模擬氮沉降對(duì)貝加爾針茅草原土壤氮轉(zhuǎn)化微生物的影響

劉紅梅，張海芳，秦 潔，王 慧，張艷軍，楊殿林

（農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部產(chǎn)地環(huán)境污染防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/天津市農(nóng)業(yè)環(huán)境與農(nóng)產(chǎn)品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300191）

大氣氮沉降增加呈現(xiàn)全球化趨勢(shì)，我國(guó)是繼歐洲、北美之后的第3大氮沉降區(qū)，大氣氮沉降遠(yuǎn)高于全球平均水平[1]。大氣氮沉降借助其對(duì)土壤碳固定[2]、植物氮素利用等的直接或間接作用[3]，極大地干預(yù)了生態(tài)系統(tǒng)碳蓄積和氮素重新分配過程[4-5]。高氮沉降導(dǎo)致土壤氮轉(zhuǎn)化過程發(fā)生變化[6]、土壤可利用性氮含量增加[7]、氮循環(huán)微生物數(shù)量及組成發(fā)生變化[8]，進(jìn)而對(duì)生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生影響。

土壤氮轉(zhuǎn)化主要過程包括生物固氮作用、氨化作用、硝化作用和反硝化作用，這些過程都由土壤微生物所驅(qū)動(dòng)。氮沉降進(jìn)入土壤后的一系列轉(zhuǎn)化離不開與氮素轉(zhuǎn)化的相關(guān)微生物參與。近年來(lái)的研究表明，施氮肥顯著影響固氮菌、硝化菌和反硝化菌群落結(jié)構(gòu)和豐度[8]。適量氮肥添加提高固氮菌豐度，促進(jìn)土壤微生物的固氮功能[9]；高濃度無(wú)機(jī)氮添加抑制固氮菌生長(zhǎng)[10]，從而抑制固氮微生物生長(zhǎng)。Ning等[11]研究發(fā)現(xiàn)氮相關(guān)功能基因?qū)Φ砑铀俾时憩F(xiàn)出不同的敏感性，氨氧化細(xì)菌AOB-amoA基因比氨氧化古菌AOA-amoA基因?qū)Φ砑痈用舾小Ｍ寥腊毖趸?xì)菌豐度隨氮添加量增加而增加，而氨氧化古菌豐度則無(wú)明顯變化[12]。氮肥種類和氮肥施用量會(huì)影響土壤氨氧化微生物組成和豐度[13]。受氮素限制的黃土高原鹽堿草地，施氮后顯著地提高了微生物生物量氮轉(zhuǎn)化速率[14]。在亞熱帶森林、溫帶森林中研究發(fā)現(xiàn)，N2O排放、CH4吸收與AOA、AOB群落豐度分別呈現(xiàn)正、負(fù)相關(guān)關(guān)系，氨氧化菌群落動(dòng)態(tài)能夠解釋土壤CH4吸收和N2O排放之間的消長(zhǎng)作用[15]。

目前，在氮沉降增加的背景下，針對(duì)干旱和半干旱草原土壤氮轉(zhuǎn)化功能基因豐度對(duì)氮沉降增加的響應(yīng)特征還不夠明確。為此，本研究通過施氮模擬氮沉降增加，研究不同氮添加水平對(duì)涉及土壤氮循環(huán)中的固氮nifH基因、氨氧化細(xì)菌AOB-amoA基因、氨氧化古菌AOA-amoA基因和反硝化基因nirK豐度的影響，通過分析氮轉(zhuǎn)化功能基因豐度與土壤理化因子之間的相關(guān)性關(guān)系，研究氮添加對(duì)微生物介導(dǎo)的固氮、氨氧化和反硝化過程的影響及其反饋，為深入認(rèn)識(shí)草地生態(tài)系統(tǒng)氮循環(huán)及其對(duì)氮沉降增加的響應(yīng)機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)域概況與樣地設(shè)置

研究區(qū)域概況、試驗(yàn)樣地設(shè)置及試驗(yàn)前植被類型和基本理化性質(zhì)詳見參考文獻(xiàn)[16]。試驗(yàn)樣地位于內(nèi)蒙古貝加爾針茅草原（48°27′～48°35′N，119°35′～119°41′E）。于2010年開始進(jìn)行圍欄試驗(yàn)，氮添加水平設(shè)置參考國(guó)際上同類研究試驗(yàn)[17-18]。氮添加處理設(shè)8個(gè)水平，依次為：0、15、30、50、100、150、200、300 kg N·hm-2·a-1，分別記為：對(duì)照N0，低氮（N15、N30和N50），高氮（N100、N150、N200和N300）。

