池塘養(yǎng)殖模式下氟苯尼考及其代謝產(chǎn)物在斑點(diǎn)叉尾鮰體內(nèi)及養(yǎng)殖環(huán)境中殘留消除及遷移行為

劉崇萬，孟勇，朱曉華*，李邦平，夏麗萍，徐志華，沈美芳，陳校輝，邊文冀

(1.江蘇省淡水水產(chǎn)研究所/江蘇省漁業(yè)產(chǎn)品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；2.江蘇省水產(chǎn)質(zhì)量檢測中心/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部漁業(yè)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心(南京)：南京 210017)

近年來，中國水產(chǎn)養(yǎng)殖規(guī)模日益擴(kuò)大，病原生物種類逐漸增多，養(yǎng)殖病害時(shí)常爆發(fā)，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，中國水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物細(xì)菌性疾病占全部水生動(dòng)物疾病種類的48.0%以上[1-2]。實(shí)際生產(chǎn)中，不科學(xué)用藥或是濫用藥物的現(xiàn)象仍時(shí)有發(fā)生，長此以往，一方面會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性增強(qiáng)，另一方面會(huì)引起藥物殘留問題，影響水產(chǎn)品的食用安全性。研究發(fā)現(xiàn)，用藥過程中部分抗生素會(huì)殘留在水體和底泥中[3-4]，殘留藥物可能會(huì)抑制環(huán)境中有益微生物的活性，刺激病原菌產(chǎn)生抗藥性，進(jìn)而對水生生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生負(fù)面效應(yīng)，且抗生素長期存在可直接影響飲用水的安全，并可能通過食物鏈傳遞最終影響人體健康[5]。

氟苯尼考(florfenicol, FF)是一種酰胺醇類抗菌藥物[6]，隨著近年來氯霉素等抗菌藥物被禁用以及病原菌對土霉素等藥物的耐藥性日益增強(qiáng)[7]，F(xiàn)F以其廣譜、高效且安全性較高的特點(diǎn)[8]，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)F在動(dòng)物體內(nèi)不僅會(huì)以原形藥物殘留[9]，而且能產(chǎn)生多種代謝產(chǎn)物[10]，如氟苯尼考胺(florfenicol amine, FFA)等[6]，目前，F(xiàn)F及FFA均已作為食品中FF的標(biāo)示性殘留物[11]。FF及其代謝產(chǎn)物對哺乳動(dòng)物可能具有胚胎毒性等遺傳毒性[12-14]，農(nóng)業(yè)部235號(hào)公告對FF的最高殘留限量作出明確規(guī)定，要求在魚的帶皮肌肉中的殘留限量不得超過1 000 μg/kg[15]。

目前，關(guān)于FF作用于水產(chǎn)品的藥物殘留方面的研究已有開展[16-18]，但多數(shù)研究是在實(shí)驗(yàn)室條件下通過藥浴或口灌等方式進(jìn)行，與實(shí)際大池塘養(yǎng)殖模式存在較大差別，且關(guān)于FF在養(yǎng)殖環(huán)境中的殘留降解規(guī)律及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的研究也鮮有報(bào)道。基于此，本實(shí)驗(yàn)以近年來產(chǎn)業(yè)迅猛發(fā)展的斑點(diǎn)叉尾鮰(Letauruspunetaus，以下簡稱鮰)[16,19-20]作為研究對象，模擬實(shí)際池塘養(yǎng)殖模式中魚體的生長環(huán)境、放養(yǎng)時(shí)間、養(yǎng)殖密度、飼料的投喂時(shí)間與重量及投喂方式等，研究FF及FFA在鮰體內(nèi)及養(yǎng)殖環(huán)境中的殘留分布規(guī)律，并對藥物使用后在魚體和環(huán)境中的遷移行為做初步探討，以期為在水產(chǎn)養(yǎng)殖中科學(xué)、合理使用FF提供參考資料，同時(shí)為FF在水體環(huán)境中風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估積累基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

