TGFβ1/Smad3信號通路介導(dǎo)的賴氨酸羥化酶2活性變化在肺纖維化膠原沉積中的作用*

邵松軍， 方海燕， 葉賢偉， 饒姍姍， 張幫艷， 袁國航, 劉維佳△， 張湘燕△

(1貴州省人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科， 貴州省呼吸疾病研究所， 貴州 貴陽 550002； 2貴州省第二人民醫(yī)院老年精神病科， 貴州 貴陽 550006)

肺纖維化(pulmonary fibrosis，PF)是不同病因?qū)е碌穆蚤g質(zhì)性肺疾病(interstitial lung disease，ILD)的共同結(jié)局[1]。據(jù)歐洲呼吸病學(xué)雜志統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，其年發(fā)病率 6.8～16.3人/10萬人口，年患病率14～42.7人/10萬人口，65歲以上人群發(fā)病率93.7人/10萬人口[2-3]。在我國雖沒有明確的PF流行病學(xué)資料，但學(xué)者王柳盛等[4]發(fā)表的《中國大陸間質(zhì)性肺疾病流行病學(xué)資料及研究進(jìn)展》中提示，我國間質(zhì)性肺疾病的患者也逐年增加。肺纖維化發(fā)病機制復(fù)雜，治療方案也有限，5年生存率<50%[5]。目前治療肺纖維化的藥物有吡非尼酮和尼達(dá)尼布，但價格昂貴、副作用大，對肺纖維化的臨床治療效果欠佳[6-7]，因此，深入探討肺纖維化的發(fā)病機制，尋找新的治療靶點意義重大。

目前，轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor-β1，TGFβ1)是公認(rèn)最強的促纖維化因子，一方面可以促進(jìn)成上皮細(xì)胞和纖維細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)分化；另一方面可以在轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)膠原等細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的表達(dá)，并且抑制其降解[8]。然而，膠原代謝的經(jīng)典研究認(rèn)為膠原的合成增加主要由肺成纖維細(xì)胞增殖活化，纖維化病灶中膠原分子共價交聯(lián)的形成，使得膠原難以降解而發(fā)生積聚[9-10]。在膠原形成中分子間交聯(lián)是一個重要的翻譯后修飾過程[11]。有文獻(xiàn)報道，賴氨酸羥化酶與膠原交聯(lián)關(guān)系密切，影響其形成和穩(wěn)定[12]。賴氨酸羥化酶2(lysyl hydroxylase 2，LH2)被前膠原賴氨酸2-酮戊二酸5-加雙氧酶2(procollagen-lysine 2-oxoglutarate 5-dioxygenase 2，PLOD2)基因編碼，膠原分子吡啶交聯(lián)增加與LH2有關(guān)[13]。而米諾地爾(minoxidil，Mi)是一種氮雜環(huán)乙烷嘧啶衍生物，之前主要用于降血壓和促進(jìn)毛發(fā)生長。最近發(fā)現(xiàn)其可通過對賴氨酸羥化酶競爭性抑制，有效地阻止膠原蛋白的翻譯后修飾過程[14]。

目前尚不清楚LH2活性變化是否被TGFβ1/Smad3信號通路調(diào)節(jié)，LH2活性變化如何對膠原翻譯后修飾進(jìn)行調(diào)節(jié)，米諾地爾又是如何導(dǎo)致LH2活性變化的。因此，本次實驗將從體外對上述問題進(jìn)行研究，以期為肺纖維化的發(fā)病機制進(jìn)一步提供新的理論依據(jù)和實踐基礎(chǔ)，將為其臨床治療提供新的思路和靶點。

材 料 和 方 法

1 細(xì)胞株及培養(yǎng)

