魚類貯運(yùn)過程中蛋白質(zhì)相關(guān)品質(zhì)變化機(jī)制的研究進(jìn)展

相悅，孫承鋒，楊賢慶，李來好，魏涯，岑劍偉，王晶，趙永強(qiáng)*

(1. 煙臺大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 山東 煙臺 264005； 2. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所， 農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品加工重點實驗室， 國家水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)中心， 廣州 510300； 3. 江蘇省海洋生物產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心， 江蘇 連云港 222005)

魚類味道鮮美，蛋白質(zhì)含量高，脂肪含量低，且富含維生素和人體必需脂肪酸，現(xiàn)已成為人們?nèi)粘ｏ嬍车闹匾M成部分[1]。然而，由于其水分含量較高，在流通期間易受微生物與內(nèi)源酶的影響，發(fā)生品質(zhì)劣變，據(jù)統(tǒng)計，每年全球約有30%的水產(chǎn)品因腐敗變質(zhì)而失去食用價值[2-3]。因此，明確水產(chǎn)品流通過程中的質(zhì)變機(jī)理，并采取相應(yīng)方法保證其在貯運(yùn)期間的質(zhì)量安全至關(guān)重要[4]。研究表明，低溫貯藏可抑制微生物和蛋白酶活性，延長魚類的貨架期[5]。其中，冷藏與凍藏是常見的貯藏方式，此外流化冰[6]、冰溫[7]等新型保鮮方式也能有效延緩其品質(zhì)劣變過程，減少魚類腐敗變質(zhì)帶來的經(jīng)濟(jì)損失。目前，關(guān)于魚類貯藏期間品質(zhì)變化機(jī)理的研究多集中于新鮮度指標(biāo)[8-9]、蛋白質(zhì)生化指標(biāo)的測定[10]和基于聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)分析蛋白質(zhì)降解[11]等方面，而對于貯藏過程中魚類蛋白質(zhì)微觀變化的研究還在起步階段。高通量蛋白質(zhì)分離與鑒定技術(shù)已成為水產(chǎn)品貯藏、加工等方面最具前景的檢測技術(shù)[12]，該技術(shù)因具耗時短[13]、靈敏度高[12]且可同時對一種或多種樣品進(jìn)行多組分檢測與鑒定[14]等優(yōu)點，已成為目前蛋白質(zhì)組學(xué)研究的常用技術(shù)[15-16]。因此，將基于高通量蛋白質(zhì)分離與鑒定的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)應(yīng)用于水產(chǎn)品領(lǐng)域，有利于在分子水平分析不同因素對水產(chǎn)品品質(zhì)的影響機(jī)制。

為總結(jié)近年來魚類貯運(yùn)過程中品質(zhì)變化機(jī)制的研究進(jìn)展，文章分別從魚類品質(zhì)變化影響因素、貯運(yùn)中蛋白質(zhì)變化規(guī)律與蛋白質(zhì)相關(guān)品質(zhì)變化的分子機(jī)制等3個方面系統(tǒng)地綜述了魚類貯運(yùn)期間蛋白質(zhì)變化導(dǎo)致品質(zhì)劣變的相關(guān)機(jī)制，并對蛋白質(zhì)組學(xué)在魚類品質(zhì)評價與質(zhì)量安全研究方面的應(yīng)用前景予以展望，以期為通過蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析魚類貯藏過程的品質(zhì)變化機(jī)理的研究提供理論參考。

1 魚類品質(zhì)變化的影響因素

魚類品質(zhì)受生長、捕獲、加工與流通過程中多種因素影響，如生長與捕獲階段的養(yǎng)殖環(huán)境、飼料組成和捕獲前應(yīng)激等因素；捕后階段的致死方式、貯藏條件、加工方法和流通方式等因素均可對魚類品質(zhì)造成影響[16-17]。