主要包括：FF、FFA及其氘代物內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品(以下簡稱D5-CAP，純度≥99.0%，Dr. Ehrenstorfer)；FF原料藥(純度≥20.0%，浙江萬方生物科技有限公司)；乙酸乙酯(色譜純，美國Tedia公司)，正己烷(色譜純，美國Tedia公司)，氨水、甲醇及乙腈(色譜純，美國Tedia公司)等；實(shí)驗(yàn)用水為Millipore系統(tǒng)純化水。

1.2 儀器與設(shè)備

主要包括：高效液相串聯(lián)質(zhì)譜儀(Qtrap 4500，美國SCIEX公司)；勻漿機(jī)(T18，德國IKA公司)；高速冷凍離心機(jī)(AllegraTM，美國Beckman公司)；濃縮工作站(Turbo Vap 瑞典Biotage公司)；便攜式采水器(WB-PM，北京普力特儀器有限公司)；采泥器(ETC-200，金壇區(qū)白塔新寶儀器廠)；冷凍干燥機(jī)(2.5L Triad 美國Labconco)。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 實(shí)驗(yàn)苗種及養(yǎng)殖條件

實(shí)驗(yàn)所用的鮰魚苗，平均體重為(50.9± 13.4)g，由江蘇省淡水水產(chǎn)研究所養(yǎng)殖基地提供。試驗(yàn)場所位于南通市海安華鎏水產(chǎn)有限公司養(yǎng)殖基地，選擇四口標(biāo)準(zhǔn)化養(yǎng)殖池塘(2 300 m2/口，分別標(biāo)記為S1、S2、S3及S4)，放養(yǎng)密度按實(shí)際生產(chǎn)模式進(jìn)行，每666.67 m2投放魚苗1 000尾，配備專人管理及拌藥。實(shí)驗(yàn)前魚苗、飼料、水質(zhì)及底泥經(jīng)檢測無FF及FFA殘留，對擬拌喂的FF藥品進(jìn)行了純度檢測，結(jié)果符合要求。

1.3.2 給藥方式

參考養(yǎng)殖戶實(shí)際用藥濃度，分別按1.25、2.50和5.00 g/kg 3個(gè)水平，稱取FF藥品，用適量蒸餾水配制成FF懸濁液，添加至空白飼料中，通過拌餌機(jī)攪拌均勻，每天每個(gè)試驗(yàn)池塘投喂FF陽性飼料4 kg，連續(xù)投喂5 d，S4作為空白對照池塘投喂未拌藥餌料。從實(shí)驗(yàn)第6天開始，4組池塘全部投喂空白飼料。

1.3.3 樣品采集

從開始投喂陽性飼料1 d后開始采集樣品，采集時(shí)間點(diǎn)分別為1、2、3、4、5、6、7、8、11、14、30、60、90和170 d(實(shí)驗(yàn)期間池塘不換水)，每組各取10尾健康鮰作為平行樣，取肌肉，血液及肝臟組織。血液采取斷尾法，移入采血管，肌肉和肝臟用勻漿機(jī)或剪刀制成均勻樣品，裝入樣品袋，于-20 ℃貯存?zhèn)錂z。池塘水用采水器采集，每個(gè)池塘每次在投喂點(diǎn)周邊2 m內(nèi)取2份樣品，投喂后1 h采樣，每個(gè)樣至少500 mL。底泥采用采泥器采集，每個(gè)池塘每次取4份樣品，其中在投喂點(diǎn)周邊2 m內(nèi)取2份樣品，池塘周邊隨機(jī)取2份樣品，投喂后1 h采樣，每個(gè)樣50 g左右。

1.4 樣品前處理與檢測分析

1.4.1 樣品前處理方法

1)生物樣品前處理方法[21]：稱取適量樣品(每次試驗(yàn)樣品稱樣量根據(jù)藥物的濃度變化進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整，下同)，加入50 μL D5-CAP溶液、15 mL乙酸乙酯、0.45 mL氨水以及5 g無水硫酸鈉，渦旋混勻，8 000 r/min離心5 min，收集上層提取液，重復(fù)提取一次，合并提取液并混勻，在室溫下用N2吹干。加入5 mL純水，渦旋混勻，再加入5 mL正己烷，渦旋1 min，棄去上層，重復(fù)加正己烷，下清液轉(zhuǎn)移至5 mL離心管，4 000 r/min離心15 min，下清液過0.2 μm濾膜，待測。

