蜂膠與β-環(huán)糊精復(fù)合物在西番蓮果汁飲料中的應(yīng)用研究

杜天雨，耿倩倩，陳立府，李玉潔，梁孟達(dá)，史培穎，繆曉青，4，吳珍紅，4，*

（1.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建福州350002；2.福建農(nóng)林大學(xué)蜂療研究所，福建福州350002；3.天然生物毒素國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，福建福州350002；4.福建農(nóng)林大學(xué)蜂學(xué)學(xué)院，福建福州350002）

蜂膠是一種天然成分，是由蜜蜂采集植物芽孢或樹干上的樹脂，混入腭腺分泌物和蜂蠟加工而成的芳香氣性膠狀固體物[1-2]。研究表明，蜂膠中富含天然酚類[3]和黃酮類化合物[4]。這些天然活性成分賦予了蜂膠抗菌[5]、抗病毒[6]、抗氧化[7]、抗炎[8]、抗腫瘤[9]和降血糖[10]等生物活性。因此，蜂膠已經(jīng)在醫(yī)療器械、非處方藥劑、保健食品和飲料、化妝品等多個(gè)領(lǐng)域被開發(fā)應(yīng)用[11]。然而，蜂膠也有一些不利特征，包括高黏度、有刺激性味道、水溶性差、對(duì)光和熱敏感、生物利用率低等，阻礙了其在食品、化工和醫(yī)療行業(yè)的應(yīng)用[12]。β-環(huán)糊精（βcyclodextrin，β-CD）是由 7 個(gè)葡萄糖殘基以 α-1，4-糖苷鍵連接而成的環(huán)狀化合物，具有親水的外圍及疏水的內(nèi)腔，在溶液中可與多種有機(jī)物形成包合物[13]，是一種優(yōu)質(zhì)的藥物載體[14]和食品包埋劑[15]。因此，考慮用β-環(huán)糊精包合蜂膠，以改善蜂膠的不利特征。與β-CD 復(fù)合后，蜂膠乙醇提取物（ethanol extract of propolis，EEP）的水溶性顯著提高，直接將其添加到西番蓮果汁飲料中，可以充分溶解，易于被人體吸收。而且EEP-βCD的熱穩(wěn)定好，西番蓮果汁飲料巴氏殺菌過程對(duì)其抗氧化活性影響小。

西番蓮，別名百香果、雞蛋果，是西番蓮科西番蓮屬木質(zhì)藤本植物的果實(shí)，呈橢圓形，果皮呈紫色或黃色，果肉呈黃色液體狀，籽粒多、果皮和果肉都有很濃的香味[16]。西番蓮果汁營(yíng)養(yǎng)豐富，含有多種有機(jī)酸、氨基酸和礦物質(zhì)，此外還富含天然活性成分酚類和黃酮類化合物，如兒茶素、槲皮素和山奈酚等，有益于人體健康[17-18]。西番蓮豐富的營(yíng)養(yǎng)和獨(dú)特的風(fēng)味使其深受消費(fèi)者的喜愛。在我國(guó)福建、廣東、廣西、云南和四川等地種植，市場(chǎng)開發(fā)前景廣闊。特別地，福建省將西番蓮作為一種重點(diǎn)開發(fā)、種植和推廣的農(nóng)產(chǎn)品，為農(nóng)民增收、經(jīng)濟(jì)發(fā)展增添動(dòng)力。然而，由于西番蓮特殊的果肉結(jié)構(gòu)，在對(duì)其深加工時(shí)，不能直接榨汁。本試驗(yàn)探究了一種西番蓮制備果汁的工藝，先高速攪拌，打碎果肉的粗纖維，隨后酶解，分解果肉纖維和果膠，離心過濾均質(zhì)后，西番蓮果汁均勻無沉淀。幾乎將果肉中除籽粒部分全部轉(zhuǎn)化為果汁，試驗(yàn)結(jié)果表明，西番蓮出汁率可達(dá)81.7%。將前處理和酶解過程與西番蓮去皮去籽榨汁機(jī)聯(lián)合使用，西番蓮的出汁率和榨汁效率都將得到提升。