目前已有研究表明，致死方式與捕獲前的應(yīng)激反應(yīng)對魚肉的理化特性有顯著影響[18-20]。加工時，魚類對不同致死方式的應(yīng)激反應(yīng)均會消耗其肌肉能量，產(chǎn)生乳酸，降低肌肉pH，導(dǎo)致其僵直時間提前，對魚肉品質(zhì)保持產(chǎn)生不利影響[21]。捕獲前魚類應(yīng)激反應(yīng)可誘導(dǎo)結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)以及能量代謝發(fā)生變化，當(dāng)魚類在低氧條件下飼養(yǎng)時，其肌肉代謝轉(zhuǎn)為生酮途徑代謝，導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)表達(dá)量減少，進(jìn)而造成了魚肉紅度值降低與剪切力下降[22-23]。飼料組成對魚肉的品質(zhì)變化也有較大影響。有研究表明，喂食不同品質(zhì)的魚粉會影響鱈(Gadusmorhua)的生長速度和飼料利用率，品質(zhì)差的魚粉會使其肝臟脂質(zhì)沉積量增加，導(dǎo)致鱈肝體指數(shù)(hepatosomatic index)升高，進(jìn)而造成其在加工環(huán)節(jié)出現(xiàn)出肉率降低的情況[24]。魚類死亡后，其肌肉代謝方式從有氧代謝轉(zhuǎn)變?yōu)闊o氧代謝，ATP脫氫酶催化ATP降解產(chǎn)生游離氫離子，導(dǎo)致肌肉僵硬，隨后參與蛋白質(zhì)水解的組織蛋白酶、鈣激活蛋白酶以及微生物將蛋白質(zhì)降解為胺類等小分子物質(zhì)，使魚肉的新鮮度降低。另有研究表明，魚類貯藏過程中的品質(zhì)變化與貯藏的溫度和時間密切相關(guān)[25]。Cai等[26]研究發(fā)現(xiàn)冷凍溫度越低，鱸(Lateolabraxjaponicas)體內(nèi)的蛋白質(zhì)與脂肪氧化程度越低；同時，冷凍期間的冰晶形成也會影響持水力和質(zhì)構(gòu)等指標(biāo)。Liu等[27]發(fā)現(xiàn)鱸在-80 ℃能夠長期貯存并保持較好品質(zhì)，而液氮的超低溫處理會破壞魚肉結(jié)構(gòu)，不利于其長期貯存。此外，冷凍速率的快慢也會影響冰晶的大小與分布進(jìn)而破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致魚肉汁液流失率升高，造成營養(yǎng)流失。因此，明確魚肉品質(zhì)變化的影響因素，探究貯運(yùn)過程中魚肉品質(zhì)變化機(jī)理并采取適當(dāng)措施對于延緩魚肉腐敗具有重要意義。

2 貯運(yùn)過程中魚肉蛋白質(zhì)的變化

在貯運(yùn)過程中，魚肉蛋白質(zhì)的變化主要表現(xiàn)在變性、降解和氧化等方面。蛋白質(zhì)變化過程中溶解度、生化特性和降解情況等指標(biāo)的變化可反映魚肉的品質(zhì)變化[17]，明確魚類貯運(yùn)過程中蛋白質(zhì)變化機(jī)理對保障其質(zhì)量安全至關(guān)重要。

