小檗堿對(duì)肥胖小鼠脂肪組織纖維化及腸道菌群的調(diào)節(jié)作用研究

王楊，孔敏，宋曉瑜，張嘉微，李新莉

（大連醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物技術(shù)系生物制藥教研室，遼寧大連116044）

黃連（Coptis chinensis Franch.）屬毛茛科、黃連屬多年生草本植物，具有清熱燥濕，瀉火解毒之功效。其主要成分為小檗堿，又稱黃連素（berberine，BBR），是一種異喹啉類生物堿，作為傳統(tǒng)的抗炎、抑菌藥物在臨床應(yīng)用己久[1]。近年來在心血管疾病、糖脂代謝影響方面的研究顯示小檗堿在降脂方面具有優(yōu)異的治療前景，其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)、影響膽汁酸的合成與代謝、激活內(nèi)臟脂肪組織相關(guān)基因的表達(dá)、激活腺自酸活化蛋白激酶（adenosine 5’-monophosphate-activated protein kinase，AMPK）途徑、改善胰島素抵抗等有關(guān)[2]。

肥胖人群白色脂肪組織中細(xì)胞外基質(zhì)異常堆積，即發(fā)生了脂肪組織纖維化[3]，是脂肪組織功能障礙的標(biāo)志之一。肥胖伴有代謝綜合征的患者較單純肥胖的患者，脂肪組織纖維化程度更重，提示脂肪組織纖維化與肥胖所致代謝紊亂有關(guān)。已有研究[4-5]表明，腸道細(xì)菌與肥胖、糖尿病以及心血管疾病密切相關(guān)。一些降糖藥物可改善糖尿病患者腸道菌群結(jié)構(gòu)，減少慢性低度炎癥，這為患者帶來獨(dú)立于降糖作用之外的獲益[6-7]。AMPK 不僅是細(xì)胞能量代謝的感受器還是多種藥物的作用靶點(diǎn)，激活A(yù)MPK 可能對(duì)于糖尿病、炎癥和腫瘤的治療具有著廣泛的應(yīng)用前景[8]。

本課題對(duì)小檗堿是否能通過AMPK 途徑減輕肥胖小鼠的組織纖維化和腸道菌群失調(diào)進(jìn)行研究。使用高脂乳劑建立小鼠肥胖模型，檢測(cè)脂肪組織中腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（transforming growth factor beta1，TGF-β1）和AMPK-α1 的表達(dá)水平，使用腸桿菌基因間重復(fù)共有序列基因擴(kuò)增（enterobacterial repetitive intergenic consensus-polymerase chain reaction，ERIC-PCR） 和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)——變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）技術(shù)分析小檗堿對(duì)肥胖小鼠腸道菌群的影響，初步探討小檗堿減輕脂肪纖維化和腸道菌群失調(diào)的可能作用機(jī)制，為在新形勢(shì)下更好的使用小檗堿這一老藥提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小檗堿（批號(hào)：2160951，規(guī)格：0.1g）：東北制藥集團(tuán)沈陽第一制藥有限公司；兔源抗β-actin 抗體、兔源抗 TNF-α 抗體、兔源抗 TGF-β1 抗體、兔源抗 AMPK-α1 抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白G 多克隆抗體：武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；Pierce ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒、硝酸纖維素膜：大連萬澤貿(mào)易有限公司；RIPA 裂解液：北京索萊寶科技有限公司；糞便細(xì)菌DNA 提取試劑盒：成都福際生物技術(shù)有限公司；引 物 GC -341f （5′ -CGCCCGGGGCGCGCCCCGGG CGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAG -CAG）、518r （5′ -ATTACCGCGGCTGCTGG）、ERIC -1（ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC）、ERIC-2（AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG）：英濰捷基上海貿(mào)易有限公司；PCR-Mix：大連優(yōu)萌威貿(mào)易有限公司；丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、尿素、去離子甲酰胺、瓊脂糖、溴化乙錠（ethidium bromide，EB）：大連羽銘生物科技有限公司；DL2000 Marker、DL100 Marker：大連寶生物工程有限公司。

試驗(yàn)動(dòng)物：SPF 級(jí)KM 小鼠40 只，雌雄各半，體重18 g～22 g，由大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（遼）2008-0002，本實(shí)驗(yàn)通過大連醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)同意。

