褪黑素干預(yù)動(dòng)脈性肺動(dòng)脈高壓大鼠的實(shí)驗(yàn)研究

楊婉琳，楊德輝，湯瑜昳，易定鋒

(解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九二一醫(yī)院心血管內(nèi)科，長(zhǎng)沙 410022)

動(dòng)脈性肺動(dòng)脈高壓(pulmonary arterial hypertension,PAH)是一種嚴(yán)重的進(jìn)行性疾病，其特點(diǎn)是肺血管阻力和動(dòng)脈壓升高，導(dǎo)致右心室肥厚，最終導(dǎo)致右心力衰竭[1]。PAH的病理變化主要包括炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、平滑肌細(xì)胞增殖，進(jìn)而肺血管收縮、管腔變窄，導(dǎo)致肺血流受限[2,3]。目前關(guān)于PAH的治療主要是對(duì)癥治療，以血管舒張為主，但這些療法只是改善臨床癥狀或延緩疾病的進(jìn)展，盡管臨床醫(yī)師做出了巨大的努力，但PAH的死亡率仍然居高不下。目前，治療PAH急需新的方法和更有效的藥物[4]。褪黑素(melatonin,MEL)是松果體產(chǎn)生的一種神經(jīng)內(nèi)分泌激素，在調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律方面發(fā)揮重要作用。MEL以對(duì)自由基強(qiáng)大的清除能力和高親脂性而聞名，可以抑制肺組織炎癥，降低肺氧化應(yīng)激標(biāo)志物水平，增強(qiáng)酶和非酶抗氧化能力，從而減少肺組織損傷[5]，同時(shí)，其經(jīng)濟(jì)性和安全性兩大特點(diǎn)確保了長(zhǎng)期的臨床應(yīng)用[6,7]。鑒于此，我們猜想MEL是否對(duì)PAH具有潛在的治療作用，若具有治療作用，這種作用是否通過(guò)抗炎、抗氧化應(yīng)激來(lái)發(fā)揮作用？為進(jìn)一步驗(yàn)證該猜想，我們建立野百合堿(monocrotaline,MCT)誘導(dǎo)的大鼠PAH模型，給予MEL進(jìn)行干預(yù), 通過(guò)觀察相關(guān)指標(biāo)的變化規(guī)律探討MEL對(duì)PAH作用的機(jī)制，旨在為MEL治療PAH提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

36只健康成年雄性大鼠，180～220 g，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司；MEL購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；MCT購(gòu)自湖南BioRike公司；環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)一抗購(gòu)自Immunoway公司；免疫組織化學(xué)試劑盒購(gòu)自湖南BioRike公司。

1.2 動(dòng)物分組

按隨機(jī)數(shù)表法將大鼠分為對(duì)照組、造模組(MCT)和干預(yù)組(MCT + MEL)，每組12只。造模組和干預(yù)組分別按50 mg/kg(2.5 ml/kg)規(guī)格腹膜內(nèi)注射MCT溶液(MCT溶于無(wú)水乙醇 + 生理鹽水混合液)以制作PAH模型[8]。對(duì)照組接受單次腹膜內(nèi)注射單位等體積溶媒,即2.5 ml/kg。造模后第1～28天，干預(yù)組每天予以MEL 10 mg/kg(MEL溶于無(wú)水乙醇 + 生理鹽水中，使?jié)舛冗_(dá)10 ml/kg)腹膜內(nèi)注射1次，對(duì)照組和造模組每日予以單位等體積溶媒腹膜內(nèi)注射1次。28 d后到達(dá)實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)，進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的觀察與評(píng)估。

1.3 指標(biāo)檢測(cè)

1.3.1 平均肺動(dòng)脈壓及右心室肥厚指數(shù) 以3 ml/kg的劑量腹膜內(nèi)注射10%水合氯醛溶液麻醉大鼠。根據(jù)參考文獻(xiàn)[9-12]中的測(cè)壓方法，測(cè)定平均肺動(dòng)脈壓(mean pulmonary artery pressure,mPAP)。導(dǎo)管測(cè)壓結(jié)束后，處死大鼠，取出心臟，分離右心室(right ventricular,RV)、左心室 + 室間隔(left ventricular + septum,LV + S)，稱(chēng)質(zhì)量，計(jì)算右心室肥厚指數(shù)(right ventricular hypertrophy index,RVHI)，RVHI=RV/(LV + S)。