2)底泥樣品前處理方法[21-22]：剔除小石塊及植物殘?bào)w等雜質(zhì)，置于-20 ℃預(yù)凍后凍干處理，研磨，過250 μm孔徑尼龍篩，置于-40 ℃存放。處理方法同生物樣品。

3)池塘水樣品前處理方法[21-22]：量取經(jīng)0.45 μm玻璃纖維濾膜過濾的水樣500 mL，加入50 μL內(nèi)標(biāo)溶液以及0.4 g EDTA。預(yù)先依次用6 mL甲醇、6 mL超純水和6 mL磷酸鹽緩沖液(pH=3)對HLB固相萃取柱淋洗活化。控制流速約為3～5 mL/min，將水樣過HLB固相萃取柱，過柱完成后，用6 mL去離子水沖洗，抽真空5 min，最后以6 mL甲醇洗脫1次，收集洗脫液，并在室溫下用N2吹干，用乙腈-0.1%甲酸(2∶8，V/V)混合液定容1 mL，渦旋振蕩2～3 min，4 400 r/min離心10 min，上清液過0.22 μm濾膜，待測。

1.4.2 色譜方法

色譜柱為InfinityLab Poroshell 120 EC-C8(2.1 mm×100.0 mm，2.7 μm，美國Agilent公司)；柱溫30 ℃；流動(dòng)相A為純水，B為甲醇；進(jìn)樣量10 μL；流速0.2 mL/min；梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫條件Tab.1 Conditions of gradient elution

1.4.3 質(zhì)譜方法

FF及FFA檢測均采用電噴霧離子源(ESI)，掃描方式分別采用負(fù)離子及正離子模式；多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)方式；離子化電壓4 000 V；離子源溫度450 ℃；氣簾氣25.0 psi；噴霧器45.0 psi；輔助加熱器45.0 psi。多反應(yīng)監(jiān)測母離子、子離子、去簇電壓和碰撞能量等質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表2 質(zhì)譜參數(shù)Tab.2 MS parameters

注：標(biāo)“*”為定量離子。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用Excel進(jìn)行基礎(chǔ)數(shù)據(jù)處理與分析，藥-時(shí)曲線圖采用SigmaPlot 11.0(Systat Software Inc.，San Jose，CA，USA)處理并繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 分析方法驗(yàn)證

由圖1可見，在本實(shí)驗(yàn)條件下，可較好地分離FF及FFA，基線走動(dòng)平穩(wěn)，內(nèi)源性雜質(zhì)對實(shí)驗(yàn)測定無干擾，具有較好的特異性。FF和FFA保留時(shí)間分別為5.04 min和1.81 min，分離度良好。

圖1 氟苯尼考(FF)和氟苯尼考胺(FFA)標(biāo)準(zhǔn)色譜圖Fig.1Chromatograms of FF and FFA

在質(zhì)量濃度范圍為1.0～500.0 ng/mL時(shí)，以各組分的內(nèi)標(biāo)與外標(biāo)的峰面積比值為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸分析，并隨檢測批次繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(鮰組織及底泥以提取液進(jìn)行計(jì)算)。在一定加標(biāo)水平下(池塘水為5.0～50.0 ng/mL，鮰組織及底泥為1.0～ 10.0 μg/kg)進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，每個(gè)質(zhì)量濃度水平做3個(gè)平行試驗(yàn)，計(jì)算FF及FFA的加標(biāo)回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，以信噪比(S/N)為3時(shí)計(jì)算方法檢出限(LOD)。具體結(jié)果如表3所示。

表3 氟苯尼考(FF)和氟苯尼考胺(FFA)測定的線性范圍、相關(guān)系數(shù)、平均回收率、檢測限Tab.3 The range of linearity, relevant coefficient, average recovery, RSD, LOD of FF and FFA n=3

結(jié)果表明,FF及FFA在1.0 ～ 500.0 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，個(gè)別加標(biāo)回收率偏低，但總體來看不同批次間回收率相對穩(wěn)定，精密度均小于10%，該方法能夠滿足檢測殘留分析的要求。其中，環(huán)境樣品整體回收率低于生物樣品，這可能與環(huán)境介質(zhì)中復(fù)雜成分引起的基質(zhì)效應(yīng)有關(guān)[22]。

