5-氮雜胞苷逆轉(zhuǎn)SARI基因甲基化對(duì)人乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)和侵襲的影響*

朱文斌， 蔣瑞雪， 陳紹仁， 胡 芳， 劉繼鑫， 孫艷宏， 姚淑娟， 呂麗艷， 張 暢， 孫 艷△， 張春晶△

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院 1醫(yī)藥科學(xué)研究院， 2醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院， 黑龍江 齊齊哈爾 161006)

乳腺癌是女性常見(jiàn)的惡性實(shí)體腫瘤，嚴(yán)重威脅著女性的生命安全[1]。乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展是遺傳因素和非遺傳因素相互作用的結(jié)果。隨著對(duì)乳腺癌研究的深入，DNA甲基化和染色質(zhì)構(gòu)象改變等表觀遺傳學(xué)現(xiàn)象在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[2-3]。乳腺癌的發(fā)生發(fā)展與DNA甲基化異常關(guān)系密切，乳腺癌中有多個(gè)基因啟動(dòng)子甲基化異常[4]。SARI(suppressor of activator protein-1 regulated by interferon)基因又名BATF2基因，定位于染色體11q12與11q13之間，在星形膠質(zhì)細(xì)胞、黑色素細(xì)胞、乳腺細(xì)胞以及前列腺上皮細(xì)胞等多種正常組織細(xì)胞中均有表達(dá)，但在對(duì)應(yīng)的腫瘤組織細(xì)胞中低表達(dá)或表達(dá)缺失[5]。SARI是 Su等[6]于2008年發(fā)現(xiàn)的一種抑癌基因，可以通過(guò)抑制AP-1轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄活性，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。研究表明，乳腺癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)SARI可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，但SARI基因啟動(dòng)子在乳腺癌細(xì)胞中甲基化的情況鮮有報(bào)道[7]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究5-氮雜胞苷(5-azacytidine, 5-Aza)處理乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231后SARI基因啟動(dòng)子甲基化水平、mRNA及蛋白表達(dá)水平的改變情況，探討SARI基因啟動(dòng)子甲基化在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

材 料 和 方 法

1 細(xì)胞與試劑

人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。胎牛血清購(gòu)自HyClone；L-15培養(yǎng)液購(gòu)自Gibco；TRIzol Reagent試劑購(gòu)自Invitrogen；DNA提取試劑盒和PCR試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司；RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自TaKaRa；EZ DNA Methylation-Gold Kit購(gòu)自Zymo Research；5-氮雜胞苷和MTT試劑購(gòu)自Sigma；抗GAPDH抗體購(gòu)自CST；抗SARI抗體購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；羊抗兔Ⅱ抗購(gòu)自Abcam；Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自凱基公司；引物由上海生工生物有限公司合成。

2 主要方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng) MDA-MB-231細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的L-15培養(yǎng)液中，培養(yǎng)條件為37 ℃、無(wú)二氧化碳的飽和濕度培養(yǎng)箱。

2.2藥物配制[4,8]用培養(yǎng)液配制100 μmol/L的5-氮雜胞苷儲(chǔ)存液，取融合度60%的MDA-MB-231細(xì)胞分別加入終濃度為5 μmol/L(低劑量組)和10 μmol/L(高劑量組)的5-氮雜胞苷儲(chǔ)存液，37 ℃恒溫培養(yǎng)，每24 h更換新鮮含藥培養(yǎng)液，培養(yǎng)72 h。

2.3DNA提取及重亞硫酸鹽處理 采用血液/組織/細(xì)胞基因組提取試劑盒(Tiangen)抽提MDA-MB-231細(xì)胞基因組DNA。應(yīng)用EZ DNA Methylation-Gold試劑盒對(duì)提取的DNA進(jìn)行重亞硫酸鹽處理。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)所述方法進(jìn)行操作。

2.4甲基化特異性PCR(methylation-specific PCR，MSP)檢測(cè) 采用Methyl Primer Express 1.0設(shè)計(jì)SARIMSP引物:甲基化上游引物序列為5’-TAGGTAGATTACGAGGTTAGGAGATC-3’，下游引物序列為5’-GCCCAAACTAAAATACAATAACTCG-3’,擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度206 bp；非甲基化上游引物序列為5’-TAGGTAGATTATGAGGTTAGGAGATTGA-3’，下游引物序列為5’-TCACCCAAACTAAAATACAATAACTCA-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度208 bp。 PCR體系為25 μL，采用重亞硫酸處理過(guò)的DNA作為模板。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性20 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min后結(jié)束。采用瓊脂糖凝膠電泳對(duì)擴(kuò)增后產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。