2.1 蛋白質(zhì)變性

衡量魚肉蛋白質(zhì)變性程度的指標(biāo)主要包括：空間結(jié)構(gòu)、溶解性、Ca2+-ATPase活性、巰基和二硫鍵含量及表面疏水性等[28]。光學(xué)顯微鏡[27]、電子顯微鏡[29]以及傅里葉紅外光譜技術(shù)[30-31]常用于探究魚肉微觀結(jié)構(gòu)及肌原纖維蛋白構(gòu)象(α螺旋及β折疊等)變化。魚肉冷凍貯存過程中，蛋白質(zhì)變性引起的交聯(lián)聚集現(xiàn)象會導(dǎo)致溶解度下降，疏水性氨基酸暴露，致使蛋白質(zhì)表面疏水性增加[28]。貯藏期間肌球蛋白變性導(dǎo)致內(nèi)部活性巰基暴露，使其易被氧化，同時，蛋白質(zhì)聚集對巰基的掩蔽作用也會導(dǎo)致活性巰基含量下降，肌球蛋白頭部氧化，更易造成Ca2+-ATP酶活性降低[32]。Benjakul等[33]研究發(fā)現(xiàn)5種熱帶魚魚肉在-18 ℃貯藏條件下，蛋白質(zhì)Ca2+-ATPase活性均顯著降低，Mg2+-EGTA-ATP酶活性增加；其中，黃花魚(Pennahaimacrophthalmus)和條鰭(Saurudamicropectoralis)的二硫鍵含量更高，說明冷凍貯藏可使肌球蛋白和肌鈣蛋白變性，且變性程度可能與物種差異有關(guān)。此外，冰晶的形成、脂肪氧化均會造成蛋白質(zhì)變性。冷凍期間形成的冰晶可破壞魚肉超微結(jié)構(gòu)并將溶質(zhì)濃縮在肌肉中，對魚肉蛋白質(zhì)的功能特性和感官品質(zhì)產(chǎn)生負(fù)面影響，造成蛋白質(zhì)溶解度、乳化性、持水力與質(zhì)構(gòu)評分下降[34]。有研究表明，貯運(yùn)過程中溫度升高可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)冰晶融化，產(chǎn)生的水因水蒸氣壓差作用擴(kuò)散到細(xì)胞外間隙；溫度下降時這些水凝結(jié)在細(xì)胞間隙上，引起冰晶變大、肌肉細(xì)胞機(jī)械損傷、細(xì)胞失水與蛋白質(zhì)變性等現(xiàn)象[35-36]。此外，脂質(zhì)和游離脂肪酸的氧化產(chǎn)物可影響肌漿蛋白的溶解度，蛋白質(zhì)與脂質(zhì)降解產(chǎn)物的相互作用也會降低鹽溶性蛋白溶解度[37]。抑制冷凍變性的措施主要有：在魚肉制品中添加藻類多糖[38]、蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物等綠色抗凍劑[1]，降低魚肉貯藏溫度，提高冷凍速率以減少魚肉通過最大冰晶生成帶的時間等[28]。目前，關(guān)于蛋白質(zhì)冷凍變性的研究主要集中在蛋白酶活性變化、溶解性變化及蛋白質(zhì)完整性等方面[39]，未來可采用分辨率及通量更高的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)開展魚類肌肉低豐度蛋白質(zhì)冷凍變性情況的研究。

2.2 蛋白質(zhì)降解

魚類肌肉中存在較高水平的內(nèi)源性蛋白酶，加工或貯存處理不當(dāng)易導(dǎo)致蛋白質(zhì)降解[11]。蛋白質(zhì)降解、脂肪氧化及其在魚肉中的組成與分布變化等都會影響魚肉的微觀結(jié)構(gòu)和質(zhì)構(gòu)特性。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)圖譜中不同分子量蛋白條帶的光密度[9]以及內(nèi)源性蛋白酶活性變化[40-41]常用于探究貯藏期間魚肉蛋白質(zhì)的降解機(jī)理。原子力顯微鏡(atomic force microscopy，AFM)可觀察到肌原纖維蛋白質(zhì)的納米結(jié)構(gòu)變化，有利于探究肌原纖維蛋白質(zhì)的降解方式及交聯(lián)聚集現(xiàn)象[42]。此外，貯藏期間三氯乙酸可溶性肽[11]、氨基酸[43]及揮發(fā)性鹽基氮[9]含量的增加均可表示蛋白質(zhì)降解程度增加。據(jù)報道，在冷凍貯存期間，肌球蛋白重鏈比肌動蛋白更易發(fā)生降解。Subbaiah等[44]研究了尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)在-18 ℃條件下貯存150 d期間質(zhì)構(gòu)的變化過程以及蛋白質(zhì)降解情況，通過SDS-PAGE圖譜發(fā)現(xiàn)肌動蛋白對水解過程具有更強(qiáng)的抵抗力，貯藏前期羅非魚肌肉發(fā)生軟化現(xiàn)象，這是由于其蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)在內(nèi)源蛋白酶的作用下發(fā)生降解造成的；而在貯藏120 d后，由于肌肉持水力下降導(dǎo)致其硬度增加。魚類死亡后體內(nèi)的鈣激活蛋白酶被Ca2+激活，將蛋白質(zhì)降解為多肽片段，同時，由于肌肉中有機(jī)酸的積累會抑制磷酸果糖激酶的活性，導(dǎo)致pH下降，釋放出組織蛋白酶降解肌原纖維蛋白中分子量低的肽段[5]。隨后，腐敗微生物中的酶(如氨基酸脫羧酶)將氨基酸等含氮化合物分解成胺、三甲胺、醛及硫醇等與異味有關(guān)的小分子物質(zhì)[45]。Ge等[46]研究了低溫保鮮期間草魚(Ctenopharyngodonidella)魚片質(zhì)地軟化機(jī)理，發(fā)現(xiàn)與微生物酶相比，內(nèi)源性組織蛋白酶在草魚片自溶過程中起主要作用；并探究了冰藏條件下內(nèi)源性組織蛋白酶在草魚魚片質(zhì)量劣變中的作用，得出組織蛋白酶B和B+L的酶效比組織蛋白酶D的酶效高2倍以上，表明組織蛋白酶B和B+L在冷藏草魚魚片質(zhì)構(gòu)變化中起主要作用[47]。近期，有學(xué)者通過電泳結(jié)合低場核磁共振技術(shù)(low-field nuclear magnetic resonance，LF-NMR)研究發(fā)現(xiàn)，貯運(yùn)過程中蛋白質(zhì)構(gòu)象及肌原纖維蛋白質(zhì)疏水作用的改變是導(dǎo)致魚肉質(zhì)構(gòu)變化的另一個重要原因[39]。因此，應(yīng)進(jìn)一步通過蛋白質(zhì)降解和蛋白質(zhì)疏水作用機(jī)制探究魚類死亡后肌肉軟化的分子機(jī)理。目前，研究主要集中在貯藏過程蛋白質(zhì)的降解情況，而對細(xì)胞骨架蛋白或膠原蛋白降解產(chǎn)物及變化規(guī)律方面分析較少，關(guān)于低溫貯運(yùn)過程中由上述2種蛋白質(zhì)引起的魚類肌肉蛋白質(zhì)構(gòu)變化機(jī)理的認(rèn)知還不全面，今后仍需結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)、生物信息學(xué)技術(shù)以及微觀結(jié)構(gòu)解析等進(jìn)行更深入的研究[36]，全面掌握魚肉自溶過程中蛋白質(zhì)變化機(jī)理。