1.3.2 HE染色觀察肺小動(dòng)脈形態(tài)學(xué)變化 取肺組織經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、展片、烤片制作石蠟切片，行HE染色。選取血管直徑在50～200 μm的肺小動(dòng)脈作為觀察對(duì)象。在400倍光學(xué)顯微鏡下從每個(gè)切片中隨機(jī)選取5條肺小動(dòng)脈，測(cè)量血管壁厚度(vascular wall thickness,WT)、血管外徑(vascular external diameter,ED)、血管腔面積(vascular lumen area,IA)、血管總面積(total vascular area,TA)，計(jì)算肺小動(dòng)脈管壁厚度占血管外徑的百分比(wall thickness/vascular external diameter,WT%)和肺小動(dòng)脈血管壁面積占血管總面積的百分比(vascular area/total vascular area,WA%)，WT%=(2×WT/ED)×100%，WA%=(TA-IA)/TA×100%。

1.3.3 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)COX-2表達(dá) 將肺組織石蠟切片經(jīng)脫蠟水洗、抗原修復(fù)、血清封閉、加一抗、二抗、顯色、復(fù)染、脫水、透明、封膠一系列免疫組織化學(xué)步驟后，在400倍光學(xué)顯微鏡下觀察肺小動(dòng)脈的COX-2陽(yáng)性表達(dá)區(qū)域(area of interest,AOI)，使用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)確定積分吸光度值(integral absorbance value,IA)，并計(jì)算單位肺小動(dòng)脈COX-2陽(yáng)性表達(dá)面積的平均光密度值(average optical density,AOD)，AOD =IA/AOI。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 試驗(yàn)終點(diǎn)3組大鼠存活情況

對(duì)照組全部存活，造模組于第24、26天各死亡1只，干預(yù)組于第27天死亡1只，大鼠在死亡前均有嚴(yán)重的呼吸困難。

2.2 3組大鼠mPAP和RVHI比較

對(duì)各組剩余大鼠進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)觀察。mPAP在對(duì)照組、造模組及干預(yù)組大鼠中的水平依次為(14.30±0.82)、(27.70±2.41)和(20.30±1.89)mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)，RVHI水平依次為(0.219±0.031)、(0.418±0.093)和(0.297±0.033)。與對(duì)照組相比，造模組大鼠mPAP及RVHI水平均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(mPAP：P<0.001；RVHI：P<0.001)。與造模組相比，干預(yù)組大鼠mPAP和RVHI水平均有不同程度的降低，但仍高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(mPAP：P<0.001；RVHI：P<0.001)。

2.3 3組大鼠肺小動(dòng)脈HE染色及WA%、WT%比較

對(duì)照組肺小動(dòng)脈結(jié)構(gòu)清晰，壁薄均勻，管腔面積大；造模組肺小動(dòng)脈管壁增厚，管腔狹窄，平滑肌細(xì)胞增生、排列紊亂；干預(yù)組管壁增厚、管腔狹窄、平滑肌細(xì)胞增生情況改善，肺小動(dòng)脈血管重構(gòu)情況改善(圖1)。WT%在對(duì)照組、造模組及干預(yù)組大鼠中的水平依次為(24.77±2.46)%、(51.25±5.87)%和(31.46±4.09)%，WA%水平依次為(30.15±4.07)%、(55.49±6.87)%和(39.87±5.11)%。與對(duì)照組相比，造模組肺小動(dòng)脈WT%及WA%均增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。與造模組相比，干預(yù)組肺小動(dòng)脈WT%和WA%均顯著降低，但高于對(duì)照組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。

2.4 3組大鼠肺組織COX-2表達(dá)比較

免疫組化結(jié)果顯示肺小動(dòng)脈內(nèi)皮及平滑肌細(xì)胞胞質(zhì)中COX-2蛋白表達(dá)呈棕黃色，肺小動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞核呈藍(lán)色。對(duì)照組肺小動(dòng)脈未見(jiàn)明顯COX-2蛋白表達(dá)，管壁較薄、管腔面積大；造模組肺小動(dòng)脈可見(jiàn)大量深棕黃色COX-2蛋白表達(dá)，且管壁增厚、管腔狹窄；干預(yù)組COX-2蛋白表達(dá)減少，管壁增厚、管腔狹窄情況改善(圖2)。COX-2在對(duì)照組、造模組及干預(yù)組的表達(dá)水平分別為(0.248±0.059)、(0.629±0.098)和(0.406±0.062)。相比對(duì)照組，造模組大鼠肺小動(dòng)脈COX-2表達(dá)量增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。給予MEL干預(yù)后，相比于造模組，COX-2蛋白的表達(dá)水平顯著下降，但較對(duì)照組仍相對(duì)較高，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。

2.5 COX-2表達(dá)與mPAP、RVHI、WT%、WA%的相關(guān)性分析

大鼠肺組織中COX-2的表達(dá)水平與mPAP、RVHI、WT%及WA%呈正相關(guān)(r分別為0.836、0.749、0.823、0.821，P均<0.01)。