人肺成纖維細(xì)胞株HFL1細(xì)胞購自廣州吉尼歐生物科技有限公司。復(fù)蘇HFL1細(xì)胞并接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，加4 mL含10%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)的F12培養(yǎng)基，并置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞生長融合度為80%時，用0.25% 胰蛋白酶消化，隔天換液、傳代，取生長狀態(tài)較好的HFL1細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。將HFL1細(xì)胞接種于6孔板，待融合度約為50%時隨機分為3組：對照組(control group), 10% FBS+F12; TGFβ1刺激組(TGFβ1 group), 10% FBS+F12+10 μg/L TGFβ1;米諾地爾加TGFβ1組(Mi+TGFβ1 group), 10% FBS+TGFβ1+5 μmol/L Mi。各組常規(guī)培養(yǎng)48 h。

2 主要試劑

F12培養(yǎng)基和FBS均購自Gibco；米諾地爾購自Sigma；TGFβ1購自PeproTech；抗Smad3和p-Smad3抗體購自Cell Signaling Technology；抗α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)抗體購自Abcam；抗β-actin抗體購于博奧森公司；蛋白酶抑制劑混合物和磷酸酶抑制劑混合物購自Kangchen；超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自Affinity；TRIzol試劑盒購自Invitrogen；Talent熒光定量檢測試劑盒(SYBR Green)購自Tiangen；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Thermo。

3 實驗方法

3.1ELISA實驗 收集經(jīng)分組處理各時點的HFL1細(xì)胞，冰浴制備勻漿，對勻漿液進(jìn)行超聲破碎，5 000 r/min，離心10 min，取上清待測。室溫平衡20 min后鋁箔袋中取出所需的條板，剩余用自封袋密封放回4 ℃，設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50 μL，樣本孔中加入待測樣本50 μL；空白孔不加。除空白孔外，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔每孔加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的檢測抗體100 μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37 ℃水浴鍋或恒溫箱溫育60 min。棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液(350 μL)，靜置1 min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次。每孔加入底物A、B各50 μL，37 ℃避光孵育15 min，每孔加入終止液50 μL，15 min內(nèi)，在450 nm波長處測定各孔的吸光度(A)值。

3.2Western blot實驗 將3組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，用細(xì)胞裂解液(含PIPA裂解液、蛋白酶抑制劑混合物和磷酸酶抑制劑混合物)提取總蛋白，制成蛋白樣品后，SDS-PAGE電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜,封閉,孵育抗β-actin(1 ∶1 000)、LH2(1 ∶1 000)、α-SMA(1 ∶ 500)、膠原蛋白I(collagen I, COLⅠ;1 ∶500)、膠原蛋白IV(collagen IV，COL Ⅳ; 1 ∶500)、Smad3(1 ∶1 000)和p-Smad3(1 ∶500)抗體，4 ℃冰箱過夜。次日洗膜，室溫孵育辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG(1 ∶6 000)和羊抗小鼠IgG(1 ∶6 000)，ECL顯影液曝光，用Image Lab軟件分析。

3.3RT-qPCR實驗 將3組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后收集到無RNA酶EP管中，根據(jù)TRIzol說明書上的步驟提取各組細(xì)胞的總RNA，然后按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書步驟將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，之后聯(lián)合引物按照熒光定量檢測試劑盒說明書操作步驟進(jìn)行RT-qPCR檢測。檢測目的基因的引物序列見表1。

表1 檢測目的基因的引物序列

4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計處理，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組數(shù)據(jù)間比較用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較使用Bonferroni-t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 各組HFL1細(xì)胞中羥基賴氨酰吡啶酚(hydroxylysylpyridinoline, HP)含量的變化

ELISA實驗結(jié)果提示，經(jīng)TGFβ1刺激后，細(xì)胞中HP含量較對照組明顯增多(P<0.01)，但給予米諾地爾處理后其含量減少(P<0.05)，見圖1。

Figure 1. The changes of hydroxylysylpyridinoline contents in each group of HFL1 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05，**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsTGFβ1 group.