2.3 蛋白質(zhì)氧化修飾

魚類貯藏過程中蛋白質(zhì)易發(fā)生氧化，蛋白質(zhì)氧化是蛋白質(zhì)直接或間接受到活性誘導(dǎo)物質(zhì)誘導(dǎo)所發(fā)生的一種共價鍵修飾變化[48]?；钚匝蹩晒舭被嵘婶驶苌铮⑴c游離的氨基反應(yīng)形成酰胺鍵，導(dǎo)致氨基酸發(fā)生氧化修飾作用。貯藏過程中活性巰基基團(tuán)的損失、蛋白質(zhì)之間的交聯(lián)也是蛋白質(zhì)氧化的重要形式[49]。通常通過羰基、巰基和蛋白質(zhì)的裂解與交聯(lián)聚合程度來評價蛋白質(zhì)氧化程度，此外，還可通過蛋白質(zhì)表面疏水性以及蛋氨酸、席夫堿和游離氨基含量等指標(biāo)進(jìn)行判斷[48]。研究表明，自由基氧化體系會破壞魚肉肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)[50-51]。李學(xué)鵬等[50]探究了不同氧化體系對魚肉肌原纖維蛋白交聯(lián)和聚集的影響，結(jié)果表明，羥自由基氧化體系中，肌原纖維蛋白質(zhì)發(fā)生聚集，使得粒徑增大；而超氧陰離子自由基氧化體系中，肌原纖維蛋白發(fā)生降解，導(dǎo)致粒徑減小。另有研究表明，羥自由基氧化體系能促進(jìn)肌纖維中粗絲蛋白的降解，但該氧化體系會抑制細(xì)胞骨架蛋白和連接蛋白的降解[51]。針對由活性氧(reactive oxygen species，ROS)引起的蛋白質(zhì)氧化檢測，可先對蛋白質(zhì)羰基化產(chǎn)物進(jìn)行衍生標(biāo)記，隨后采用二維電泳(2-dimensional electrophoresis，2-DE)法檢測發(fā)生氧化羰基化的蛋白質(zhì)[52]。Kjaersgard等[53]通過研究虹鱒(Oncorhynchusmykiss)在冷凍貯藏過程中的蛋白質(zhì)氧化情況，發(fā)現(xiàn)不同蛋白質(zhì)對羰基化的敏感性存在差異，并推測這可能與其細(xì)胞定位、氨基酸序列及生物化學(xué)功能的差異性相關(guān)。Pazos等[54]通過熒光素-5-氨基硫脲(fluorescein-5-thiosemicarbazide，F(xiàn)TSC)標(biāo)記蛋白質(zhì)羰基結(jié)合1-D及2-D凝膠電泳的方法研究了鯖(Scomberscombrus)肉糜冷藏(4 ℃)期間肌原纖維蛋白的羰基化程度。結(jié)果表明，冷藏過程中，其α骨骼肌動蛋白、糖原磷酸化酶和甘油醛-3-磷酸脫氫酶亞型蛋白質(zhì)以及幾種未命名蛋白質(zhì)的氧化程度均有所增加，該研究雖成功觀察到肌球蛋白重鏈(myosin heavy chain，MHC)的降解，但并未觀察到MHC出現(xiàn)羰基化反應(yīng)。

