流式細(xì)胞術(shù)免疫分型對(duì)多發(fā)性骨髓瘤的診斷價(jià)值

王星 張瑜 馬列婷

多發(fā)性骨髓瘤（Multiple myeloma，MM）是一種惡性漿細(xì)胞疾病，屬于B細(xì)胞淋巴瘤的一種，是骨髓漿細(xì)胞異常增殖性疾病。常常伴隨有高鈣血癥、貧血、多發(fā)性溶骨性、腎臟等損害?；颊呋疾『笳５拿庖咔虻鞍椎纳烧系K，較為容易發(fā)生感染。發(fā)病早期無特異性臨床癥狀，容易造成漏診和誤診。多發(fā)生于中老年患者，若得不到及時(shí)治療，嚴(yán)重威脅患者生命安全。臨床診斷MM的方法較多，有影像學(xué)檢查、臨床癥狀及實(shí)驗(yàn)室檢查等[1]。伴隨著流式細(xì)胞術(shù)的不斷發(fā)展，以客觀、靈敏及快速的優(yōu)勢(shì)，在MM診斷中有較高應(yīng)用價(jià)值，在病情檢測(cè)、療效評(píng)價(jià)及預(yù)后判斷中有重要作用。本文通過收集我院56例MM患者，分析流式細(xì)胞術(shù)免疫分型對(duì)MM的診斷價(jià)值對(duì)比。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象

抽取我院2016年1月—2018年12月收治的56例MM患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：均符合《中國(guó)多發(fā)性骨髓瘤診治指南》中的標(biāo)準(zhǔn)[2]；簽署知情同意書，自愿參與此次研究，經(jīng)我院醫(yī)學(xué)理論會(huì)同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：嚴(yán)重心肝腎功能障礙基礎(chǔ)性疾病；其他血液系統(tǒng)疾??；精神病。

男34例，女22例；年齡43～71歲，平均（58.78±5.34）歲；組織器官損害：7例血鈣增高，31例腎功損害，43例貧血，46例骨病變。DS分期：ⅠA 5例，ⅠB 7例，ⅡA 10例，ⅡB 17例，ⅢA 10例，ⅢB 7例。

1.2 研究方法

所有患者均給予骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查、流式細(xì)胞術(shù)檢查、毛細(xì)管免疫分型電泳、毛細(xì)管血清蛋白電泳。

（1）骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查：抽取0.2 mL脊髓液，涂片、晾干、染色、去染、晾干，于涂片、染色良好體尾交界處按照一定順序分類計(jì)數(shù)200個(gè)有核細(xì)胞，從而計(jì)算骨髓瘤細(xì)胞百分比。陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)：骨髓漿細(xì)胞超過10%。

（2）流式細(xì)胞術(shù)：采用Epics Eliet流式細(xì)胞儀，抽取2 mL肝素抗凝骨髓液，選擇5～10×106細(xì)胞/mL單細(xì)胞懸液，每100 μL單細(xì)胞懸液與20 μL好的抗體室溫避光孵育20分鐘，加入氯化銨溶血?jiǎng)┚S持液體。按照1 500 rpm，離心10 min，去除上清，并采用0.5 mL PBS重懸后上機(jī)，PBS洗滌2遍、避光破膜15 min，加入胞漿抗體孵育30 min，洗滌1次后采用0.5 mL PBS重懸。采用BD FACSDiva軟件獲取、記錄及分析數(shù)據(jù)。每管分析10 000個(gè)細(xì)胞，將熒光強(qiáng)度軸設(shè)定為對(duì)數(shù)模式，并以CD45/SSC聯(lián)合CD38/CD138設(shè)門分析評(píng)估骨髓取材。用于多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞免疫分型的抗體有CD45，CD38，CD138，CD19，CD56，胞內(nèi)Kappa輕鏈，胞內(nèi)labda輕鏈。收集CD38＋＋／CD45-／＋細(xì)胞10 000個(gè)，利用同型對(duì)照設(shè)置Cut Off值，細(xì)胞群在某一抗原軸方向整體位移超出Cut Off線≥20%判定為該抗原表達(dá)陽(yáng)性。

（3）毛細(xì)管免疫分型電泳：促凝全血標(biāo)本3 000 r/min離心15分鐘分離血清，樣本同配套試劑一同放入全自動(dòng)毛細(xì)管電泳儀上反應(yīng)、電泳、掃描及判定結(jié)果。每個(gè)樣本進(jìn)行6次血清蛋白電泳，其中一次為標(biāo)準(zhǔn)血清蛋白電泳，另外五次為加入抗IgM、IgA、IgG、k、γ抗體反應(yīng)后的電泳。陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)：在標(biāo)準(zhǔn)血清蛋白電泳圖形中出現(xiàn)底部狹窄、高尖的異常蛋白峰，在加入抗IgM、IgA、IgG、k、γ抗體后的電泳圖形中，如出現(xiàn)異常蛋白峰的消失則為相應(yīng)類型的克隆性Ig。