1.2 儀器與設(shè)備

UVS-1 渦旋振蕩器：北京優(yōu)晟科技有限公司；HC-3018R 高速冷凍離心機(jī)（離心半徑6 cm）：安徽中科中佳科學(xué)有限公司；JY-spat 瓊脂糖水平電泳儀、ST-Ⅰ型半干式轉(zhuǎn)移電泳儀、DGGE 電泳儀：大連競(jìng)邁設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 高脂乳劑的制備

根據(jù)參考文獻(xiàn)[9]，取20 g 豬油于40 ℃水浴加熱融化，置于乳缽中，加入10 g 膽固醇，1 g 丙硫氧嘧啶，充分?jǐn)嚢瑁芙?。加入吐?80、丙二醇各20 mL，研磨混勻，緩慢加入10%去氧膽酸鈉水溶液20 mL，研磨乳化，加蒸餾水至100 mL，裝入密閉容器中，冷藏。使用時(shí)于37 ℃水浴融化。

1.3.2 模型建立與分組

實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組（N）、肥胖模型組（F）、小檗堿高劑量（400 mg/kg）組（BH）和小檗堿低劑量（100 mg/kg）組（BL），每組 10 只。除正常對(duì)照組外，其他組小鼠連續(xù)灌服高脂乳劑（0.1 mL/10 g）12 周，建立肥胖模型，之后各組小鼠給予相應(yīng)藥物9 周。期間小鼠正常飲食和飲水，每周稱量體重，于實(shí)驗(yàn)第13 周和第21 周收集鼠便適量，并在最后一天采用頸椎脫臼法處死小鼠，迅速剝離皮下腹股溝脂肪，將小鼠糞便與白色脂肪組織于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 Western-blot 檢測(cè) TNF-α、TGF-β1 和 AMPK-α1 的表達(dá)水平

取50 mg 左右脂肪加入0.5 mL 預(yù)冷的蛋白裂解液（radio-immunoprecipitation assay，RIPA），冰上勻漿20 次～40 次，直到95%的細(xì)胞被破碎，然后在冰浴中放置30 min，間斷搖動(dòng)。12 000 r/min 4 ℃離心15 min，將上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中，用槍頭小心剝?nèi)ド蠈又|(zhì)層，吸下層清液，再離心，直至不出現(xiàn)明顯的脂質(zhì)層，即得脂肪組織總蛋白提取物，分裝，-80 ℃保存?zhèn)溆?。常?guī)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）電泳，每組肝組織蛋白上樣量為15 μg，分離膠濃度10%，濃縮膠濃度5%，待預(yù)染Marker 充分被分開，停止電泳。用半干式電轉(zhuǎn)儀進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。脫脂奶粉封閉硝酸纖維素膜1 h。分別與一抗β-actin（體積比1 ∶500 稀釋）、TNF-α（體積比 1 ∶500 稀釋）、TGF-β1（體積比 1 ∶500 稀釋）、AMPK-α1（體積比 1 ∶500 稀釋）結(jié)合，4 ℃過夜，洗膜緩沖液（tris buffered saline tween，TBST）洗膜，于二抗辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白G 多克隆抗體（體積比1 ∶5 000 稀釋）孵育 2 h，化學(xué)發(fā)光（electrochemiluminescence，ECL），凝膠成像。以β-actin 為內(nèi)參，采用Quantity One 4.6.2軟件進(jìn)行蛋白灰度值分析，各蛋白表達(dá)量是與內(nèi)參的比值。

1.3.4 腸桿菌基因間重復(fù)共有序列基因擴(kuò)增（enterobacterial repetitive intergenic consensus -polymerase chain reaction，ERIC-PCR）

使用試劑盒提取每只小鼠糞便細(xì)菌DNA，按說明書進(jìn)行操作。以上、下游引物ERIC-1 和ERIC-2 進(jìn)行ERIC-PCR 擴(kuò)增，體系（25 μL）為：2×Easy Taq PCR SuperMix 12.5 μL，10 μmol/L 的上下游引物各 0.5 μL，DNA 模板 2 μL，去離子水補(bǔ)充至 25 μL。PCR 程序：預(yù)變性 94 ℃ 5 min；變性 94 ℃ 50 s，退火 49 ℃ 30 s，46 ℃30 s，延伸 72 ℃ 3 min，35 個(gè)循環(huán)；充分延伸 72 ℃ 9 min。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)品用3%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，以2 000 bp Marker 為參照。