3 討 論

近20年國(guó)內(nèi)外研究者為開(kāi)發(fā)有效的PAH治療方法做了大量的努力。目前治療PAH主要是通過(guò)影響血管收縮的病理改變，達(dá)到促進(jìn)血管擴(kuò)張、改善疾病癥狀的效果[13]。但這些療法不能阻止疾病的進(jìn)展或逆轉(zhuǎn)疾病進(jìn)程，因大多數(shù)患者仍然死于該病或?qū)λ幬镏委煼磻?yīng)不足，導(dǎo)致5年生存率僅為59%，即對(duì)死亡率的影響非常有限。鑒于此，臨床上迫切需要新的藥物來(lái)更好地治療PAH[14]。研究認(rèn)為，PAH發(fā)病是血管收縮、血管重塑、炎癥等多種因素相互作用的結(jié)果[15]。因此，越來(lái)越多的相關(guān)研究涉及到PAH發(fā)展的分子途徑，其中炎癥被認(rèn)為是PAH血管重塑的重要因素[16,17]。肺血管受損時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量的炎癥介質(zhì)并招募炎癥細(xì)胞，后者能持續(xù)性地釋放包括生長(zhǎng)因子在內(nèi)的炎性細(xì)胞因子，促進(jìn)肺組織中的膠原沉積、平滑肌異常增殖和肺血管收縮的重塑，從而增加肺血管阻力[18]。

圖1 各組大鼠肺小動(dòng)脈形態(tài)學(xué)變化

圖2 各組大鼠肺組織COX-2表達(dá)情況

MCT誘導(dǎo)的PAH大鼠模型是目前最常用的PAH建模方法之一，該建模方法引起的大鼠肺組織病理改變與臨床PAH相似[18]。本研究旨在探討MEL對(duì)MCT誘導(dǎo)的PAH治療效果及對(duì)COX-2表達(dá)的影響，結(jié)果證實(shí)腹膜內(nèi)注射MEL對(duì)大鼠PAH模型的形成具有顯著抑制作用。有研究表明，MEL能夠抑制氧化應(yīng)激、減輕炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡[19]。MEL在氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)中是一種強(qiáng)大而有效的自由基清除劑，可以通過(guò)降低氧化應(yīng)激保護(hù)細(xì)胞、組織和器官免受氧化損傷，并部分逆轉(zhuǎn)纖維化，且不具有毒性或誘變作用。具體機(jī)制可能為MEL作為抗氧化劑可以保護(hù)線粒體和核DNA，降低氧化應(yīng)激水平，抑制肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖，緩解肺動(dòng)脈高壓[20]。

在這項(xiàng)研究中，我們的結(jié)果發(fā)現(xiàn)MEL干預(yù)可以降低mPAP及RVHI水平，提示其對(duì)減少心肺損傷程度具有一定作用。免疫組織化學(xué)法證實(shí)肺小動(dòng)脈WT%和WA%有所改善，提示肺組織炎性浸潤(rùn)及肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖程度有所下降。COX-2作為一種常見(jiàn)的炎癥介質(zhì)，很少在正常上皮細(xì)胞中表達(dá)，但在發(fā)育不良細(xì)胞和癌細(xì)胞中表達(dá)量較高，尤其在炎性細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞中均存在一定程度的表達(dá)[21]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)COX-2蛋白在造模組肺組織中的表達(dá)顯著高于對(duì)照組，經(jīng)MEL干預(yù)后，水平顯著下降。相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，COX-2的表達(dá)水平與mPAP、RVHI、WT%及WA%均呈顯著正相關(guān)，這些就提示，MEL可能是通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)和下調(diào)COX-2表達(dá)來(lái)減弱肺血管重塑。

綜上所述，MEL能夠降低MCT誘導(dǎo)的PAH大鼠的肺動(dòng)脈壓，改善肺血管重塑，這可能與其能抑制肺組織中COX-2表達(dá)有關(guān)。盡管本研究只是在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)水平上證明了MEL治療PAH的可行性與有效性，但至少證明了我們實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的有效性和MEL對(duì)PAH保護(hù)的可靠性。首先，MEL具有靶向性強(qiáng)、毒性低、成本低等優(yōu)點(diǎn)，是近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。其次，昂貴的醫(yī)療費(fèi)用是患者臨床治療依從性差的一大主因，而PAH治療效果有限在一定程度上可歸因于藥物不足。因此MEL可能是一種潛在的PAH藥物，但仍需進(jìn)一步研究以明確具體分子靶點(diǎn)介導(dǎo)MEL對(duì)PAH的保護(hù)作用。