氮素為NH4NO3，每年6月中旬和7月中旬進(jìn)行氮添加。共設(shè)置8個(gè)處理水平，4次重復(fù)。小區(qū)面積8 m×8 m，小區(qū)間設(shè)置2 m隔離帶，重復(fù)間設(shè)置5 m隔離帶。

1.2 樣品采集與處理

土壤樣品采集于2015年8月中旬，用土鉆在各小區(qū)采集0～10 cm土壤樣品，每小區(qū)采集10個(gè)點(diǎn)，混合均勻。去除土壤入侵物和根系，將土壤樣品分為兩份，一份保存于冰盒中帶回實(shí)驗(yàn)室，存于-20℃冰柜中；一份土壤樣品于室內(nèi)自然風(fēng)干。

1.3 測(cè)定方法

土壤理化性質(zhì)測(cè)定：土壤pH采用玻璃電極法（土水比1∶2.5），土壤總有機(jī)碳測(cè)定采用重鉻酸鉀外加熱法，土壤全氮用凱氏定氮法，土壤銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量采用氯化鉀溶液提取-流動(dòng)分析儀（QC8000）測(cè)定[19]。土壤微生物生物量氮采用氯仿熏蒸-K2SO4提取-TOC儀（Multi N/C 3000）測(cè)定[20]。土壤可溶性氮以測(cè)定土壤微生物生物量氮時(shí)未熏蒸土壤的全氮含量表示，土壤可溶性有機(jī)氮以土壤可溶性氮減去銨態(tài)氮和硝態(tài)氮的差值表示[21]。

土壤DNA提取：稱取0.25 g在冰柜中保存的土壤樣品，用PowerSoil?DNA Isolationkit試劑盒，按照說(shuō)明書提取土壤總DNA。用Nanodrop2000超微量分光光度計(jì)和1%瓊脂糖電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量。將通過質(zhì)量檢測(cè)的DNA樣品于-20℃冰箱保存待用。

標(biāo)準(zhǔn)品配制：用目的基因引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為50 μL，包括上下游引物各1 μL，模板1 μL，2×Taq MasterMix 25 μL，滅菌超純水22 μL。擴(kuò)增條件為94℃5 min預(yù)變性后；94℃30 s，55℃30 s，72℃ 30 s，共30個(gè)循環(huán)；最后1輪循環(huán)完成后再72℃延伸10 min。反應(yīng)完畢后，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢查擴(kuò)增結(jié)果，目的片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠回收。將回收PCR產(chǎn)物連接至pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)Amp+、IPTG和X-gal的LB平板篩選陽(yáng)性克隆，送去生工生物有限公司進(jìn)行序列測(cè)定分析。

標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：通過做預(yù)實(shí)驗(yàn)，將4種提取測(cè)序正確的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品從101～105倍進(jìn)行10倍稀釋，每個(gè)梯度取2 μL做模板建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

定量PCR檢測(cè)：土壤固氮基因nifH、氨氧化細(xì)菌AOB、氨氧化古菌AOA和反硝化細(xì)菌定量擴(kuò)增引物見表1。擴(kuò)增反應(yīng)體系總體積為20 μL，包括2×GoT-aq?qPCR Master Mix 10 μL，10 μmol·L-1的上下游引物各0.5 μL，DNA模板2 μL（1～10 ng），滅菌超純水7 μL。將加好樣的96-PCR板置于熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)。擴(kuò)增反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性30 s；95℃ 變性5 s，60℃退火40 s，72℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA）、Pearson相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 氮沉降對(duì)土壤化學(xué)性質(zhì)的影響

連續(xù)6年不同氮添加處理下，土壤化學(xué)性質(zhì)變化見表2。高氮添加（N100、N150、N200和N300）土壤有機(jī)碳、硝態(tài)氮和微生物生物量氮含量高于或顯著高于低氮添加（N15、N30和N50）和對(duì)照N0。7個(gè)氮添加處理的土壤pH均低于或顯著低于對(duì)照N0，且高氮添加pH顯著低于低氮添加。土壤全氮含量在不同氮添加處理間無(wú)顯著差異。