1.3.5 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳

使用16S rRNA 基因V3 可變區(qū)上、下游引物GC-341f 和 518r，擴(kuò)增體系同 1.6。PCR 程序：預(yù)變性 94 ℃5 min；變性 94 ℃ 30 s，退火 54 ℃ 30 s，延伸 72 ℃ 30 s，30 個(gè)循環(huán)；充分延伸72 ℃7 min。采用8%丙烯酰胺凝膠配制25%～50%DGGE 變性梯度凝膠 [其中100%濃度變性梯度凝膠含40%（體積分?jǐn)?shù)）去離子甲酰胺和 7 mol/L 尿素]，取 10 μL PCR 產(chǎn)物進(jìn)行 DGGE 電泳，60 ℃、70 V 電泳5 h，電泳后取出凝膠使用0.125‰溴乙錠染色，拍照。切下PCR-DGGE 圖譜中的優(yōu)勢(shì)條帶，加入 20 μL 無菌水搗碎，于 95 ℃浸泡 10 min，37 ℃過夜，取上清液做模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，引物為341f 和518r，PCR 反應(yīng)體系和程序同 1.6。PCR 產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序，結(jié)果在GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast 對(duì)比分析。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Quantity One 4.6.2 軟件分析ERIC-PCR 圖譜中主要條帶的分子量，對(duì)PCR-DGGE 圖譜進(jìn)行UPGMA 相似性聚類分析和多樣性分析，所得數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 10.0 軟件包處理，正態(tài)計(jì)量指標(biāo)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（± SD）表示，組間兩兩比較采用 LSD-t 檢驗(yàn)；P 值<0.05 表示有顯著性的差異，P 值<0.01 表示有及其顯著性的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 小檗堿對(duì)肥胖小鼠體重的影響

小檗堿對(duì)肥胖小鼠體重的影響如圖1 所示。

圖1 小檗堿對(duì)肥胖小鼠體重的影響Fig.1 Effect of berberine on weight of obese mice

高脂乳劑灌胃12 周建立肥胖小鼠模型，F(xiàn)、BH 和BL 組小鼠體重均呈現(xiàn)明顯上升趨勢(shì)，與N 組小鼠相比具有極其顯著性的差異（P<0.01）。之后各組小鼠開始灌服相應(yīng)藥物，從第13 周開始N 組和F 組小鼠體重仍繼續(xù)上升，上升速度減緩。而小檗堿給藥組小鼠體重均出現(xiàn)下降，其中高脂+小檗堿高劑量組（BH）小鼠體重明顯減少，與F 組相比有及其顯著性的差異（P<0.01）。以上結(jié)果說明，高脂乳劑導(dǎo)致小鼠體重明顯增加，小檗堿能夠降低肥胖小鼠體重。

2.2 Western-blotting檢測(cè)TNF-α、TGF-β1和AMPK-α1的表達(dá)水平

Western-blot 檢測(cè)肝組織中 TNF-α、TGF-β1 和AMPK-α1 的表達(dá)水平。分析各蛋白質(zhì)條帶灰度，進(jìn)行半定量比較，以目的基因的條帶灰度與管家基因β-actin的灰度比值表示蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，結(jié)果如圖2 所示。

圖2 Western-blot 法檢測(cè)TNF-α、TGF-β1 和AMPK-α1 表達(dá)水平及各蛋白質(zhì)與β-actin 灰度值比值Fig.2 The expression and gray scale value ratio of TNF-α，TGF-β1 and AMPK-α1

上述結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組N 相比，肥胖組小鼠脂肪組織中TNF-α 和TGF-β1 的表達(dá)水平升高，AMPK-α1 表達(dá)水平顯著降低（P<0.01）。與肥胖組 F 相比，小檗堿給藥組脂肪組織TNF-α 和TGF-β1 的表達(dá)水平有所降低，且BH 組具有極其顯著性的差異（P<0.01），而 AMPK-α1 表達(dá)水平升高，BH 和 BL 組均具有極其顯著性的差異（P<0.01）。