目前有報(bào)道將蜂膠乙醇提取物（EEP）添加在果汁飲料中[19]，但是還沒有關(guān)于蜂膠乙醇提取物與β-環(huán)糊精的復(fù)合物（EEP-βCD）在果汁飲料中的應(yīng)用研究。在本研究中，用 β-CD 與 EEP 復(fù)合制備 EEP-βCD，探究β-CD 對(duì)EEP 水溶性、熱穩(wěn)定性和刺激性味道的影響，并首次將EEP-βCD 作為一種功能活性成分添加到西番蓮果汁飲料中，旨在為EEP-βCD 在西番蓮功能性果汁飲料中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

蜂膠：福建省神蜂科技開發(fā)有限公司；西番蓮：廣東晶東貿(mào)易有限公司；β-環(huán)糊精、無水乙醇、氫氧化鈉、亞硝酸納、亞硝酸鋁、碳酸鈉：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，均為分析純；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品、木糖醇：美國(guó) sigma 公司；纖維素酶（5 萬 U/g）、果膠酶（10 萬 U/g）、α-淀粉酶（1 萬 U/g）、福林酚試劑：北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器和設(shè)備

CP224C 先行者分析天平：奧豪斯儀器有限公司；UV759CRT 紫外可見光分光光度計(jì)：上海佑科儀器儀表有限責(zé)任公司；3K15 通用臺(tái)式冷凍離心機(jī)：美國(guó)Sigma 公司；DK-8D 型電熱恒溫水槽：上海恒一科技有限公司；RE52CS 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；LGJ-18S 冷凍干燥機(jī)：北京四環(huán)科學(xué)儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 制備蜂膠乙醇提取物及其β-環(huán)糊精復(fù)合物

將蜂膠冷凍，快速粉碎，加入70%乙醇溶液中超聲混勻，搖床浸提24 h 后，浸提3 次，過濾得提取液，再進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇，將剩余液體冷凍干燥8 h，得到蜂膠乙醇提取物（EEP）凍干粉，-80 ℃下冷藏。

精確稱取18.5 g β-環(huán)糊精，加入1 L 超純水，在25 ℃水浴下溶解，制得1.85%的β-環(huán)糊精飽和溶液。用70%乙醇溶解EEP，制得3%蜂膠溶液，按體積比1 ∶2 緩慢加入到β-環(huán)糊精飽和溶液中，充分混勻后靜置18 h，除去上清液，將沉淀物冷凍干燥8 h，制得β-環(huán)糊精與蜂膠乙醇提取物復(fù)合物（EEP-βCD）凍干粉，-80 ℃下冷藏。

1.3.2 EEP 和EEP-βCD 總酚、總黃酮含量以及抗氧化活性測(cè)定

稱取0.05 g EEP 凍干粉，加70%乙醇充分溶解后，定容至25 mL，制得2 mg/mL EEP 備用。稱取0.05 g EEP-βCD 凍干粉，加水充分溶解后，定容至25 mL，制得 2 mg/mL EEP-βCD 備用。

1.3.2.1 總酚含量測(cè)定

總酚含量采用Folin-Ciocalteu 法[20]測(cè)定。準(zhǔn)確移取3 mL 樣品溶液，加入1 mL 福林酚試劑，然后加入5 mL 1 mol/L 碳酸鈉水溶液，用蒸餾水定容至10 mL，混合均勻后，（25±2）℃下避光放置1 h，測(cè)定760 nm波長(zhǎng)處的吸光度。將對(duì)照品沒食子酸配成0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，準(zhǔn)確量取上述標(biāo)準(zhǔn)液0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL，按照上述方法制定標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2.2 總黃酮含量測(cè)定

總黃酮含量測(cè)定采用亞硝酸鋁比色法測(cè)定[21]。準(zhǔn)確移取2.5 mL 樣品溶液到25 mL 容量瓶，加5%NaNO2溶液1 mL，使混勻，放置6 min，加10%Al（NO3）3溶液1 mL，搖勻，放置 6 min，加 4%NaOH 溶液 10 mL，再加水至刻度，搖勻，放置15 min。測(cè)定510 nm 波長(zhǎng)處的吸光度。將對(duì)照品蘆丁配制成質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，準(zhǔn)確吸取 0.00、0.500、1.00、1.50、2.00、2.50 mL，按照上述方法制定標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2.3 抗氧化能力測(cè)定