貯運(yùn)期間的溫度波動會促進(jìn)蛋白質(zhì)氧化程度。市場流通中的加工肉品存在反復(fù)凍融的情況，冰晶的重復(fù)生成會導(dǎo)致肌肉細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞，胞內(nèi)的溶酶體酶和促氧化物質(zhì)釋放，使得蛋白質(zhì)氧化更易發(fā)生[48]。因此，控制貯藏時間、避免溫度波動對降低貯藏過程中蛋白質(zhì)氧化變性程度至關(guān)重要。

此外，蛋白質(zhì)與脂質(zhì)氧化產(chǎn)生的醛類物質(zhì)經(jīng)相互作用可形成席夫堿而導(dǎo)致蛋白質(zhì)發(fā)生聚集[55-56]，脂肪氧化的中間產(chǎn)物(如羥自由基等)也會促進(jìn)蛋白質(zhì)氧化[55]。蛋白質(zhì)氧化可導(dǎo)致必需氨基酸損失及機(jī)體消化率降低，進(jìn)而降低肌肉的營養(yǎng)品質(zhì)，氧化釋放的羰基和席夫堿還可能對風(fēng)味產(chǎn)生負(fù)面影響[57]。

魚肉貯運(yùn)過程中紅度值(a*)普遍降低，魚肉顏色受肌肉蛋白質(zhì)組譜、肌紅蛋白含量及脂質(zhì)氧化程度的影響，這些因素的綜合作用可影響肌紅蛋白結(jié)構(gòu)和氧化還原狀態(tài)，當(dāng)肌紅蛋白第六配位點被水占據(jù)且血紅素中的鐵以Fe3+形式存在時，將造成高鐵肌紅蛋白的積累，使肉色呈紅棕色[5, 22]。植物提取物(如葡萄籽、丁香提取物)等天然抗氧化劑[58]、蛋白酶抑制劑[59]結(jié)合低溫、可食性涂膜[45]及氣調(diào)包裝[60]等方法常用于抑制魚肉貯運(yùn)中微生物繁殖，清除自由基產(chǎn)物，減少脂肪及蛋白質(zhì)氧化程度。目前，多數(shù)研究集中在建立氧化評價體系和氧化修飾(如羰基化、硫醇氧化和芳香烴羥基化)對肉品品質(zhì)的影響等方面，雖然對蛋白氧化機(jī)理有一定剖析，但不同影響因素下蛋白質(zhì)氧化的具體機(jī)制尚不明確。利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對魚類貯藏期間發(fā)生氧化的蛋白質(zhì)種類與氧化程度進(jìn)行分析，有利于探明魚肉蛋白質(zhì)氧化機(jī)理。

3 魚肉品質(zhì)相關(guān)蛋白質(zhì)的分子機(jī)制

蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)是一種可用于監(jiān)測基因表達(dá)、蛋白質(zhì)譜并能確定蛋白質(zhì)功能和相互作用的高通量工具和方法[25]。以往關(guān)于水產(chǎn)養(yǎng)殖中蛋白質(zhì)組學(xué)的應(yīng)用研究多數(shù)依賴于電泳技術(shù)，該方法雖可對缺乏基因組測序的物種進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定，但耗時長，因而需開發(fā)更快速和靈敏的技術(shù)進(jìn)行水產(chǎn)品品質(zhì)鑒定，以確保高質(zhì)量產(chǎn)品的流通[61]。隨著質(zhì)譜技術(shù)的進(jìn)步及生物信息學(xué)工具和基因組信息的完善，高通量蛋白質(zhì)組學(xué)將在水產(chǎn)養(yǎng)殖、加工及流通等領(lǐng)域中發(fā)揮重要作用。目前，NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中已涵蓋較多完整蛋白質(zhì)序列的水產(chǎn)養(yǎng)殖品種，如尼羅羅非魚、大西洋鮭(Salmosalar)和虹鱒等[61]。近年來，蛋白質(zhì)組學(xué)已逐漸應(yīng)用于水產(chǎn)品貯運(yùn)過程中品質(zhì)變化的分子機(jī)制研究[14,62]，主要包括指示蛋白篩選[63-64]、結(jié)構(gòu)蛋白豐度變化[65]、能量代謝通路及蛋白間相互作用[66]等4個方面。