圖1 各組HFL1細(xì)胞中羥醛賴氨酰膠原吡啶鏈含量的變化

2 Western blot 檢測結(jié)果

HFL1細(xì)胞經(jīng)TGFβ1刺激后，與對照組比較，總Smad3蛋白水平無明顯變化，p-Smad3、LH2、α-SMA、COLⅠ和COLⅣ的蛋白水平明顯增加；給予米諾地爾干預(yù)后，總Smad3蛋白水平仍無明顯變化，p-Smad3、LH2、α-SMA、COLⅠ和COLⅣ的蛋白水平減少(P<0.05)，見圖2。

3 RT-qPCR實驗結(jié)果

HFL1細(xì)胞經(jīng)TGFβ1刺激后，PLOD2、COLⅠ和α-SMA的mRNA表達(dá)水平明顯上調(diào)；經(jīng)米諾地爾干預(yù)后，PLOD2、COLⅠ和α-SMA的mRNA表達(dá)水平下調(diào)(P<0.05)，其變化趨勢與蛋白質(zhì)的變化相一致，見圖3。

討 論

肺纖維化的特征性病理生理改變包括成纖維細(xì)胞增殖、活化，轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞，這種細(xì)胞可分泌大量膠原纖維沉積于細(xì)胞外基質(zhì)。細(xì)胞蛋白水平的特征性改變主要包括：肌成纖維細(xì)胞的標(biāo)志性蛋白α-SMA表達(dá)水平升高,肺臟主要以表達(dá)COL I、膠原蛋白III(collagen III, COL III)和COL Ⅳ增高為主[15]。

有學(xué)者研究報道致纖維化因子TGFβ1可通過激活TGFβ1/Smads信號通路導(dǎo)致肺纖維化[16]。TGFβ1/Smads信號通路中的Smads蛋白介導(dǎo)了TGFβ1的胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，激活纖連蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)和膠原等肺纖維化相關(guān)靶基因的轉(zhuǎn)錄[17]，使FN、COL I和COL III等細(xì)胞外基質(zhì)蛋白表達(dá)增加，大量ECM沉積，使肺泡結(jié)構(gòu)受到破壞，導(dǎo)致纖維化的發(fā)生發(fā)展。有研究報道，在骨關(guān)節(jié)炎患者的滑膜成纖維細(xì)胞中，TGFβ可誘導(dǎo)LH2b的表達(dá)，其表達(dá)增加導(dǎo)致膠原中吡啶鏈合成增多[18-19]。Gjaltema等[20]研究者分別利用致纖維化的細(xì)胞因子TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3、TNFα、IL-4和activin A刺激人真皮成纖維細(xì)胞后，LH2b的mRNA表達(dá)上調(diào)，COL1A1的mRNA表達(dá)增加。Gjaltema等[21]在體外培養(yǎng)的人真皮成纖維細(xì)胞中的研究中發(fā)現(xiàn)，TGFβ1可上調(diào)PLOD2啟動子的活性，促進(jìn)PLOD2表達(dá)從而促使纖維化的發(fā)生，而這種現(xiàn)象在應(yīng)用TGFβ1中和抗體后消失，提示TGFβ1是PLOD2表達(dá)的上游調(diào)控因子[22]。TGFβ1/Smads通路是纖維化發(fā)病機制中最經(jīng)典和重要的信號通路之一，該通路下游重要的調(diào)控因子Smad3，在纖維化的發(fā)病機制中占有重要地位。那么是否該通路的激活是導(dǎo)致肺纖維化發(fā)生的機制？本實驗體外培養(yǎng)人肺成纖維細(xì)胞，采用人重組TGFβ1因子刺激后，Smad3的活性增強，磷酸化蛋白水平升高，對TGFβ1信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)作用增強，LH2的mRNA和蛋白表達(dá)水平較對照組明顯增高，下游纖維化基因和蛋白表達(dá)增加，特別是羥基化形式的膠原吡啶合成增多，翻譯后修飾的膠原合成增加，沉積細(xì)胞外基質(zhì)，導(dǎo)致肺纖維化的發(fā)生。

Figure 2. The protein levels of LH2, Smad3, p-Smad3, α-SMA, COL I and COL Ⅳ in each group of HFL1 cells determined by Wes-tern blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsTGFβ1 group.