根據(jù)Li 等建立的方法[22]，測(cè)定DPPH 自由基清除活性來評(píng)估蜂膠的抗氧化能力。用無水乙醇配置0.1 mmol/L DPPH 溶液，避光保存。樣品溶液的測(cè)定：按12 mL 水+2 mL DPPH 溶液；22 mL樣品+2 mL DPPH 溶液；32 mL 樣品+2 mL 無水乙醇溶液加入反應(yīng)液，搖勻后于（25±2）℃避光靜止 30 min，測(cè)定 519 nm 波長(zhǎng)處的吸光度。DPPH 自由基清除率計(jì)算公式如下：

式中：A1表示 2 mL 水+2 mL DPPH 溶液的吸光度；A2表示 2 mL 樣品+2 mL DPPH 溶液的吸光度；A3表示2 mL 樣品+2 mL 無水乙醇溶液的吸光度。

1.3.3 檢測(cè)EEP-βCD 與EEP 水溶性和熱穩(wěn)定性的差異

取 0.5 g 的 EEP 和 EEP-βCD 加到 30 mL 超純水中，充分混勻，分別在25 ℃和37 ℃下水浴30 min，制得EEP 和EEP-βCD 飽和溶液。取上清液檢測(cè)291 nm波長(zhǎng)處的吸光度[23]。以25 ℃和37 ℃下飽和β-CD 溶液為對(duì)照，平行測(cè)定3 次。

稱取0.05 g EEP，加75%乙醇溶解，定容至25 mL。稱取0.05 g EEP-βCD，加超純水溶解，定容至25 mL。將上述溶液溫度快速升至85 ℃處理15 nim 后，檢測(cè)DPPH 自由基清除率。以超純水為對(duì)照，平行測(cè)定3 次。

為了將 EEP、EEP-βCD 組間 DPPH 自由基清除率變化放大，使用公式（2）計(jì)算加熱前后DPPH 自由基清除率的衰減率：

式中：D1表示加熱前DPPH 自由基清除率，%；D2表示加熱后DPPH 自由基清除率，%。

1.3.4 西番蓮果汁飲料的制備

清洗西番蓮，切開果皮，取出果肉，1 200 r/min 攪拌15 min。向果肉中添加復(fù)合酶：0.05%α-淀粉酶、0.25%果膠酶和0.16%纖維素酶，45℃酶解2.5 h[24]。然后離心過濾除去籽粒，得到西番蓮果汁溫下均質(zhì)備用。將飲用水與木糖醇、EEP-βCD 和穩(wěn)定劑充分混勻后，最后加入西番蓮果汁。充分混勻后均質(zhì)3 次，85 ℃殺菌 15 min，0 ℃～4 ℃下冷藏。

1.3.5 西番蓮出汁率優(yōu)化

用量筒量取50 mL 果肉，做3 種不同處理后離心過濾，測(cè)量果汁體積。A 組：不做處理；B 組：攪拌，攪拌條件為1 200 r/min 15 min；C 組：攪拌后酶解，酶解條件為45 ℃2.5 h。每組平行測(cè)定3 次。計(jì)算西番蓮的出汁率。西番蓮出汁率的計(jì)算公式為：

式中：V1表示最終得到的西番蓮果汁體積，mL；V2表示從西番蓮取出的果肉體積，mL。

1.3.6 西番蓮果汁飲料工藝優(yōu)化

采用正交試驗(yàn)法確定西番蓮果汁、EEP-βCD 和木糖醇的用量，對(duì)西番蓮果汁飲料的工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以感官評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，確定果汁、EEP-βCD 和木糖醇的用量范圍。根據(jù)Adrián 等的研究，將 EEP-βCD 的用量范圍設(shè)為 0.2%～1.0%[25]。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以感官評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，選擇果汁用量范圍為10%～20%，木糖醇用量范圍為8%～12%。正交試驗(yàn)的因素與水平見表1。

表1 西番蓮果汁飲料原料添加量的因素水平表Table 1 Factors and levels table of adding amount of passion fruit juice beverage

1.3.7 感官評(píng)價(jià)