3.1 指示蛋白質(zhì)

蛋白質(zhì)組學(xué)通過將1種或幾種品質(zhì)指標(biāo)與潛在生物標(biāo)志物組合聯(lián)系起來，以獲得更多的生理學(xué)、動物學(xué)和細(xì)胞分子的生物學(xué)數(shù)據(jù)[25]。基于質(zhì)譜法(mass spectrometry，MS)的蛋白質(zhì)組學(xué)是用于分析蛋白質(zhì)/肽組合物和翻譯后的修飾過程(post-translational modification，PTM)的有力工具，對于蛋白質(zhì)組學(xué)/肽表達(dá)的動態(tài)變化研究有助于尋找用于判斷食品品質(zhì)的潛在生物標(biāo)志物[61]。這些生物標(biāo)志物可用于品種鑒定[67-68]、新鮮程度表征[69-70]等。

基于基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)自上而下的蛋白質(zhì)組學(xué)方法已廣泛應(yīng)用于魚類的鑒定。Pietro等[71]成功運(yùn)用MALDI-TOF-MS技術(shù)分析樣品肌肉和肝臟組織以區(qū)分3種淡水魚類，該技術(shù)能夠在一步提取后分析樣品而無需進(jìn)一步純化。食品生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的蛋白水解肽也是區(qū)分新鮮材料和冷藏材料的分子靶點，采用蛋白質(zhì)組學(xué)獲得可區(qū)別樣品新鮮程度的指示蛋白，將是高效、無損的新型檢測方法研究方向。Bauchart等[72]采用氨基酸定量與質(zhì)譜分析方法研究了冷凍處理對虹鱒肌肉品質(zhì)的影響，結(jié)果表明，冰溫貯藏6 d時虹鱒中低分子量肽(<5 kDa)的含量變化不大，而對貯藏過程中含量顯著增加的肽類進(jìn)行鑒定，或可作為用于評價虹鱒新鮮度的新方法。

目前，已有大量研究成功通過蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)確定新鮮指示蛋白，并用以表征魚肉的新鮮程度。Verrez-Bagnis等[73]采用SDS-PAGE結(jié)合2-DE研究海鱸(Lateolabraxjaponicus)肌肉組織冷凍0、2、4和6 d后的變化，篩選出可作為指示新鮮蛋白質(zhì)的特異性蛋白質(zhì)(16 kDa)；李娜[69]采用2-DE和MALDI-TOF-MS技術(shù)對冰藏期間的羅非魚肌肉組織進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，鑒定出磷酸二酯酶同工酶、肌球蛋白重鏈與β肌動蛋白可能是羅非魚新鮮度指示的蛋白質(zhì)，此3種蛋白質(zhì)分別與能量代謝、維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)和細(xì)胞運(yùn)動相關(guān)。目前，轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)方法的聯(lián)合應(yīng)用已成為強(qiáng)有力的工具，可通過對魚類生長過程中關(guān)鍵蛋白質(zhì)的代謝通路、表達(dá)差異及蛋白質(zhì)間相互作用等進(jìn)行研究，綜合分析蛋白質(zhì)表達(dá)及發(fā)生降解和修飾作用的過程，有助于進(jìn)一步了解魚類新鮮度下降過程中復(fù)雜的分子機(jī)制，而更加快速有效地進(jìn)行物種鑒別、營養(yǎng)品質(zhì)判斷與新鮮程度鑒定[74]。

