肺感染大鼠肺泡灌洗液及血清中TNF-α、IL-6、IL-8 的水平及其臨床意義

王 瑛，石書梅，殷 悅

細胞因子是機體多種細胞分泌的小分子多肽物質，調節(jié)和參與機體的生理功能，起傳遞細胞間信息的作用。在感染性疾病進程中，激活的單核細胞和肺巨噬細胞釋放多種炎性因子，特別是TNF-α、IL-6、IL-8。隨著感染時間的延長，細菌的數(shù)量和其他毒力因子釋放量逐漸增加，也導致炎性因子的水平不斷增加［1］，增高的炎性因子，部分吸收入血，使血清中及肺泡灌洗液炎性因子升高，該研究通過檢測肺泡灌洗液及肺組織勻漿中細菌計數(shù)觀察肺泡灌洗液及血清中各炎性因子水平來評價不同部位炎性因子對肺部感染急性發(fā)病期及定植期病情嚴重程度的意義。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 動物 雄性Wistar大鼠24只，鼠齡8周，體重（180±20） g（解放軍第 960 醫(yī)院動物中心提供），隨機分為正常對照組（下文簡稱對照組，8只）及流感嗜血桿菌感染組（下文簡稱感染組，16只）；后又將感染組隨機分為灌洗液組 （8只）及血清組（8只）。

1.1.2 菌株 流感嗜血桿菌1709（解放軍第960醫(yī)院呼吸科臨床分離菌株，并經(jīng)VITEK系統(tǒng)鑒定）

1.2 方 法

1.2.1 模型制備 將大鼠以45 m/kg 3%戊巴比妥腹腔麻醉后，仰臥位固定于大鼠固定板，用電動剃毛器進行頸部、胸部脫毛，頸部適度過伸，暴露喉頭，消毒，鋪無菌洞巾，做頸部正中切口，約2～3 cm，分離頸前肌，暴露并固定氣管，在環(huán)甲軟骨處剪一V型切口，置入硅膠管（新生兒吸痰管6號），并將大鼠氣管向右傾斜緩慢注入流感嗜血桿菌瓊脂小珠 100 μl，完畢后將大鼠直立 10～20 s，使菌液盡量分布于右下肺。

1.2.2 標本采集 （1）支氣管肺泡灌洗。大鼠以3%戊巴比妥腹腔麻醉后，仰臥位固定于大鼠固定板，用電動剃毛器進行頸部剃毛，頸部適度過伸，暴露喉頭，消毒，鋪無菌洞巾，做頸部正中切口，鈍性分離頸前肌，暴露并固定氣管，在環(huán)甲軟骨處剪一V型切口，以靜脈套管針替代氣管導管行氣管插管，刺入氣管軟骨環(huán)間隙，朝向心端進針約1 cm，回抽無阻力后，用溫生理鹽水10 ml灌洗3次，總回收率保持在 60%～90%。 BALF離心 7 min（3000 r/min），取上清，待測。（2）肺組織勻漿的制備。無菌取出一側肺組織，用滅菌溫生理鹽水經(jīng)支氣管灌注沖洗5次，去除浮游菌，置于預先稱重的無菌錫箔紙上，電子天平稱重。組織塊稱重后，將右肺下葉肺組織剪碎，加入1 ml滅菌冰生理鹽水，用已消毒的組織研磨器冰浴研磨成肺勻漿，離心7 min（3000 r/min），取上清，待測。（3）感染肺組織的活菌計數(shù)。無菌取出一側肺組織，用滅菌溫生理鹽水經(jīng)支氣管灌注沖洗3次，去除浮游菌，后置于預先稱重的無菌錫箔紙上用電子天平稱重。組織塊稱重后，將右肺下葉肺組織剪碎，加人1 ml滅菌冰生理鹽水，用已消毒的組織研磨器于4℃下研磨制成肺勻漿，用無菌的移液管取0.1 ml勻漿至0.9 ml的生理鹽水中充分振蕩混勻，再取0.1 ml至0.9 ml的生理鹽水液中，依此類推將勻漿倍比稀釋至106，分別取各濃度的勻漿0.1 ml用玻璃棒均勻涂布于MH瓊脂平板上，每個濃度涂3個平板，將涂好的平板放在37℃，5%CO2孵箱中孵育24 h，選取菌落在30～300個之間的平板進行菌落計數(shù)。每克肺組織中CFU數(shù)=菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×100/肺組織重量。