邀請(qǐng)10 名食品專業(yè)學(xué)生，系統(tǒng)學(xué)習(xí)感官評(píng)定方法后，對(duì)西番蓮果汁飲料的各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表2。

此外，為了評(píng)估消費(fèi)者對(duì)西番蓮果汁飲料的喜好程度，采用9 點(diǎn)喜好標(biāo)度法[26]。組織30 名志愿者，隨機(jī)分成 A、B 兩小組，A 組對(duì)不添加 EEP-βCD 的西番蓮果汁飲料作感官評(píng)價(jià)，B 組對(duì)添加EEP-βCD 的西番蓮果汁飲料作感官評(píng)價(jià)。喜歡程度的9 個(gè)選項(xiàng)是：“極其喜歡”（9）、“非常喜歡”（8）、“一般喜歡”（7）、“稍微喜歡”（6）、“ 不喜歡也不討厭”（5）、“輕微不喜歡”（4）、“一般不喜歡”（3）、“非常不喜歡”（2）和“極其不喜歡”（1）。

表2 西番蓮果汁飲料感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)表Table 2 Passion fruit juice beverage sensory evaluation standard table

1.3.8 數(shù)據(jù)分析和處理

采用SSPS19.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。使用Excel 2010 繪圖。試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示。采用單因素方差分析和DUNCAN 檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)比較和顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 β-CD對(duì)EEP水溶性的影響

根據(jù)王磊等的方法[23]，用OD 值來評(píng)估EEP 和EEP-βCD 在水溶液的含量。EEP 與 EEP-βCD 的飽和水溶液的OD 值差異見圖1。

圖1 EEP 與EEP-βCD 的飽和水溶液的OD 值差異Fig.1 The difference of OD value of saturated solution between EEP and EEP-βCD

如圖1 所示，37 ℃EEP 組 OD 值顯著高于 25 ℃EEP 組（P<0.05）；37 ℃EEP-βCD 組 OD 值顯著高于 25 ℃EEP-βCD 組（P<0.05）；β-CD 對(duì) OD 值無顯著影響。結(jié)果表明，相比常溫（25 ℃），人體溫度下（37 ℃）EEP 和EEP-βCD 的水溶性均有提高。在 25 ℃下，EEP-βCD組 OD 值顯著高于 EEP 組（P<0.01）；在 37 ℃下，EEP-βCD 組 OD 值也顯著高于 25 ℃ EEP-βCD 組 （P<0.01）。以上結(jié)果表明，EEP-βCD 的水溶性高于EEP。

2.2 β-CD對(duì)EEP熱穩(wěn)定性的影響

EEP 與 EEP-βCD 熱處理前后 DPPH 自由基清除率的變化見圖2。

圖2 EEP 與EEP-βCD 熱處理前后DPPH 自由基清除率的變化Fig.2 Changes in DPPH radical scavenging before and after heat treatment of EEP and EEP-βCD

如圖2 所示，EEP 組加熱后DPPH 自由基清除率顯著低于加熱前（P<0.05）。同樣地，EEP-βCD 組加熱后DPPH 自由基清除率也顯著低于加熱前（P<0.05）。通過計(jì)算，EEP-βCD 組和 EEP 組 DPPH 自由基清除率的衰減率分別為37.28 %和47.70 %，EEP-βCD 組衰減率顯著低于EEP 組（P<0.01）。結(jié)果表明，熱處理后，EEP 和 EEP-βCD 的 DPPH 自由基清除能力均有下降。但是相比EEP 組，EEP-βCD 組的下降幅度小，表現(xiàn)出更好的熱穩(wěn)定性。

2.3 EEP和EEP-βCD的總酚、總黃酮含量以及抗氧化能力

EEP 和EEP-βCD 的總酚、總黃酮含量以及抗氧化能力見表3。

表3 EEP 與EEP-βCD 的總酚、總黃酮含量和抗氧化能力（n=6）Table 3 The antioxidant capacity and the content of total phenols and total flavonoids in EEP and EEP-βCD（n=6）