2.2 氮沉降對(duì)土壤氮轉(zhuǎn)化功能基因豐度的影響

固氮微生物功能基因nifH豐度在各氮添加處理中的變化范圍在5.26×105～1.43×106copies·g-1soil之間（圖1A）。隨著氮添加水平的升高，nifH豐度表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢(shì)，其中N50處理是對(duì)照N0的2.39倍。N15、N30、N50、N100、N150和 N200處理nifH豐度高于或顯著高于對(duì)照N0。N300處理nifH豐度低于對(duì)照N0，但無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

表1 定量PCR擴(kuò)增引物Table 1 Amplification primer of quantitative PCR

表2 不同氮添加處理下土壤化學(xué)性質(zhì)Table 2 Soil chemical properties in different nitrogen addition treatments

氨氧化細(xì)菌AOB-amoA基因豐度在各氮添加處理中的變化范圍為1.33×107～2.48×107copies·g-1soil之間（圖1B）。N15、N30和N50處理AOB-amoA基因豐度與對(duì)照相比無(wú)顯著差異（P＞0.05），高氮添加（N100、N150、N200和N300）AOB-amoA基因豐度均顯著高于對(duì)照N0（P＜0.05）。表明氮沉降增加使AOB-amoA基因豐度提高。氨氧化古菌AOA-amoA基因豐度在各氮添加處理中的變化范圍為2.56×106～3.97×106copies·g-1soil之間（圖1C）。N30處理AOA-amoA基因豐度最高，但與對(duì)照相比無(wú)顯著差異，其他6個(gè)氮添加處理均低于對(duì)照N0。土壤中AOB的基因拷貝數(shù)遠(yuǎn)高于AOA基因拷貝數(shù)，且高氮添加顯著提高了AOB/AOA比值（圖1E）。

圖1 不同氮處理的功能基因豐度Figure 1 Functional genes in different nitrogen treatments

土壤反硝化功能基因nirK豐度在不同氮添加處理中的變化范圍為 2.88×107～7.53×107copies·g-1soil之間（圖1D）。N15處理nirK基因豐度低于對(duì)照N0，但無(wú)顯著差異（P＞0.05）；N30、N50和N100處理nirK基因豐度均顯著高于對(duì)照N0（P＜0.05）；高氮添加處理（N150、N200和N300）nirK基因豐度顯著低于對(duì)照N0（P＜0.05），顯著提高了氨氧化/反硝化豐度比值（圖1F）。

表3 功能基因拷貝數(shù)與化學(xué)性質(zhì)之間的相關(guān)性分析Table 3 Correlation analysis between functional gene copies and soil chemical properties

2.3 土壤氮素轉(zhuǎn)化功能基因豐度與土壤因子的相關(guān)性

土壤氮轉(zhuǎn)化功能基因拷貝數(shù)與土壤化學(xué)性質(zhì)相關(guān)性分析見表3。土壤nifH基因拷貝數(shù)與總有機(jī)碳、硝態(tài)氮和微生物生物量氮含量呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），與土壤銨態(tài)氮含量呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01）。土壤AOB-amoA基因拷貝數(shù)與有機(jī)碳、硝態(tài)氮、可溶性有機(jī)氮和微生物生物量氮含量呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），與土壤pH呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01）。土壤AOA-amoA基因拷貝數(shù)與土壤pH呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），與土壤有機(jī)碳、硝態(tài)氮和微生物生物量氮含量呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。土壤nirK基因拷貝數(shù)與土壤pH和銨態(tài)氮含量呈極顯著正相關(guān)關(guān)系（P＜0.01），與土壤有機(jī)碳、硝態(tài)氮、可溶性有機(jī)氮和微生物生物量氮含量呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系（P＜0.05）。AOB/AOA與土壤有機(jī)碳、硝態(tài)氮、可溶性有機(jī)氮和微生物生物量氮呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），與pH呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01）。氨氧化/反硝化與土壤有機(jī)碳、硝態(tài)氮、可溶性有機(jī)氮和微生物生物量氮呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），與pH和銨態(tài)氮含量呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。