1.2.3 檢測指標 （1）肺部細菌學檢查。觀察大鼠肺泡灌洗液及肺組織勻漿細菌計數(shù)。（2）肺泡灌洗液及血清炎性介質的變化。觀察對照組、感染組不同時間肺泡灌洗液及血清炎癥因子水平的差異。在所有實驗準備完成后，由于造模、打藥等操作造成大鼠死亡，最終三組每組剩4只符合標準的大鼠。

1.3 統(tǒng)計學處理實驗數(shù)據(jù)以（）描述。組間差異比較，定量資料采用單因素方差分析（One Way-ANOVA），實驗數(shù)據(jù)均用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件分析。

2 結果

2.1 感染組菌落計數(shù)整個實驗過程對照組肺組織未培養(yǎng)檢出細菌。感染組肺泡灌洗液接種細菌當天菌落計數(shù)為（7.48±0.27） CPU/ml，第 1 天為（7.00±0.11） CPU/ml，第 4 天為（5.60±0.11） CPU/ml，第 8 天為（1.66±0.1） CPU/ml，第 15 天為（1.63±0.16） CPU/ml，第30天為0。感染組肺組織勻漿接種細菌當天菌落計數(shù)為（5.32±0.21） CPU/ml，第 1 天為 5.20 CPU/ml，第 4 天為（4.86±0.10） CPU/ml，第 8 天為（4.3±0.21） CPU/ml，第 15 天為（3.60±0.11） CPU/ml，第 30天為（3.95±0.26）CPU/ml?？梢娂毦嫈?shù)在肺泡灌洗液及組織勻漿中第1天均為最高，肺泡灌洗液中4 d后下降明顯，1個月后細菌未能檢出，而在肺組織勻漿中，在第4天肺組織勻漿細菌數(shù)開始降低，與肺泡灌洗液結果一致，但仍至1個月時仍有細菌檢出，且有上升趨勢，提示有細菌定植。

2．2 肺泡灌洗液及血漿炎性介質的變化流感嗜血桿菌肺部感染大鼠細胞炎性因子在肺泡灌洗液及血清中變化見表1～3，各炎癥指標肺泡灌洗液數(shù)值均高于血漿數(shù)值，TNF-α在感染大鼠肺泡灌洗液及血清中表達于第4天后數(shù)值逐漸下降，1 W趨于平穩(wěn)，30 d時仍明顯高于照組，有統(tǒng)計學意義；IL-6變化趨勢中，感染大鼠在肺泡灌洗液及血清中數(shù)值同樣于第4天開始明顯上升，1 W時達到最高值后開始下降，其中灌洗液組在30 d時出現(xiàn)上升趨勢與細菌計數(shù)一致，血清組持續(xù)下降。IL-8在感染大鼠肺泡灌洗液及血清數(shù)值均于第4天開始出現(xiàn)上升（與對照組比較有統(tǒng)計學意義），灌洗液組及血清組數(shù)值維持在一定水平未見明顯下降，且30 d時出現(xiàn)上升趨勢，與細菌計數(shù)一致。

3 討論

感染可導致氣道黏膜纖毛清除能力受損，降低纖毛清除能力，造成黏液分泌增加和呼吸道上皮受損，反過來又加速細菌在呼吸道的定植和感染，促進病原菌釋放細菌內毒素、纖毛毒素和蛋白水解酶等細菌產(chǎn)物，導致前炎癥細胞因子（IL-8，IL-6、IL-1、TNF-α）的釋放和中性粒細胞、巨噬細胞等炎性細胞在氣道和肺實質的聚集和脫顆粒，造成肺實質損傷和進行性小氣道閉塞，甚至引起組織的破壞，從而促進疾病的發(fā)生、發(fā)展［3］。因此在肺部感染性疾病的診治中，如何及時分辨感染和定植是控制感染避免抗菌藥過度治療的重要因素。

表1 TNF-α在肺部感染大鼠肺泡灌洗液及血清中的變化（pg/ml，）

表1 TNF-α在肺部感染大鼠肺泡灌洗液及血清中的變化（pg/ml，）

注：與對照組比較，＊P<0.05（大鼠接種細菌當天為0天）。

組別 第0天 第4天 第6天 第8天 第15天 第30天對照組 2.01±0.12 1.80±0.18 2.05±0.65 1.97±0.50 1.92±0.70 1.94±0.72血清組 1.43±0.19 3.37±0.39＊ 2.43±0.38＊ 2.43±0.58＊ 2.20±0.07＊ 2.00±0.72＊灌洗液組 1.98±0.09 4.02±0.15＊ 3.56±0.80＊ 3.16±0.80＊ 3.19±0.57＊ 3.25±1.20＊