3.2 結(jié)構(gòu)蛋白變化

目前，關(guān)于魚類貯運(yùn)中結(jié)構(gòu)蛋白降解的分析多采用一維電泳法[11](如SDS-PAGE)，一維電泳由于分辨率低而不能對蛋白進(jìn)行全面表征，不利于對降解產(chǎn)物進(jìn)一步分析，因而高通量的蛋白質(zhì)組學(xué)已被用于研究貯存期間不同魚類肌肉的多種結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)(如肌球蛋白和α-輔肌動蛋白)的豐度變化。Terova等[75]研究發(fā)現(xiàn)歐洲鱸(Dicentrarchuslabrax)肌肉蛋白質(zhì)組分貯藏在18 ℃比1 ℃條件下變化明顯，特別是肌球蛋白重鏈及糖酵解酶甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，G3PD)降解明顯。He等[65]采用非標(biāo)記定量(label-free)蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，探究尼羅羅非魚冷藏期間與質(zhì)構(gòu)特性相關(guān)的蛋白質(zhì)變化機(jī)理，發(fā)現(xiàn)0 ℃貯藏0 d與7 d的差異蛋白質(zhì)主要是結(jié)構(gòu)蛋白，其次是轉(zhuǎn)錄及翻譯調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白質(zhì)、酶類及應(yīng)激蛋白。KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)信號通路富集分析結(jié)果表明，3個主要的KEGG通路分別為代謝途徑、緊密連接與核糖體通路，這些結(jié)果說明魚肉嫩度可能與其結(jié)構(gòu)蛋白降解程度以及厭氧條件下肌肉乳酸水平的升高有關(guān)。肌鈣蛋白T(troponin T, Tn-T)和肌動蛋白是蛋白組學(xué)差異蛋白分析中較常見的結(jié)構(gòu)蛋白[63,65]，Tn-T是肌鈣蛋白的3個亞基之一，參與原肌球蛋白結(jié)合的橫紋肌收縮。研究報道，肌鈣蛋白T的3b型蛋白片段(troponin T type 3b protein fragment)可作為冷藏期間草魚品質(zhì)劣變的指示蛋白[9]。另外，Tn-T的水解產(chǎn)物中，分子量為30 kDa的多肽可作為蛋白質(zhì)降解的標(biāo)志物。而肌動蛋白是另一種與肌肉質(zhì)構(gòu)相關(guān)的結(jié)構(gòu)蛋白，在貯藏過程中，由于糖酵解、水解及蛋白質(zhì)降解等作用造成的肌動蛋白及肌鈣蛋白T等蛋白含量的變化，可作為評價水產(chǎn)品品質(zhì)與新鮮度的指標(biāo)[63]。采用蛋白質(zhì)組學(xué)表征魚類貯運(yùn)中結(jié)構(gòu)蛋白豐度的變化，能從分子水平分析蛋白質(zhì)降解情況，若結(jié)合生物信息學(xué)深入研究不同貯藏條件下的蛋白質(zhì)水解途徑造成的魚肉質(zhì)構(gòu)差異的分子機(jī)制，可更好地揭示貯藏期間品質(zhì)變化相關(guān)的生化過程。

3.3 與能量相關(guān)的代謝途徑及蛋白質(zhì)相互作用

新陳代謝的交替與生理適應(yīng)程度緊密相關(guān)，蛋白質(zhì)組學(xué)已被用于研究不同魚類肌肉冷藏期間的品質(zhì)變化，包括一些糖酵解蛋白質(zhì)(如磷酸丙糖異構(gòu)酶和G3PD)豐度的變化[76]。魚類死亡后糖酵解酶和其他與能量代謝相關(guān)的代謝酶易被降解或發(fā)生翻譯后修飾作用，因此，在低溫貯藏過程參與能量代謝的酶豐度通常降低，這可能與溫度抑制代謝反應(yīng)，使蛋白質(zhì)表達(dá)下調(diào)以維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)有關(guān)。Li等[66]采用二維電泳結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)研究大黃魚(Pseudosciaenacrocea)冷藏期間的蛋白質(zhì)變化，結(jié)果表明，α-烯醇酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶與磷酸葡萄糖變位酶-1在冷藏期間豐度均下調(diào)，這可能是由于在魚類死亡后的貯存期間，肌內(nèi)磷酸肌酸、磷酸精氨酸及糖原逐漸消失，烯醇酶發(fā)生降解所致。Li等[63]的研究表明，大菱鲆(Scophthalmusmaximus)在貯藏期間磷酸葡萄糖變位酶-1(phosphoglucomutase-1，PGM-1)及丙酮酸激酶(pyruvate kinase，PK)豐度下降，PGM-1是參與糖原生成的關(guān)鍵酶，其催化磷酸鹽在葡萄糖1、6位點的雙向轉(zhuǎn)移，且PGM-1已被鑒定為與肌肉嫩度相關(guān)的蛋白質(zhì)，肌肉嫩化過程中，PGM-1呈逐漸下調(diào)趨勢。此外，PK是糖酵解過程關(guān)鍵酶之一，糖酵解過程中酶的消耗是導(dǎo)致PK豐度下調(diào)的主要原因。