2.3 EIRC-PCR圖譜分析

第 13 周（給藥 1 周）和第 21 周（給藥 9 周）小鼠腸道菌群ERIC-PCR 圖譜如圖3 所示。

圖3 小鼠腸道菌群ERIC-PCR 圖譜Fig.3 ERIC-PCR profiles of intestinal microflora in mice

正常對(duì)照組（N）主要條帶集中在540 bp 和310 bp附近。肥胖模型組（F）以663 bp 的條帶為優(yōu)勢(shì)條帶。第13 周，小檗堿給藥組（BH，BL）以 540 bp 左右的條帶為主。第21 周，正常對(duì)照組和肥胖模型組小鼠優(yōu)勢(shì)條帶變化不大，但小檗堿給藥組中310 bp 左右的條帶強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，且此條帶在小檗堿高劑量組中強(qiáng)度最強(qiáng)。以上研究結(jié)果表明高脂乳劑建立肥胖模型，小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改變，540 bp 和310 bp 左右的條帶為小檗堿給藥組小鼠腸道中的特征條帶。

2.4 PCR-DGGE圖譜分析

各組小鼠腸道菌群PCR-DGGE 圖譜如圖4 所示。

DGGE 圖譜中優(yōu)勢(shì)條帶測(cè)序結(jié)果如表1 所示。

DGGE 圖譜中同一位置的條帶代表相同的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌，條帶亮度則反映出這一細(xì)菌的相對(duì)含量。實(shí)驗(yàn)組各泳道條帶較多，亮度較強(qiáng)，表明小鼠腸道菌群的種類和數(shù)量較多，腸道菌群結(jié)構(gòu)的豐富度和多樣性較高。在實(shí)驗(yàn)第 13 周和 21 周，毛螺科菌（Lachnospiraceae bacterium，條帶b）、嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus，條帶 c）、普雷沃菌（Prevotella sp.，條帶d）存在于小檗堿給藥組為共有條帶，說明毛螺科菌、嗜酸乳桿菌和普雷沃菌是小檗堿給藥后小鼠腸道中的優(yōu)勢(shì)菌群，上述細(xì)菌在小檗堿高劑量組（BH）中強(qiáng)度最強(qiáng)，含量最大。費(fèi)克藍(lán)姆氏菌（Facklamia iqnava，條帶 a）在高脂乳劑灌服的小鼠（F、BH、BL 組）腸道中存在，與肥胖組（F）相比，小檗堿給藥組（BH、BL）中此條帶的強(qiáng)度減弱，含量減少。第21 周，費(fèi)克藍(lán)姆氏菌（Facklamia iqnava）在各實(shí)驗(yàn)組中強(qiáng)度降低直至消失，這表明費(fèi)克藍(lán)姆氏菌（Facklamia iqnava）是肥胖小鼠與其他組小鼠腸道差異菌群。

圖4 小鼠腸道菌群DGGE 圖譜和UPGMA 相似性聚類分析Fig.4 Representative DGGE profiles and UPGMA dendrograms of intestinal microflora

表1 DGGE 圖譜中優(yōu)勢(shì)條帶測(cè)序與參比序列對(duì)照結(jié)果Table 1 Comparative results of dominant band sequence and reference sequence in DGGE profile

UPGMA 分析DGGE 圖的相似性，結(jié)果顯示各組小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)聚成兩大簇，小檗堿高低劑量給藥組聚成一簇，其他組聚成另一簇，兩大簇之間相似性較低，僅為0.53，表明小檗堿對(duì)小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)有明顯影響。在第一簇中，肥胖組（13-F）與正常對(duì)照組（N）又分別聚成兩小簇，二者相似性為0.61，表明肥胖小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)與正常小鼠差別較大。其中第21 周，正常組和肥胖組小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)有較高的相似性，為0.78，表明停止使用高脂乳劑灌胃，隨著時(shí)間周期的加長(zhǎng)，肥胖模型組小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)趨于正常。