圖2 Western blot檢測不同條件下HFL1細(xì)胞中LH2、Smad3、p-Smad3、α-SMA、COL I和COL Ⅳ的蛋白水平

Figure 3. The mRNA expression of PLOD2, COLⅠ and α-SMA in each group of HFL1 cells detected by RT-qPCR. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsTGFβ1 group.

圖3 各組HFL1細(xì)胞中PLOD2、COLⅠ和α-SMA的mRNA表達(dá)

文獻(xiàn)報道，賴氨酸羥化酶是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜結(jié)合蛋白，作為一類功能性蛋白質(zhì)在人體組織中廣泛表達(dá)，能催化前膠原分子螺旋區(qū)和端肽區(qū)的賴氨酸殘基羥基化而影響膠原交聯(lián)的形成[23]。分子間交聯(lián)是膠原形成中的一個重要的翻譯后修飾過程[11]。正常的肺組織中，膠原交聯(lián)主要來自醛賴氨酸途徑。但在纖維化的肺組織中，膠原分子間交聯(lián)主導(dǎo)途徑發(fā)生轉(zhuǎn)化，即由醛賴氨酸途徑向羥醛賴氨酸途徑轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致羥基化的吡啶交聯(lián)增加。有報道：在皮膚纖維化病變，如肥厚性瘢痕，瘢痕瘤，系統(tǒng)性硬化癥和脂性硬皮病中觀察到羥醛賴氨酸吡啶交聯(lián)增加[9, 24-25]。在肝臟纖維化病灶如寄生蟲性肝硬化、病毒性肝硬化、酒精性肝硬化和腎臟纖維化病變?nèi)缒I小球硬化癥中羥醛賴氨酸吡啶交聯(lián)均增加[9-10]。在肺臟腫瘤基質(zhì)中的研究發(fā)現(xiàn)，羥醛賴氨酸來源膠原吡啶交聯(lián)增加[26]。在人滑膜骨關(guān)節(jié)成纖維細(xì)胞中研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源性TGFβ使滑膜LH2表達(dá)增加，引起LP和HP增加，導(dǎo)致膠原分子的總吡啶鏈增加[18]。在本實驗中發(fā)現(xiàn)TGFβ1可通過激活Smad3信號通路，使LH2活性增強，基因和蛋白表達(dá)水平上調(diào)，羥基化的膠原吡啶合成增多。并誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化(fibroblast-mesenchymal transition，F(xiàn)MT)，肌成纖維細(xì)胞可分泌大量的膠原，導(dǎo)致纖維化相關(guān)蛋白合成明顯增多，這表明TGFβ1能誘導(dǎo)HFL1細(xì)胞發(fā)生FMT的過程，導(dǎo)致間質(zhì)標(biāo)志性標(biāo)志物COL Ⅰ和α-SMA的mRNA和蛋白水平表達(dá)明顯上調(diào)。然而米諾地爾通過抑制TGFβ1誘導(dǎo)的HFL1細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化這一過程，纖維化標(biāo)志性蛋白表達(dá)水平下調(diào)，羥醛賴氨酰膠原吡啶鏈合成減少，細(xì)胞外基質(zhì)蛋白膠原Ⅰ和膠原Ⅳ合成均減少，細(xì)胞外基質(zhì)膠原沉積減少，阻礙了肺纖維化的發(fā)生發(fā)展。

本實驗也還有很多不足之處，如米諾地爾如何干預(yù)信號通路的傳導(dǎo)，從而影響下游賴氨酸羥化酶基因和蛋白的表達(dá)變化，細(xì)胞外基質(zhì)膠原沉積是否還與基質(zhì)金屬蛋白酶及其組織抑制因子的表達(dá)變化有關(guān)，相關(guān)機制還需進(jìn)一步研究闡明。