（4）毛細(xì)管血清蛋白電泳：用Sebia Capillarys全自動(dòng)毛細(xì)管電泳儀及配套試劑，促凝全血標(biāo)本3 000 r/min離心15分鐘分離血清，在全自動(dòng)毛細(xì)管電泳儀上電泳分離、掃描及判定結(jié)果。陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)：掃描圖中α、β、γ區(qū)域底部狹窄，高尖的異常蛋白峰為陽(yáng)性。

1.3 觀察指標(biāo)

（1）記錄MM患者骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查、流式細(xì)胞術(shù)通過CD45/SSC聯(lián)合CD38/CD138設(shè)門分析檢測(cè)、毛細(xì)管免疫分型電泳、毛細(xì)管血清蛋白電泳檢測(cè)的陽(yáng)性率；（2）記錄流式細(xì)胞術(shù)與骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測(cè)出的骨髓異常漿細(xì)胞的比例；（3）記錄流式細(xì)胞術(shù)對(duì)MM的分型結(jié)果及毛細(xì)管免疫分型電泳對(duì)MM的分型結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 比較各種檢查結(jié)果陽(yáng)性率

（1）骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查：骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測(cè)陽(yáng)性率為100%(56/56)，高于流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)陽(yáng)性率96.43%（54/56），但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（注：骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)與流式細(xì)胞術(shù)對(duì)比：χ2=0.073，P=0.674）；高于毛細(xì)管免疫分型電泳檢測(cè)陽(yáng)性率85.71%（48/56）及毛細(xì)管血清蛋白電泳檢測(cè)陽(yáng)性率83.93%（47/56），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（注：骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)與毛細(xì)管免疫分型電泳對(duì)比：χ2=5.653，P=0.015；骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)與毛細(xì)管血清蛋白電泳對(duì)比：χ2=6.471，P=0.009）;（2）流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)陽(yáng)性率為96.43%（54/56），陽(yáng)性檢出率高于毛細(xì)管免疫分型電泳檢測(cè)陽(yáng)性率85.71%（48/56）及毛細(xì)管血清蛋白電泳檢測(cè)陽(yáng)性率83.93%（47/56），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（注：流式細(xì)胞術(shù)與毛細(xì)管免疫分型電泳對(duì)比：χ2=3.953，P=0.047；流式細(xì)胞術(shù)與毛細(xì)管血清蛋白電泳對(duì)比：χ2=4.940，P=0.026）；（3）毛細(xì)管免疫分型電泳與毛細(xì)管血清蛋白電泳檢查陽(yáng)性率分別為85.71%（48/56）、83.93%（47/56），差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（注：毛細(xì)管免疫分型電泳與毛細(xì)管血清蛋白電泳對(duì)比：χ2=0.069，P=0.792）。

表1 流式細(xì)胞術(shù)及毛細(xì)管免疫分型電泳對(duì)MM 的免疫球蛋白kappa 型輕鏈分型結(jié)果比較

表2 流式細(xì)胞術(shù)及毛細(xì)管免疫分型電泳對(duì)MM 的免疫球蛋白Labda 型輕鏈分型結(jié)果比較

2.2 比較流式細(xì)胞術(shù)與骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢出的異常漿細(xì)胞的比例

通過CD45/SSC聯(lián)合CD38/CD138設(shè)門分析，將CD45/SSC聯(lián)合CD38+/CD138+作為鑒別異常漿細(xì)胞的特異性指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)56例MM患者中54例在CD45/SSC散點(diǎn)圖可見異常細(xì)胞群，結(jié)合CD38/CD138鑒別為異常漿細(xì)胞，見圖1。通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)到此54例陽(yáng)性患者中的異常漿細(xì)胞比例為（33.59±8.41）%，低于同時(shí)期的骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查的骨髓漿細(xì)胞比例（43.25±10.82）%，二者做線性相關(guān)統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果pearson相關(guān)系數(shù)r=0.82，tr=10.528，P＜0.05，表明二者呈線性正相關(guān)。