3 討論

3.1 土壤固氮功能基因?qū)Φ两淀憫?yīng)的綜合分析

土壤固氮微生物是一類重要的氮轉(zhuǎn)化功能微生物，其能夠?qū)⒖諝庵械牡€原成氨供給植物吸收利用。固氮微生物數(shù)量與輸入土壤的外源氮素密切相關(guān)，施氮量過高會(huì)降低固氮菌的豐度并抑制固氮酶的活性，并對(duì)固氮菌群落組成產(chǎn)生顯著影響[26]。本研究中，隨著氮添加水平的升高，nifH豐度表現(xiàn)為先升高后降低趨勢(shì)，N300處理降低了nifH基因相對(duì)豐度，其他6個(gè)氮添加處理均高于或顯著高于對(duì)照N0。即低于200 kg N·hm-2·a-1時(shí)更有利于固氮菌的生長(zhǎng)，而高于300 kg N·hm-2·a-1時(shí)反而抑制其生長(zhǎng)。這與劉彩霞等[27]得出的氮沉降（銨態(tài)氮）高于60 kg N·hm-2·a-1抑制杉木林固氮功能微生物生長(zhǎng)結(jié)論一致。Zhang等[7]研究也表明，高濃度無(wú)機(jī)氮添加抑制固氮菌生長(zhǎng)。前人研究認(rèn)為，氮肥輸入降低固氮菌的豐度是由于土壤酸化或高氮含量造成的[28]。

土壤固氮菌豐度與土壤有機(jī)碳含量、pH、有效磷含量等其他化學(xué)因子密切相關(guān)。本研究相關(guān)分析表明，nifH基因豐度與土壤有機(jī)碳含量呈顯著負(fù)相關(guān)性。由于生物固氮過程需要消耗大量能量，而該過程在很大程度上依賴于土壤中的有機(jī)碳含量。高氮添加雖然提高了土壤有機(jī)碳含量，但高氮添加導(dǎo)致高的速效氮含量反而會(huì)抑制土壤的生物固氮過程。本研究表明，nifH基因豐度與銨態(tài)氮含量呈極顯著正相關(guān)，與土壤硝態(tài)氮含量呈顯著負(fù)相關(guān)。表明氮添加量增加引起土壤可利用性氮含量變化是引起固氮功能基因豐度發(fā)生變化的重要驅(qū)動(dòng)因素。Wang等[29]研究表明，長(zhǎng)期施肥引起小麥生長(zhǎng)季土壤銨態(tài)氮含量改變，顯著影響固氮菌豐度，不利于土壤微生物的固氮功能。本研究中，低氮添加促進(jìn)土壤的生物固氮過程，但過高氮添加反而會(huì)抑制土壤的生物固氮過程。表明未來(lái)連續(xù)高氮沉降可能不利于貝加爾針茅草原土壤微生物的固氮功能。

3.2土壤氨氧化功能基因?qū)Φ两淀憫?yīng)的綜合分析

硝化作用是氮素轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵過程，由含氨單加氧酶基因（amoA）、氨氧化細(xì)菌（AOB）和氨氧化古菌（AOA）共同驅(qū)動(dòng)氨氧化過程是硝化作用的限速步驟，其數(shù)量和結(jié)構(gòu)組成變化可反映土壤氮素變化[30]。目前氮肥或氮添加對(duì)土壤硝化作用的影響研究大多是針對(duì)這一步驟開展的。一般情況下，氨是微生物進(jìn)行硝化作用的直接底物，酸性土壤中銨根離子分解處理的氨較少，從而抑制AOB生長(zhǎng)[31]。本研究，低氮添加（N15、N30和N50）對(duì)氨氧化細(xì)菌AOB相對(duì)豐度無(wú)顯著影響，而高氮添加顯著提高了氨氧化細(xì)菌豐度。說(shuō)明連續(xù)6 a高氮添加，促進(jìn)了AOB的生長(zhǎng)繁殖。這與Li等[32]對(duì)內(nèi)蒙古草原10 a氮添加試驗(yàn)AOB基因豐度變化結(jié)果一致。Ai等[33]在對(duì)小麥玉米輪作潮土研究表明，氮肥添加可顯著提高AOB的數(shù)量。其可能原因是土壤中存在對(duì)NH+4有較高親和力的未知的AOB[34]或者是某些AOB的生長(zhǎng)不以NH+4作為唯一底物[35]。與AOB豐度變化情況不同，除N30處理與對(duì)照相比無(wú)顯著差異外，其余6種氮添加處理均降低了土壤氨氧化古菌基因豐度，說(shuō)明長(zhǎng)期氮沉降增加會(huì)導(dǎo)致土壤氨氧化古菌豐度降低。長(zhǎng)期施氮肥導(dǎo)致南方紅壤中氨氧化古菌豐度降低[36]，這表明盡管草原暗栗鈣土和南方紅壤在pH、有機(jī)質(zhì)和碳氮水平上存在較大差異，但長(zhǎng)期氮添加和長(zhǎng)期施用氮肥對(duì)這兩種土壤中氨氧化古菌的影響存在一致性。在本研究中，各氮添加處理土壤AOB-amoA基因拷貝數(shù)比AOA-amoA基因拷貝數(shù)高一個(gè)數(shù)量級(jí)，可見本試驗(yàn)環(huán)境下更有利于AOB生長(zhǎng)。這與Yao等[37]在茶園酸性土壤AOA主導(dǎo)氨氧化作用的研究結(jié)果不一致。前人研究表明，AOB和AOA生長(zhǎng)對(duì)土壤含氮量響應(yīng)不同，AOB對(duì)高氮環(huán)境較為適應(yīng)，而AOA傾向于低氮環(huán)境[38]。本試驗(yàn)中高氮添加處理土壤硝態(tài)氮含量顯著高于低氮添加和對(duì)照處理，從而促進(jìn)了AOB生長(zhǎng)。但對(duì)于這一原因推測(cè)的合理性還需要進(jìn)一步深入研究。