2.5RNA提取及RT-PCR檢測(cè) 采用TRIzol Reagent提取細(xì)胞總RNA后進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。SARI的上游引物序列為5’-GGCAGAAGCACACAGACAAGGC-3’，下游引物序列為5’-GAGCTGAGCAGGAGGCACAATC-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為177 bp；β-actin的上游引物序列為5’-CGTGCGTGACATTAAGGAGAAG-3’，下游引物序列為5’-GGAAGGAAGGCTGGAAGAGTG-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為175 bp。RT-PCR體系為25 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min后結(jié)束。采用瓊脂糖凝膠電泳對(duì)擴(kuò)增后產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。

2.6Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá) 660×g離心5 min收集細(xì)胞，加入120 μL RIPA裂解液冰上裂解，每隔5 min渦旋振蕩1次，30 min后15 840×g離心10 min，收集上清并用BCA法對(duì)蛋白濃度進(jìn)行測(cè)定，常規(guī)進(jìn)行SDS-PAGE、轉(zhuǎn)膜、封閉后加入SARI抗體(1∶500稀釋)4 ℃孵育過(guò)夜，洗膜后加入兔Ⅱ抗(1∶2 000稀釋)37 ℃孵育40 min，曝光，以GAPDH為內(nèi)參照。

2.7MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力抑制率 按每孔0.5×104個(gè)接種MDA-MB-231細(xì)胞于96孔板中，每孔150 μL培養(yǎng)液，5-Aza處理后每隔24 h進(jìn)行檢測(cè)，每孔加入20 μL MTT溶液(5 g/L)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄去培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO溶液，劇烈振蕩10 min后在490 nm波長(zhǎng)下進(jìn)行檢測(cè)。

2.8集落形成實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA-MB-231細(xì)胞，胰酶消化后制成單細(xì)胞懸液，以每孔3 000 個(gè)接種細(xì)胞于6孔板中，連續(xù)培養(yǎng)15 d；棄去培養(yǎng)液，PBS清洗3次，甲醇固定15 min，結(jié)晶紫染色20 min，流水沖洗，空氣干燥。顯微鏡下計(jì)數(shù)大于50個(gè)細(xì)胞的集落數(shù)，并計(jì)算集落形成率=集落數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%。

2.9Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn) 將Transwell小室置入24孔板內(nèi)，無(wú)血清L-15培養(yǎng)液和Matrigel以9∶1的比例混合，取70 μL混合液鋪于濾膜上室。取200 μL MDA-MB-231單細(xì)胞懸液(1×104個(gè))接種于上室，下室加入含6%血清的L-15培養(yǎng)液置于37 ℃、無(wú)CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h。取出小室，4%多聚甲醛固定30 min，結(jié)晶紫染色20 min，待小室干燥后利用光學(xué)顯微鏡觀察計(jì)數(shù)，每個(gè)小室隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)算平均值。

2.10流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 胰酶消化后收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞，按照凱基凋亡檢測(cè)試劑盒操作步驟處理細(xì)胞后，流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)算數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 5-Aza處理后SARI啟動(dòng)子甲基化水平的變化

5-Aza處理MDA-MB-231細(xì)胞72 h后分別擴(kuò)增SARI甲基化和非甲基化PCR產(chǎn)物，經(jīng)5-Aza處理72 h后，與對(duì)照組相比，低劑量組和高劑量組SARI基因啟動(dòng)子甲基化水平顯著下降(P<0.01)，見(jiàn)圖1。

2 5-Aza處理后SARI mRNA表達(dá)水平變化

MDA-MB-231細(xì)胞中SARI mRNA表達(dá)水平較低，經(jīng)5-Aza處理72 h后，與對(duì)照組相比，低劑量和高劑量組中SARI mRNA表達(dá)顯著升高(P<0.05或P<0.01)，見(jiàn)圖2。

3 5-Aza處理后SARI蛋白表達(dá)水平的變化

MDA-MB-231細(xì)胞中SARI蛋白表達(dá)水平較低，經(jīng)5-Aza處理72 h后，與對(duì)照組相比，低劑量組和高劑量組中SARI蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05,P<0.01)，見(jiàn)圖3。

4 5-Aza處理對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

不同濃度5-Aza處理MDA-MB-231細(xì)胞，分別于24、48和72 h用MTT檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)活性的影響。與對(duì)照組相比，低劑量組和高劑量組細(xì)胞活力均顯著下降(P<0.05)，見(jiàn)圖4。

Figure 1. The effects of 5-Aza on the methylation ofSARIgene promoter in MDA-MB-231 cells. M: methylated; U: unmethylated. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group.