2.3 比較流式細(xì)胞術(shù)及毛細(xì)管免疫分型電泳對(duì)MM的分型結(jié)果

流式細(xì)胞學(xué)檢查56例MM患者中有54例MM的免疫球蛋白呈陽(yáng)性表達(dá)，其中胞內(nèi)Kappa輕鏈單克隆21例（38.9%），胞內(nèi)labda輕鏈單克隆33例（61.1%）。毛細(xì)管免疫分型電泳檢查56例MM患者中48例MM分泌免疫球蛋白，其中表達(dá)Kappa輕鏈型的18例（37.5%），表達(dá)Labda輕鏈型的30例（62.5%），有3例流式細(xì)胞術(shù)胞內(nèi)Kappa輕鏈陽(yáng)性而毛細(xì)管免疫分型電泳為陰性，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（注：流式細(xì)胞術(shù)及毛細(xì)管免疫分型電泳對(duì) MM的免疫球蛋白kappa型輕鏈分型結(jié)果比較：χ2=1.333，P=0.243），有3例流式細(xì)胞術(shù)胞內(nèi)labda輕鏈陽(yáng)性而毛細(xì)管免疫分型電泳為陰性，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（注：流式細(xì)胞術(shù)及毛細(xì)管免疫分型電泳對(duì)MM的免疫球蛋白labda型輕鏈分型結(jié)果比較：χ2=1.333，P=0.243），具體見表1、表2。

3 討論

MM可以歸到B淋巴細(xì)胞淋巴瘤的范圍，其臨床表現(xiàn)較復(fù)雜，且缺乏特異性，早期診斷時(shí)極易誤診或漏診，耽誤最佳治療時(shí)機(jī)[3-4]。骨髓涂片細(xì)胞形態(tài)學(xué)具有直觀、經(jīng)濟(jì)及操作簡(jiǎn)單的特點(diǎn)，是最先用于MM患者診斷中[5]。MM細(xì)胞髓內(nèi)浸潤(rùn)、增值范圍不同，經(jīng)過形態(tài)學(xué)檢查往往需要多次骨髓穿刺，有著較大差異性[6-7]。同時(shí)，在閱片選擇及細(xì)胞識(shí)別上，較強(qiáng)主觀性，與反應(yīng)性漿細(xì)胞增多相鑒別，從而增加誤診。毛細(xì)管血清蛋白電泳、毛細(xì)管免疫分型電泳可有效檢測(cè)骨髓瘤細(xì)胞產(chǎn)生并釋放入血的M蛋白，有較小創(chuàng)傷性，且具有快捷性及經(jīng)濟(jì)性[8-9]。流式細(xì)胞術(shù)免疫分型可快速準(zhǔn)確客觀鑒別出漿液細(xì)胞的良惡性，可客觀及評(píng)估惡性漿液細(xì)胞，并且能夠揭示骨髓瘤細(xì)胞免疫表型的異質(zhì)性及其胞內(nèi)輕鏈的克隆性。以上特點(diǎn)是毛細(xì)管血清蛋白電泳和毛細(xì)管免疫分型電泳技術(shù)無法達(dá)到的[10]。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)CD45/SSC 聯(lián)合CD38/CD138 設(shè)門分析

流式細(xì)胞術(shù)在多發(fā)性骨髓瘤中的應(yīng)用涉及以下幾方面：通過檢測(cè)漿細(xì)胞免疫表型、克隆性，可明確漿細(xì)胞是否是良性、惡性，還是反應(yīng)性的。流式細(xì)胞術(shù)可識(shí)別瘤細(xì)胞獨(dú)有的異常免疫常型，從復(fù)雜的骨髓細(xì)胞群中可圈出極其微量的瘤細(xì)胞；CD38、CD138為漿細(xì)胞特異性的表面標(biāo)志物，CD45在正常漿細(xì)胞弱表達(dá)而在骨髓瘤細(xì)胞表達(dá)減低或不表達(dá)，CD19在正常漿細(xì)胞表達(dá)而在骨髓瘤細(xì)胞弱表達(dá)或不表達(dá)，CD56在正常漿細(xì)胞不表達(dá)而在骨髓瘤細(xì)胞中表達(dá)增高，且被認(rèn)為是疾病預(yù)后不良的標(biāo)志之一，cKappa輕鏈與clabda輕鏈在正常漿細(xì)胞呈多克隆表達(dá)，而在骨髓瘤細(xì)胞中為限制性表達(dá)[11]。同時(shí)可實(shí)現(xiàn)瘤細(xì)胞膜及胞內(nèi)分子檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)輕鏈限制性表達(dá)，并不受到分泌與否及分泌多寡的影響。在本次研究中，通過流式細(xì)胞術(shù)對(duì)胞漿輕鏈限制性表達(dá)的一般特點(diǎn)給予抗體設(shè)置，其檢出率高于其他檢測(cè)方法。同時(shí)，本研究中有2例患者的流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果為陰性，可能與多發(fā)性骨髓瘤的取材相關(guān)[3，12]。流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用較為成熟，應(yīng)用于免疫分型具有較高的準(zhǔn)確性。

綜上所述，流式細(xì)胞術(shù)免疫分型對(duì)MM的診斷有較高價(jià)值，可作為診斷MM的有效手段。