大量研究表明，多種土壤環(huán)境因子，包括pH、溫度、土壤類型和利用方式等都會(huì)影響氨氧化微生物的群落組成和數(shù)量，從而使氮添加對(duì)土壤氨氧化微生物影響存在很大不確定性。本研究氨氧化細(xì)菌和氨氧化古菌與土壤理化因子的相關(guān)分析表明，影響氨氧化功能基因相對(duì)豐度的土壤理化因子為pH、有機(jī)碳、硝態(tài)氮和微生物生物量氮含量。這與Hayden等[39]對(duì)澳大利亞農(nóng)業(yè)與草地氮轉(zhuǎn)化功能基因驅(qū)動(dòng)因子研究結(jié)果一致。相關(guān)分析表明，AOB基因拷貝數(shù)與土壤有機(jī)碳含量呈極顯著正相關(guān)，說(shuō)明連續(xù)6 a氮添加提高了貝加爾針茅草原土壤有機(jī)碳含量是促進(jìn)氨氧化細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖的重要因素。一些研究表明，氨氧化細(xì)菌適合在氮素含量豐富的土壤中生存，且其數(shù)量與土壤pH呈顯著負(fù)相關(guān)[14，40]。本研究中，氨氧化細(xì)菌基因拷貝數(shù)與土壤pH呈極顯著負(fù)相關(guān)。這與其研究結(jié)果一致。原因可能是，隨著氮添加水平的增加，土壤pH降低，使得土壤中耐酸性AOB數(shù)量增多[41]。氨氧化古菌與土壤化學(xué)因子的相關(guān)性分析表明，氨氧化古菌基因拷貝數(shù)與土壤pH呈極顯著正相關(guān)，說(shuō)明貝加爾針茅草原土壤中AOA基因豐度隨著pH降低而顯著降低。高氮添加增加了土壤中硝態(tài)氮含量，相應(yīng)的AOB基因拷貝數(shù)增加，而AOA基因拷貝數(shù)則減少，AOB/AOA比值提高，且隨著氮添加水平的增加，提高的幅度明顯增加。表明連續(xù)6 a高氮添加，改變了氨氧化微生物相對(duì)豐度，氨氧化微生物對(duì)氨氧化的相對(duì)貢獻(xiàn)也可能發(fā)生改變。但氨氧化微生物對(duì)氨氧化作用的相對(duì)貢獻(xiàn)率是否發(fā)生改變，還需采用同位素示蹤技術(shù)進(jìn)一步研究。相關(guān)分析表明，AOA基因拷貝數(shù)與土壤硝態(tài)氮含量呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，這與Di等[38]的AOA適合于低氮環(huán)境的研究結(jié)論一致。本研究中長(zhǎng)期連續(xù)氮添加導(dǎo)致的土壤化學(xué)性質(zhì)變化，尤其是土壤pH降低導(dǎo)致土壤中AOA豐度明顯降低，可能降低土壤中AOA的氨氧化功能，進(jìn)一步影響貝加爾針茅草原土壤的硝化作用。

3.3 土壤反硝化功能基因?qū)Φ两淀憫?yīng)的綜合分析

反硝化作用是將硝酸根還原為N2O或N2的過程，是由許多厭氧或兼性厭氧微生物參與的一系列酶催化過程。這些酶主要由功能基因硝酸還原酶narG/napA、亞硝酸還原酶nirK/nirS、一氧化氮還原酶norB和氧化亞氮還原酶nosZ編碼。不同反硝化功能基因型對(duì)環(huán)境因子的影響存在較大差異。其中，亞硝酸還原酶nirK/nirS催化亞硝酸鹽還原成NO是微生物驅(qū)動(dòng)反硝化作用關(guān)鍵步驟。已有研究表明，nirK型反硝化細(xì)菌對(duì)施肥種類和施肥量都十分敏感[42]。連續(xù)6 a氮添加顯著影響了nirK相對(duì)豐度，N30、N50和N100處理顯著提高了nirK相對(duì)豐度，N150、N200和N300處理顯著降低了nirK相對(duì)豐度。表明，高氮添加（N150、N200和N300）對(duì)nirK豐度有明顯的抑制作用。