2.2 生物樣品中藥物殘留消除規(guī)律

2.2.1 不同劑量下FF藥物殘留消除規(guī)律

不同劑量條件下，肌肉、肝臟及血液中FF藥物濃度變化如圖2所示。

分析發(fā)現(xiàn)，肌肉中FF藥物濃度在投喂陽性飼料第2天后開始迅速升高，而肝臟和血液中FF藥物濃度在投喂當(dāng)天即迅速上升，肌肉中低劑量組FF藥物濃度(1.25 g/kg)在試驗(yàn)第6天達(dá)到峰值(7 274.14 ng/g)，常規(guī)劑量組(2.50 g/kg，又稱中劑量組)和高劑量組(5.00 g/kg)均在試驗(yàn)第5天達(dá)到峰值，分別為10 590.66 和16 495.36 ng/g；肝臟及血液中3個(gè)劑量組FF藥物濃度均是在實(shí)驗(yàn)第4天達(dá)到峰值，低、中和高劑量組在肝臟中的峰值分別為28 955.91、25 305.42及41 667.64 ng/g，血液中分別為9 335.79、13 328.69及21 388.07 ng/g。

結(jié)果表明，肌肉、肝臟及血液中FF藥物濃度在達(dá)到峰值后均呈現(xiàn)先急劇下降后持續(xù)下降但降速變緩的趨勢。至30 d時(shí)，肝臟及血液中已檢測不到殘留，至60 d時(shí)肌肉中也已檢測不到殘留，此后持續(xù)監(jiān)測到第170天，均檢測不到殘留。

另外，研究發(fā)現(xiàn)在試驗(yàn)第11天時(shí)，常規(guī)劑量條件下肝臟及高劑量條件下血液中FF藥物濃度存在異常升高的過程，但是總體上不影響整體的規(guī)律變化，這可能是與采集的樣本有關(guān)系。

2.2.2 不同劑量下FFA藥物殘留消除規(guī)律

不同劑量條件下，肌肉、肝臟及血液中FFA藥物濃度變化如圖3所示。

研究結(jié)果表明，肌肉和血液中低、中和高3個(gè)劑量組的FFA藥物濃度在實(shí)驗(yàn)開始后持續(xù)上升，其中，肌肉中FFA藥物濃度在實(shí)驗(yàn)第7天時(shí)達(dá)到峰值，分別為311.64、613.97及813.75 ng/g；血液中FFA藥物濃度在實(shí)驗(yàn)第4天時(shí)達(dá)到峰值，分別為321.23、456.02及789.07 ng/g。此后，肌肉中FFA藥物濃度呈現(xiàn)先急劇下降后持續(xù)下降但降速變緩的趨勢，至170 d時(shí)，仍有少量殘留；而血液中FFA藥物濃度則在達(dá)到峰值后，急劇下降，在實(shí)驗(yàn)第6天時(shí)已檢測不到，持續(xù)監(jiān)測到實(shí)驗(yàn)170 d，均檢測不到FFA殘留。

分析肝臟中FFA藥物濃度變化規(guī)律發(fā)現(xiàn)，在實(shí)驗(yàn)前期(1～3 d)，3個(gè)組別的FFA藥物濃度變化規(guī)律與肌肉和血液不一致。其中，低劑量組在前3天緩慢下降，第3～5天時(shí)快速上升達(dá)到峰值1 006.07 ng/g；常規(guī)劑量組在實(shí)驗(yàn)第1～2天時(shí)急劇上升，第3天時(shí)又快速下降，后至第5天時(shí)達(dá)到峰值1 869.97 ng/g；高劑量組在實(shí)驗(yàn)前兩天先急劇下降，此后急劇上升，至實(shí)驗(yàn)第4天時(shí)達(dá)到峰值2 925.80 ng/g；3個(gè)劑量組至實(shí)驗(yàn)第60天時(shí)均已檢測不到FFA殘留。

圖2 不同劑量條件下鮰肌肉、肝臟及血液中氟苯尼考(FF)藥時(shí)曲線(n=10)A：肌肉；B：肝臟；C：血液。Fig.2Content-time curve of FF at different doses in muscle、liver and blood(n=10)A: muscle FF; B: liver FF; C: blood FF.