蛋白質(zhì)有多種功能調(diào)節(jié)方式，其影響因素包括表達(dá)水平、翻譯后修飾作用以及代謝物和蛋白質(zhì)間的相互作用。通過建立交互網(wǎng)絡(luò)，分析以上相互作用有助于了解各類影響因素誘導(dǎo)特定的反應(yīng)或表型的原理。He等[65]對羅非魚貯藏期間蛋白質(zhì)的相互作用開展研究，發(fā)現(xiàn)34種被鑒定的差異蛋白質(zhì)最終形成了由27種蛋白質(zhì)和70種交互作用組成的蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)。參與結(jié)構(gòu)組成、能量代謝、應(yīng)激反應(yīng)以及轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控的蛋白質(zhì)與結(jié)構(gòu)蛋白(rab10)間有很強(qiáng)的相互作用，硫氧還蛋白(thioredoxin)與能量代謝酶和應(yīng)激蛋白參與的代謝反應(yīng)密切相關(guān)，這些結(jié)果詳細(xì)闡述了貯藏期間各條件對魚肉肉質(zhì)的潛在影響?；谫|(zhì)譜技術(shù)的蛋白質(zhì)組學(xué)與生物信息學(xué)的結(jié)合，將有利于研究通路中運(yùn)作的大量蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)傳遞和發(fā)揮功能的原理，以揭示更多與品質(zhì)變化相關(guān)的代謝通路及蛋白質(zhì)相互作用的機(jī)制。

4 展望

魚肉在貯藏期間所涉及的蛋白質(zhì)變化機(jī)理錯綜復(fù)雜，目前蛋白質(zhì)冷凍變性機(jī)理仍存在多種假說，質(zhì)構(gòu)變化具體機(jī)理尚未明確，蛋白質(zhì)降解與氧化的相互關(guān)系還有待進(jìn)一步研究。蛋白質(zhì)組學(xué)及多組學(xué)等高通量檢測技術(shù)聯(lián)用有望使魚肉品質(zhì)變化機(jī)理更加明確。目前，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在魚類品質(zhì)研究方面的應(yīng)用尚不成熟，許多物種的蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)庫暫不完整，但不斷發(fā)展的測序技術(shù)終將提高魚類蛋白質(zhì)的鑒定水平，因此，數(shù)據(jù)庫不完備這一瓶頸不會長期阻礙魚肉品質(zhì)變化相關(guān)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究。在魚類貯運(yùn)過程中，將感官風(fēng)味評估與蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)結(jié)合，探討魚類品質(zhì)變化規(guī)律的研究亦未見報道。蛋白質(zhì)組學(xué)對蛋白質(zhì)動態(tài)變化的定量分析，有利于深入探討水產(chǎn)品蛋白質(zhì)在貯運(yùn)過程中的變化規(guī)律、篩選確定新鮮指示蛋白質(zhì)和探索開發(fā)更好的水產(chǎn)品貯運(yùn)方式。此外，通過深入開展蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在魚類品質(zhì)分析評價中的應(yīng)用，還可能發(fā)現(xiàn)與水產(chǎn)品品質(zhì)相關(guān)的新蛋白質(zhì)，進(jìn)而總結(jié)出基于蛋白質(zhì)變化的水產(chǎn)品品質(zhì)變化新機(jī)制，制定適當(dāng)質(zhì)控措施，減少貯運(yùn)過程中水產(chǎn)品品質(zhì)的降低程度。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，如微流體裝置(microfluid devices)、芯片實驗室(lab-on-chips)和蛋白質(zhì)陣列(protein arrays)等眾多新技術(shù)不斷涌現(xiàn)，蛋白質(zhì)組學(xué)將為魚類產(chǎn)品品質(zhì)評價與變化機(jī)制等方面的研究工作提供新思路。未來，可進(jìn)一步利用蛋白質(zhì)組學(xué)手段探究貯運(yùn)過程中蛋白質(zhì)質(zhì)構(gòu)變化對魚肉顏色變化影響及品質(zhì)影響的分子機(jī)制，為新型水產(chǎn)品加工方法的研發(fā)、水產(chǎn)品營養(yǎng)品質(zhì)保持與提升等提供技術(shù)支撐。