準進行病理學(xué)診斷。

3.3液基薄層細胞學(xué)檢測(liquid-based cytology test，TCT) 將細胞保存液中的細胞從刷子上沖洗下來，隨后的制片及染色均嚴格按照說明書進行。采用2001年描述性宮頸細胞學(xué)診斷報告方式TBS(The Bethesds System)報告系統(tǒng)，細胞學(xué)結(jié)果判定：陰性為正常細胞以及組織細胞的良性改變，即NILM；陽性為各種程度的鱗狀上皮細胞異常，包括ASC陽性、LSIL陽性、HSIL陽性和SCC陽性。

3.4HPV L1殼蛋白的檢測 將細胞保存液中的細胞從刷子上沖洗下來后，應(yīng)用賽泰?細胞/組織人乳頭瘤病毒檢測試劑盒檢測HPV L1殼蛋白，操作嚴格按照說明書進行。HPV L1殼蛋白表達陽性的診斷以顯微鏡下閱片有1個細胞核被染紅即可，計算HPV L1殼蛋白陽性率。

3.5ELISA檢測血清中IL-2和TNF-α水平 所有受檢者均采集清晨空腹靜脈血5 mL，離心后留取血清，于-20℃條件保存，檢測采用ELISA檢測患者血清IL-2以及TNF-α水平。具體操作嚴格按照試劑盒使用說明書進行。

3.6流式細胞術(shù)檢測血液中免疫細胞亞群的變化 采集受檢者血液樣本，離心并收集細胞，采用PBS洗滌液洗滌后，用流式細胞術(shù)按照標(biāo)準程序檢測細胞內(nèi)活化T細胞(CD3+CD25+)、NK細胞(CD3-CD16-CD56+)以及調(diào)節(jié)性T細胞(CD4+FoxP3+)亞群的變化情況。所有操作均按照試劑盒操作說明書嚴格執(zhí)行。

3.7Cervista HPV的檢測 標(biāo)本取自于TCT檢測用的同一標(biāo)本的同一份細胞保存液，所有HR-HPV DNA檢測按照生產(chǎn)商的說明在Cervista技術(shù)平臺中進行。Cervista HPV-DNA檢測方法將HR-HPV陽性結(jié)果分為3個組，分別為A5/A6型組(包括HPV51、56和66亞型)，A7型組(包括HPV 18、39、45、59和68亞型)和A9型組(包括HPV16、31、33、35、52和58亞型)，任意一組陽性即判定HR-HPV DNA結(jié)果陽性。

4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 20.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析。計量資料用均數(shù)±標(biāo)準差(mean±SD)表示，組間經(jīng)t檢驗比較；計數(shù)資料采用百分位數(shù)表示，組間經(jīng)2檢驗對比分析；樣本數(shù)據(jù)的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)性分析法進行檢驗。以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 TCT檢測結(jié)果和受檢者HR-HPV陽性分布情況

280例患者中，TCT檢測結(jié)果顯示，NILM、ASC、LSIL、HSIL和SCC 5種類型的人數(shù)分別為179例、41例、30例、28例和2例。隨著TCT級別的升高，HR-HPV陽性率明顯升高，在SCC中，HR-HPV陽性率達到100%，見表1。

表1 TCT檢測的5種類型宮頸細胞HR-HPV和HPV L1殼蛋白陽性表達檢測結(jié)果比較

**P<0.01vsnegative.

2 不同分型中HPV L1殼蛋白的陽性表達

按照TCT細胞分級，280例受檢者中HPV L1殼蛋白表達陽性在NILM組中占39.66%(71/179),在ASC組中占41.46%(17/41),在LSIL組中占73.33%(22/30),在HSIL組中占32.14%(9/28),在SCC組中陽性率為0%，各組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。按照病理活檢分型，在280例受檢者中HPV L1殼蛋白表達陽性119例(總陽性率74.14%)，其中CIN I占64.71%(33/51)，CINⅡ/Ⅲ占31.03%(9/21)，兩組之間比較差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.05)，2例SCC患者的HPV L1殼蛋白表達均為陰性。即組織病理學(xué)病變程度越重，則HPV L1殼蛋白的陽性表達率越低，見表1。

3 不同HPV L1殼蛋白表達患者的血清IL-2和TNF-α水平比較

HPV L1殼蛋白表達陽性的受檢者中，血清IL-2水平為(3.20±0.70) ng/L，顯著低于HPV L1殼蛋白表達陰性受檢者的(5.42±0.72)ng/L(P<0.01)。HPV L1殼蛋白表達陽性的受檢者中，TNF-α水平為(14.10±1.25) ng/L，明顯高于HPV L1殼蛋白表達陰性的受檢者(P<0.01)，見表2。

表2 不同HPV L1殼蛋白表達患者的血清IL-2和TNF-α水平比較

**P<0.01vsnegative.

4 不同HPV L1殼蛋白表達的患者血液中各免疫細胞亞群的分布

在HPV L1殼蛋白表達陽性的受檢者血液中，免疫激活型細胞亞群活化T細胞以及NK細胞數(shù)明顯高于HPV L1殼蛋白表達陰性的受檢者(P<0.01)；而HPV L1殼蛋白表達陽性的受檢者血液中免疫抑制性細胞亞群Treg細胞顯著低于HPV L1殼蛋白表達陰性的受檢者(P<0.01)，見表2。

5 HPV L1殼蛋白陽性表達與免疫細胞亞群分布的相關(guān)性分析

相關(guān)分析結(jié)果可見，HPV L1殼蛋白陽性表達與免疫激活細胞亞群分布具有正相關(guān)性，而與免疫抑制性細胞亞群分布呈現(xiàn)負相關(guān)性，均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