圖1 5-Aza對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞SARI基因啟動(dòng)子甲基化的影響

Figure 2. The effects of 5-Aza on the mRNA expression of SARI in MDA-MB-231 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖2 5-Aza對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞SARI mRNA表達(dá)的影響

Figure 3. The effects of 5-Aza on the expression of SARI protein in MDA-MB-231 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖3 5-Aza對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞SARI蛋白表達(dá)的影響

Figure 4. The effects of 5-Aza on the viability of MDA-MB-231 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖4 5-Aza對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞活力的影響

同時(shí)，集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組、低劑量組和高劑量組細(xì)胞集落形成率分別為(65.37±5.14)%、(50.73±4.91)%和(31.57±6.27)%，與對(duì)照組相比，低劑量組和高劑量組細(xì)胞集落形成率顯著下降(P<0.05)，見(jiàn)圖5。本結(jié)果與MTT檢測(cè)結(jié)果一致，間接反映了細(xì)胞增殖能力的變化。

5 5-Aza處理對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞侵襲的影響

Transwell小室細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組、低劑量組和高劑量組穿膜細(xì)胞數(shù)分別為421±69、243±47和108±58，與對(duì)照組相比，5-Aza處理后細(xì)胞的侵襲力顯著減弱(P<0.05或P<0.01)，見(jiàn)圖6。

Figure 5. The effects of 5-Aza on the colony-forming ability of MDA-MB-231 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖5 5-Aza對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞集落形成能力的影響

6 5-Aza處理對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的影響

流式實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組、低劑量組和高劑量組細(xì)胞凋亡率分別為(2.64±0.36)%、(15.17±1.47)%和(35.37±2.69)%，與對(duì)照組相比，5-Aza處理后細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.01)，見(jiàn)圖7。

討 論

DNA甲基化異常在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮了重要作用?；騿?dòng)子區(qū)域甲基化異常升高，可以導(dǎo)致諸如細(xì)胞周期調(diào)節(jié)基因、抑癌基因和凋亡基因等重要調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄沉默，使得相關(guān)基因表達(dá)降低或表達(dá)缺失，從而促進(jìn)腫瘤形成[9]。研究表明，乳腺癌發(fā)生時(shí)常檢測(cè)到多個(gè)基因甲基化異常，例如BRCA1、APC、CHST11、RASSF1A、P16INK4a和RUNX3等抑癌基因啟動(dòng)子在乳腺癌組織中均存在不同程度的甲基化異常，并且甲基化率顯著高于癌旁或正常組織[10-16]。SARI基因在結(jié)直腸癌、肺癌、前列腺癌、肝癌和食管癌等癌癥組織中的表達(dá)均低于與其相對(duì)應(yīng)的癌旁或正常組織[17]。雖然SARI基因在多種腫瘤細(xì)胞中的作用已被揭示，但SARI基因啟動(dòng)子甲基化與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系鮮有報(bào)道。5-Aza是一種高效的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase, DNMT)抑制劑，可以通過(guò)與DNMT的結(jié)合而逆轉(zhuǎn)基因的甲基化過(guò)程，恢復(fù)被沉默基因的表達(dá)和功能[18]。因此，本研究利用5-Aza逆轉(zhuǎn)SARI基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)并觀察其對(duì)乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231的作用。

Figure 6. The effects of 5-Aza on invasion ability of MDA-MB-231 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖6 5-Aza對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞侵襲能力的影響

Figure 7. The effects of 5-Aza on apoptosis of MDA-MB-231 cells detected by flow cytometry．Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group.

圖7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)5-Aza對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的影響

AP-1在90%的人類(lèi)腫瘤中都有活性增高的情況發(fā)生，而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞中SARI的表達(dá)能夠抑制腫瘤細(xì)胞增殖并且促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡[19]。Zhang等[20]利用AG490對(duì)乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231進(jìn)行處理，結(jié)果顯示AG490能夠通過(guò)上調(diào)SARI的表達(dá)抑制細(xì)胞增殖。本研究結(jié)果與之相似，利用5-Aza處理乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231后，5-Aza可以通過(guò)逆轉(zhuǎn)SARI基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)，上調(diào)SARI基因mRNA和蛋白的表達(dá)從而抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。SARI不僅具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖和促進(jìn)其凋亡的作用，還能夠抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。在結(jié)直腸癌細(xì)胞系中過(guò)表達(dá)SARI可以抑制其細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，SARI還能夠通過(guò)抑制MET啟動(dòng)子的活性，抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲和遷移[21]。本研究中，SARI表達(dá)上調(diào)后同樣抑制了乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231細(xì)胞的侵襲能力。

綜上所述，SARI基因啟動(dòng)子異常甲基化是導(dǎo)致其在MDA-MB-231細(xì)胞中低表達(dá)的主要原因，這可能對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生影響。而通過(guò)藥物能夠逆轉(zhuǎn)SARI基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)，促進(jìn)其基因表達(dá)，恢復(fù)其抗癌作用。因此，深入闡明SARI基因異常甲基化與乳腺癌之間的關(guān)系可為乳腺癌的臨床防治提供一種新的策略，但其在乳腺癌的臨床診斷和治療中的應(yīng)用尚待深入研究。