圖3 不同劑量條件下鮰肌肉、肝臟及血液中氟苯尼考胺(FFA)藥時(shí)曲線(n=10)A：肌肉；B：肝臟；C：血液。Fig.3Concentration-time curve of FFA at different doses in muscle、liver and blood (n=10)A: muscle FFA; B: liver FFA; C: blood FFA.

2.3 環(huán)境樣品中藥物殘留消除規(guī)律

2.3.1 池塘水中FF及其代謝物FFA降解規(guī)律

不同劑量條件下，池塘水中FF及FFA藥物濃度變化如圖4所示。

圖4結(jié)果表明，池塘水中FF藥物含量在投喂陽性飼料第1天后開始迅速升高，低、中及高3個(gè)劑量組分別在實(shí)驗(yàn)第5、6和4天達(dá)到峰值，達(dá)峰濃度分別為1 661.98、3 533.47及4 138.98 ng/mL。從實(shí)驗(yàn)第90天至170天，共80天周期內(nèi)，3個(gè)組別藥物含量降到14.43、29.80及18.64 ng/mL。

與水中FF藥物含量相比，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中池塘水中FFA藥物含量整體上都非常低，低、中、高3個(gè)組別藥物含量同樣分別在第5、6和4天達(dá)到峰值，分別僅為21.88、56.25及54.58 ng/mL，實(shí)驗(yàn)第90天至實(shí)驗(yàn)第170天，不同組別FFA藥物含量均穩(wěn)定在5 ng/mL以下。

圖4 不同劑量條件下池塘水中FF及FFA含量變化(n=2)A: 氟苯尼考；B: 氟苯尼考胺。Fig.4Concentration of FF and FFA at different doses in water(n=2)A: florfenicol(FF)；B: florfeniocl amine(FFA).

2.3.2 底泥中FF及其代謝物FFA降解規(guī)律

不同劑量條件下，底泥中FF及FFA藥物濃度變化如圖5所示。

圖5結(jié)果表明，低劑量組底泥中FF藥物含量在整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)均維持在較低水平上，且達(dá)峰濃度明顯低于常規(guī)劑量組和高劑量組。實(shí)驗(yàn)前4天，各組FF藥物含量急劇升高，低、中、高3個(gè)劑量組均是在第5天達(dá)到峰值，分別為78.23、525.67及601.29 ng/g。此后，各組FF藥物含量緩慢下降，至實(shí)驗(yàn)第170天時(shí)，已分別降到11.23、23.57及39.64 ng/g。

與底泥中FF藥物含量相比，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中底泥中FFA藥物含量整體上都非常低，除了實(shí)驗(yàn)第4～6天，其他實(shí)驗(yàn)時(shí)間內(nèi)，各組別FFA藥物含量均維持在10.00 ng/g以下。3個(gè)組別藥物含量均是在試驗(yàn)第5天達(dá)到峰值，分別僅為14.41、20.58及27.29 ng/g。

圖5 不同劑量條件下底泥中FF及FFA含量變化(n=4)A: 氟苯尼考；B: 氟苯尼考胺。Fig.5 Concentration of FF and FFA at different doses in sediment(n=4)A: florfenicol(FF)；B: florfeniocl amine(FFA).

2.4 FF在斑點(diǎn)叉尾鮰生物及環(huán)境樣品中遷移行為分析

以常規(guī)劑量條件下計(jì)算肌肉、肝臟、血液、池塘水及底泥中FF藥物殘留量占總殘留量的比值，以比較不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)條件下藥物殘留遷移情況，具體結(jié)果如表4及圖6所示。

結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)所采集的生物樣品(即肌肉、肝臟及血液)以及環(huán)境樣品(池塘水及底泥)中FF藥物總量在整個(gè)試驗(yàn)過程中呈現(xiàn)先急劇上升(實(shí)驗(yàn)第1～4天)，后急劇下降(實(shí)驗(yàn)第4～7天)，至實(shí)驗(yàn)第8天開始降速變緩，直至實(shí)驗(yàn)第170天時(shí)，仍有少量檢出。