3 結(jié)論與討論

肥胖主要以多種免疫細(xì)胞積聚在脂肪組織為特征，其中促炎巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)和炎癥相關(guān)的基因表達(dá)能促進(jìn)胰島素抵抗，是小鼠和人類肥胖最重要的表現(xiàn)。巨噬細(xì)胞可分為兩型，分泌促炎細(xì)胞因子TNF-α 和白細(xì)胞介素（interleukin，IL-6、IL-1β）的 M1 巨噬細(xì)胞，分泌抗炎因子（IL-10、TGF-β）的 M2 巨噬細(xì)胞[10]。文獻(xiàn)報(bào)道[2]，高脂飼料喂養(yǎng)的小鼠，體重及內(nèi)臟脂肪明顯增加，出現(xiàn)糖耐量的異常，血清TNF-α 水平升高。TGF-β是引起各器官纖維化最重要的細(xì)胞因子之一，人血漿TGF-β1 水平與體重指數(shù)BMI 顯著正相關(guān)，肥胖小鼠血清TGF-β1 水平、脂肪組織中TGF-β1 表達(dá)明顯高于正常[11]。肥胖時(shí)升高的TGF-β1 又可引起脂肪組織纖維化，TGF-β1、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1（tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP-1）等纖維化關(guān)鍵調(diào)控蛋白表達(dá)增加，同時(shí)脂肪組織AMPK 磷酸化受抑制。在 TGF-β1 造成的基質(zhì)血管成分（stromal vascular fraction，SVF）細(xì)胞纖維化模型中，一些 AMPK 藥物激動(dòng)劑能夠抑制纖維化生成和降解相關(guān)蛋白的異常激活[12]。本實(shí)驗(yàn)肥胖組小鼠脂肪組織中TNF-α 和TGF-β1 的表達(dá)水平升高，AMPK-α1 表達(dá)水平明顯降低。小檗堿給藥后 TNF-α 和 TGF-β1 的表達(dá)降低，而AMPK-α1 表達(dá)升高。上述結(jié)果表明肥胖小鼠脂肪組織發(fā)生纖維化，TGF-β1 等纖維化關(guān)鍵調(diào)控蛋白表達(dá)增加，同時(shí)脂肪組織AMPK 磷酸化受抑制。小檗堿給藥后不僅使肥胖小鼠體重減輕，還明顯抑制脂肪組織纖維化，激活肥胖小鼠脂肪組織AMPK 活性，抑制TGF-β1 表達(dá)。

腸道菌群與AMPK 關(guān)系密切[13]，腸道菌群參與機(jī)體的能量代謝，誘發(fā)葡萄糖無氧酵解，促使AMPK 磷酸化釋并放抑制炎癥因子，起到抗炎作用。腸道菌群結(jié)構(gòu)及功能失調(diào)，可誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，造成腸黏膜上皮細(xì)胞的損傷，AMPK 活性下降，促炎因子分泌增多，腸粘膜免疫屏障被破壞，導(dǎo)致局部炎癥反應(yīng)的發(fā)生。在腸道內(nèi)，毛螺科菌和乳酸桿菌等參與碳水化合物發(fā)酵生成短鏈脂肪酸（short chain fatty acid，SCFAs），二者減少直接導(dǎo)致SCFAs 產(chǎn)量下降，進(jìn)一步使腸道內(nèi)pH 值升高，氨的產(chǎn)量和吸收增加[14]。而Facklamia iqnava 是新興的病原體能夠引起人類感染[15]。本實(shí)驗(yàn)中肥胖小鼠腸道菌群失調(diào)，以致病菌Facklamia iqnava 為優(yōu)勢(shì)菌群，益生菌如毛螺科菌和乳酸桿菌明顯減少。小檗堿給藥后毛螺科菌和嗜酸乳桿菌增加，成為優(yōu)勢(shì)菌群。

綜上，高脂乳劑建立肥胖模型，小鼠脂肪組織出現(xiàn)纖維化，腸道菌群失調(diào)，益生菌含量減少，致病菌含量增加。小檗堿對(duì)肥胖小鼠脂肪組織纖維化的減輕和腸道菌群的調(diào)節(jié)作用機(jī)制不僅與激活A(yù)MPK，抑制TNF-α 和 TGF-β1 等纖維化相關(guān)蛋白的表達(dá)有關(guān)，還與調(diào)節(jié)腸道菌群失調(diào)，促生益生菌，進(jìn)而增加AMPK活性有關(guān)。本研究以脂肪組織纖維化和腸道菌群為靶點(diǎn)，為進(jìn)一步開展小檗堿相關(guān)藥理需用研究提供了新思路。