討 論

宮頸癌是臨床婦科中最為常見的惡性腫瘤之一，據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，全球每年新發(fā)宮頸癌發(fā)病病例約有50萬例[1,11]，而在我國，這一數(shù)字高達14萬例，對廣大婦女朋友的生命健康構(gòu)成了嚴重威脅。早期診斷對宮頸癌的治療極其重要，目前臨床上對于宮頸癌的診斷主要依據(jù)其明顯的臨床癥狀，然而，由于其癥狀出現(xiàn)較晚，導(dǎo)致宮頸癌的早期診斷及后期治療受到極大阻礙[12]。

HPV感染與女性生殖道疾病的發(fā)生密切相關(guān)[13]。研究表明一半以上的宮頸癌與持續(xù)慢性的 HPV 感染密切相關(guān)[14-16]。據(jù)統(tǒng)計，全球每年大約有6億女性感染HPV，但其中絕大部分感染者(約90%)均能夠通過自身的免疫系統(tǒng)自愈，因此，免疫系統(tǒng)功能的正常對 HPV病毒的清除尤為重要。

HPV L1殼蛋白是一種由晚期轉(zhuǎn)錄基因L1編碼的在所有類型的HPV中高度保守的蛋白，其含量約占到衣殼蛋白的90%以上，是學(xué)界公認的免疫反應(yīng)攻擊HPV病毒和病毒感染宿主細胞的主要靶位，也是HPV 疫苗形成的重要前提[17]。有研究顯示，HPV L1殼蛋白表達強弱與患者宮頸損傷程度密切相關(guān)[18]。通常情況下，在HPV感染的早期階段，即病毒復(fù)制階段，HPV L1殼蛋白的表達增加；在HPV感染的晚期階段，即病毒感染轉(zhuǎn)化階段，HPV L1殼蛋白的表達被抑制，直至缺失[19]。究其原因，是由于 HPV 此時已經(jīng)整合到宿主基因內(nèi)，從而導(dǎo)致HPV L1殼蛋白的產(chǎn)生減少[20]。

惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個復(fù)雜的多階段的連續(xù)性過程，受機體內(nèi)外環(huán)境因素的影響。腫瘤細胞逃逸機體免疫系統(tǒng)監(jiān)視是惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要特征之一[21]。研究表明，惡性腫瘤患者往往伴隨機體免疫功能下降，從而導(dǎo)致機體無法有效清除惡性增殖的突變細胞，出現(xiàn)免疫逃逸[22]。研究揭示，HPV L1殼蛋白單體能夠通過與I/II類MHC和T細胞(CD4/CD8)形成免疫復(fù)合物，從而將免疫連鎖反應(yīng)迅速激活，促進高濃度的免疫抗體產(chǎn)生，從而達到免疫清除作用[23]。眾所周知，機體的免疫反應(yīng)由多個系統(tǒng)構(gòu)成，其中血清內(nèi)各類免疫因子(IL-2、TNF-α、IL-8、IL-10、INF-γ等)是免疫功能調(diào)控的重要參與者，此外，機體的相關(guān)免疫細胞的增殖活化情況同樣是反應(yīng)機體免疫狀態(tài)的重要參數(shù)。IL-2由Th1細胞分泌，可以介導(dǎo)細胞免疫應(yīng)答，Th2細胞則參與體液免疫應(yīng)答，與Th1相互制約，維持動態(tài)平衡的狀態(tài)，當(dāng)Th1向Th2偏移時，機體的免疫功能下降，會促進腫瘤的發(fā)生。TNF-α由單核-巨噬細胞分泌，不僅具有選擇性殺傷某些腫瘤細胞的作用，還可參與免疫調(diào)控、感染、炎癥反應(yīng)等，可作為疾病療效以及預(yù)后的評估指標(biāo)。因此，IL-2與TNF-α均在宮頸HPV感染的發(fā)生過程中起到一定的作用。

本研究旨在探討HPV L1殼蛋白表達的情況，與宮頸細胞惡性轉(zhuǎn)化的關(guān)系，以及對于機體細胞免疫狀態(tài)的影響，為闡明宮頸癌HPV L1殼蛋白表達與腫瘤免疫功能之間的關(guān)系，以期為確定其臨床應(yīng)用價值提供一定理論基礎(chǔ)。結(jié)果顯示HPV L1殼蛋白表達陽性率隨著宮頸活檢確定的宮頸病變級別的加重而呈現(xiàn)下降趨勢，并在SCC時表達為0，各組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義； IL-2水平隨著HPV L1殼蛋白表達陽性率升高而減少，TNF-α水平隨著HPV L1殼蛋白表達陽性率升高而增加，經(jīng)比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義； HPV L1殼蛋白陽性表達率的降低伴隨著免疫激活性免疫細胞群體的增加以及免疫抑制性免疫細胞群體的減少，且二者具有相關(guān)性，組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。與已有研究成果相比，本研究不同之處在于利用相關(guān)性分析法對HPV L1殼蛋白的陽性表達與免疫細胞亞群之間的關(guān)聯(lián)性展開了分析，結(jié)果表明其陽性表達與免疫激活細胞亞群分布具有正相關(guān)性，而與免疫抑制性細胞亞群分布呈現(xiàn)負相關(guān)性。此點內(nèi)容在既有成果中并未見到，不失為本研究的創(chuàng)新之所在。

綜上所述，檢測子宮頸細胞HPV L1 殼蛋白表達對于判斷宮頸細胞惡性轉(zhuǎn)化，確定機體免疫狀態(tài)，闡明宮頸癌發(fā)生的免疫機制，具有重要的臨床意義，值得進一步深入研究和探討。