表2 IL-6在肺部感染大鼠肺泡灌洗液及血清中的變化（pg/ml，）

表2 IL-6在肺部感染大鼠肺泡灌洗液及血清中的變化（pg/ml，）

注：與對照組比較，＊P<0.05（大鼠接種細菌當天為0天）

組別 第0天 第4天 第6天 第8天 第15天 第30天對照組 91.5±11.32 90.30±21.20 89.70±23.56 93.20±26.5 92.00±10.20 91.43±0.15灌洗液組 389.7±46.15 1024.35±77.40＊ 530.82±68.54＊ 529.62±54.10＊ 706.89±78.75＊ 836.70±89.30＊血清組 92.3±20.19 184.10±26.12 164.60±22.40 157.30±24.10 144.80±1.01 116.70±1.10

表3 IL-8在肺部感染大鼠肺泡灌洗液中的變化（pg/ml，）

表3 IL-8在肺部感染大鼠肺泡灌洗液中的變化（pg/ml，）

注：與對照組比較，＊P<0.05（大鼠接種細菌當天為0天）。

組別 第0天 第4天 第6天 第8天 第15天 第30天對照組 0.72±0.12 0.72±0.18 0.80±0.65 0.76±0.50 0.72±0.70 0.82±0.72灌洗液組 1.63±0.19 5.86±0.12＊ 5.60±0.14＊ 4.40±0.18＊ 3.88±0.82＊ 4.00±0.70＊血清組 0.80±0.09 1.33±0.15 1.15±0.80 1.10±0.80 0.98±0.27 1.12±0.20

該實驗研究發(fā)現(xiàn)，流感嗜血桿菌肺部感染大鼠肺泡灌洗液及血清中三種炎性因子數(shù)值均比對照組高，兩組有顯著性差異（P<0.05），提示流感嗜血桿菌感染后，由于菌體抗原及其胞外產(chǎn)物的刺激，首先導致機體免疫細胞（包括單核細胞）激活，產(chǎn)生大量TNF-α、IL-8，參與機體的炎癥反應和免疫應答，在循環(huán)中出現(xiàn)并迅速達到高峰，進而誘發(fā)IL-6產(chǎn)生，并由此激發(fā)炎癥連鎖反應。通過檢測各組大鼠肺泡灌洗液和血漿中TNF-a、IL-6、IL-8水平結合菌落計數(shù)結果，該研究發(fā)現(xiàn)當肺泡灌洗液中細菌數(shù)增高時三種細胞炎性因子水平均較高，且肺泡灌洗液遠高于血清水平，提示急性炎癥與炎性因子呈正相關。在感染組肺泡灌洗液中菌落計數(shù)在第30天時細菌數(shù)為0，提示急性感染清除；而肺泡灌洗液及血清中細胞炎性因子數(shù)值雖均有所下降，但并未恢復到對照組水平，結合肺組織勻漿菌落計數(shù)顯示，雖然浮游菌被清除但仍有少量細菌定植在肺內，考慮炎性因子仍高于對照組與肺內定植細菌不斷釋放內毒素、蛋白水解酶等有關，但數(shù)值水平較低，在接種細菌1個月時肺泡灌洗液中IL-6及IL-8出現(xiàn)上升趨勢，同時期肺組織勻漿菌落計數(shù)顯示細菌數(shù)量有上升趨勢，分析與肺內細菌數(shù)即炎癥程度與炎性因子水平呈正比，而血清中此現(xiàn)象表現(xiàn)并不明顯，考慮與血漿中濃度比肺泡灌洗液低有關。提示炎性因子可作為評價感染程度的指標，同時也是細菌在氣道內定植的提示。

不同的疾病由于病因不同，對機體的免疫和非免疫細胞的刺激不同，激發(fā)機體免疫反應產(chǎn)生的炎癥介質種類、細胞因子含量改變也不一定相同，這也同時說明了細胞因子之間存在著特殊復雜的網(wǎng)絡交叉關系，而且在不同部位其濃度不同，肺泡灌洗液作為肺部疾病診斷的一種輔助方法越來越受到重視，有研究顯示支氣管哮喘患者肺泡灌洗液炎性因子水平可作為檢測病情程度及評價疾病轉歸的指標［4］，其中對于曲霉菌的診斷發(fā)現(xiàn)肺泡灌洗液比血漿更為靈敏［5］。但如何根據(jù)臨床診治的需要更好地選擇檢測指標及方式，還需進一步研究證實。