環(huán)境因子如土壤pH、溫度、有機(jī)碳、硝態(tài)氮含量是影響反硝化作用的重要因素。本研究相關(guān)分析表明，nirk相對(duì)豐度與土壤pH、有機(jī)碳、硝態(tài)氮、銨態(tài)氮、可溶性有機(jī)氮和微生物生物量氮含量均呈顯著相關(guān)性（表3）。Xie等[43]研究認(rèn)為土壤有機(jī)碳和硝酸鹽含量是驅(qū)動(dòng)青藏高原草甸反硝化功能基因nirK豐度的重要土壤因子。Jahangir等[44]研究表明，反硝化活性的高低與提供給細(xì)菌生長(zhǎng)的有機(jī)質(zhì)的質(zhì)量和數(shù)量密切相關(guān)。土壤反硝化作用最適pH范圍為7.0～8.0，在此范圍內(nèi)反硝化作用最好[45]。在本研究中，高氮添加（N150、N200和N300）處理pH顯著低于對(duì)照N0，降低了土壤pH，抑制了反硝化功能基因nirK豐度，并由此可能對(duì)反硝化作用產(chǎn)生影響。一般情況下，土壤AOB基因豐度增加會(huì)提高反硝化作物的底物硝酸鹽含量，進(jìn)而促進(jìn)反硝化微生物驅(qū)動(dòng)的反硝化作用，造成氮素流失。但本研究中，高氮（N150、N200和N300）顯著降低了反硝化細(xì)菌nirK基因豐度，而硝態(tài)氮含量卻顯著提高。說(shuō)明高氮添加驅(qū)動(dòng)的土壤氨氧化作用高于驅(qū)動(dòng)的土壤的反硝化作用。土壤nirK基因豐度與土壤硝態(tài)氮含量呈極顯著負(fù)相關(guān)驗(yàn)證了這一觀點(diǎn)。

上述研究表明，貝加爾針茅草原土壤反硝化活性受土壤化學(xué)性質(zhì)特別是pH、有機(jī)碳、硝態(tài)氮、銨態(tài)氮、可溶性有機(jī)氮和微生物生物量氮含量的顯著影響。此外，由于不同反硝化過程所涉及的酶不同，同時(shí)攜帶不同反硝化基因的微生物種群對(duì)環(huán)境因子響應(yīng)的差異，因此，揭示不同氮添加水平對(duì)反硝化功能微生物基因豐度的影響，需要對(duì)不同類型的反硝化微生物開展深入研究。

4 結(jié)論

（1）隨著氮添加水平的增加，固氮細(xì)菌nifH基因豐度呈現(xiàn)先升高后降低趨勢(shì)。低于200 kg N·hm-2·a-1時(shí)促進(jìn)固氮菌生長(zhǎng)。影響固氮菌nifH主要環(huán)境因子是土壤有機(jī)碳、銨態(tài)氮、硝態(tài)氮和微生物生物量氮含量。

（2）高氮添加（N100、N150、N200和N300）提高了AOB基因豐度，降低了AOA基因豐度，并顯著提高了AOB/AOA，表明氮添加量增加可能使AOB在貝加爾針茅草原土壤硝化過程中占主導(dǎo)作用。影響AOB、AOA基因豐度的主要環(huán)境因子是土壤pH、有機(jī)碳、硝態(tài)氮和微生物生物量氮含量。

（3）高氮添加（N150、N200和N300）降低了反硝化細(xì)菌nirK基因豐度。氮添加量的增加促進(jìn)了AOB主導(dǎo)的氨氧化過程，而反硝化微生物nirK豐度的降低提高了氨氧化產(chǎn)物的積累，繼而提高了土壤中的硝態(tài)氮含量。影響反硝化細(xì)菌nirK的主要環(huán)境因子是土壤pH、有機(jī)碳、硝態(tài)氮、銨態(tài)氮、可溶性有機(jī)氮和微生物生物量氮含量。