根據(jù)玄紅專等的報(bào)道[27]，可知本研究使用的蜂膠酚類和黃酮類化合物含量較高，抗氧化能力較強(qiáng)，應(yīng)用價(jià)值高。

此外，相比于其他類型蜂膠，EEP-βCD 中酚類和黃酮類化合物含量并不低，而且具有一定的抗氧化能力?？紤]到 EEP-βCD 是 EEP 和 β-CD 按體積比為 1 ∶2混合制備的，混合后溶液中的大部分的EEP 與β-CD結(jié)合生成絮狀沉淀物，制備的復(fù)合物中EEP 含量較高。由圖1 知，EEP-βCD 的水溶性優(yōu)于EEP，可以通過增加EEP-βCD 在西番蓮果汁飲料中的添加量，來保證西番蓮果汁飲料中EEP 的含量。

2.4 西番蓮出汁率

不同加工工藝對(duì)西番蓮出汁率的影響見圖3。

圖3 不同加工工藝對(duì)西番蓮出汁率的影響Fig.3 Effects of different processing techniques on the juice yield of passion fruit

出汁率 A 組＜ B 組＜ C 組。

攪拌組的西番蓮經(jīng)過1 200 r/min 攪拌15 min 后，果肉中的一部分粗纖維被打斷，出汁率高于未處理組。酶解組的西番蓮經(jīng)過攪拌后，再加入0.1%纖維素酶、0.2 %果膠酶和0.1 % α-淀粉酶混合均勻，酶解2.5 h 后，出汁率高于攪拌組，與未處理組相比，出汁率提高18%。結(jié)果表明，攪拌加酶解的工藝大大提高了西番蓮的出汁率。

2.5 西番蓮果汁飲料工藝優(yōu)化

西番蓮果汁飲料配方優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析見表4。

表4 西番蓮果汁飲料配方優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 4 Orthogonal test results and analysis of passion fruit juice beverage formula

續(xù)表4 西番蓮果汁飲料配方優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Continue table 4 Orthogonal test results and analysis of passion fruit juice beverage formula

影響西番蓮果汁飲料感官評(píng)分因素的順序依次為：A＞C＞B，即果汁添加量＞木糖醇添加量＞EEP-βCD添加量。

最佳組合為A2B1C3，即西番蓮果汁飲料的最佳配方為：15%果汁、0.6%EEP-βCD 和12%木糖醇。按該配方制得西番蓮果汁飲料，感官評(píng)分為88.7%，高于先前實(shí)驗(yàn)組評(píng)分。

2.6 β-CD對(duì)EEP刺激性味道的影響

將30 位同學(xué)的評(píng)分結(jié)果取平均值，得到9 點(diǎn)喜好評(píng)分。其中添加EEP-βCD 的西番蓮果汁飲料的評(píng)分為6.5，而不添加EEP-βCD 的西番蓮果汁飲料的評(píng)分為6.6，表明消費(fèi)者該款西番蓮果汁飲料的喜歡程度較高，并且添加EEP-βCD 對(duì)西番蓮果汁飲料的9 點(diǎn)喜好評(píng)分結(jié)果影響小。

3 結(jié)論與討論

本文首次將蜂膠與β-環(huán)糊精的復(fù)合物應(yīng)用于西番蓮果汁飲料。EEP 與β-CD 復(fù)合后，其水溶性提高，在人體溫度（37 ℃）下水溶性好。將EEP 與β-CD 復(fù)合的加工方法，不僅有利于將EEP 溶解在西番蓮果汁飲料中，而且有助于EEP 在人體消化道中的吸收利用。西番蓮果汁飲料生產(chǎn)過程中有熱殺菌這一環(huán)節(jié)，會(huì)破壞EEP 中的活性成分，造成EEP 活性減弱，表現(xiàn)出DPPH 自由基清除能力的下降。而EEP-βCD 較強(qiáng)的熱穩(wěn)定性，有利于在西番蓮果汁飲料熱殺菌過程中，減少蜂膠活性成分的破壞。EEP-βCD 的添加量不是西番蓮果汁飲料的感官評(píng)分的主要影響因素。與β-CD 復(fù)合后，EEP 的刺激性味道得到了很好的改善，可以將EEP 添加到西番蓮果汁飲料中而不影響其口感和風(fēng)味。綜上所述，使用β-環(huán)糊精包埋蜂膠后，蜂膠的水溶性、熱穩(wěn)定性和刺激性味道得到改善，有利于蜂膠在飲料行業(yè)中的應(yīng)用。