表4 常規(guī)劑量條件下FF在生物樣品和環(huán)境樣品中殘留占比情況Tab.4 Proportion of FF at regular doses in biological samples or environmental samples

注：“—”示無相關(guān)數(shù)據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)中以肌肉、肝臟和血液中的濃度之和代表被魚類吸收的藥物濃度，研究發(fā)現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)被魚類吸收的FF藥物比例范圍為4.16%～94.90%，5天投喂期內(nèi)，通過表4和圖6可看出，肝臟中藥物含量一直保持在40%以上，血液中藥物含量相對穩(wěn)定在30%左右，肌肉中藥物含量一直比較低，實(shí)驗(yàn)第5天才緩慢升至24.0%。至實(shí)驗(yàn)第6天發(fā)現(xiàn)，肌肉、肝臟和血液中藥物濃度趨于一致，此后，魚體內(nèi)藥物含量占比逐步下降，而環(huán)境中藥物含量占比逐步升高，直至實(shí)驗(yàn)第30天左右，生物樣品中除了肌肉中仍有少量檢出，而95.8%的總量檢出均是集中于環(huán)境樣品。此后，生物樣品中藥物已完全不檢出，只有環(huán)境樣品檢出。

圖6 常規(guī)劑量條件下藥物含量占比雷達(dá)圖Fig.6 Radar map of FF proportions at regular doses in different samples

3 討論

3.1 藥物在不同樣品中的殘留消除特征及分布規(guī)律

本研究采用的是拌喂投料的實(shí)際生產(chǎn)給藥方式，研究發(fā)現(xiàn)不同劑量及組織中，F(xiàn)F及FFA的藥物殘留量與給藥劑量呈正相關(guān)，F(xiàn)F達(dá)峰濃度顯著高于FFA，說明FF在鮰體內(nèi)主要是以原型的方式代謝消除。FF達(dá)峰時(shí)間為第4～6天，F(xiàn)FA達(dá)峰時(shí)間為第4～7天；肝臟和血液中FF在實(shí)驗(yàn)第30天時(shí)已檢測不到殘留，肌肉中FF在第60天檢測不到殘留，而FFA在肌肉中第170天仍有少量檢出，在肝臟和血液中分別于實(shí)驗(yàn)的第60和6天檢測不到殘留；說明FF和FFA在肝臟和血液中代謝較快，在肌肉中代謝速度相對較慢，且FF在肝臟、血液和肌肉中的降解速度快于FFA。欒鵬等[23]采用15 mg/kg連續(xù)3次口灌給藥方式(每次給藥間隔24 h)研究FF及FFA在鯉(Cyprinus)體內(nèi)的殘留，發(fā)現(xiàn)肌肉及皮膚中FF含量均高于FFA，F(xiàn)F和FFA的達(dá)峰時(shí)間分別在連續(xù)給藥后的2～4h和4 h，在給藥后2 d左右FF及FFA藥物濃度之和已降到1 mg/kg以下，而本實(shí)驗(yàn)中不同劑量組肌肉組織中降到這一濃度所用時(shí)間分別為7、11及14 d；秦方錦等[24]采用20 mg/kg口灌給藥方式研究FF在大黃魚(Pseudosciaenacrocea)體內(nèi)的殘留，發(fā)現(xiàn)給藥后0.25 h肝臟中藥物濃度即可達(dá)峰，但其后快速下降，至1 h僅殘留7.3%；陳晉旭等[17]采用連續(xù)6 d藥浴方式研究FF及FFA在小龍蝦(Procambarusclarkii)體內(nèi)的殘留，F(xiàn)F及FFA分別在停藥后2 h及4 h達(dá)到峰值，分別在14 d及7 d已檢測不到殘留，且FF殘留量顯著高于FFA。此外，楊倩等[25]研究了FF在黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)體內(nèi)的殘留；劉艷輝等[26]研究了15、45 mg/kg兩種藥物劑量對德國鏡鯉(Cyprinuscarpiomirror)體內(nèi)FF及FFA殘留的影響，肌肉中FF分別在給藥后6 h和12 h達(dá)峰，F(xiàn)FA均在72 h達(dá)峰，肝臟中FF分別在4 h和6 h達(dá)峰，而FFA在72 h和24 h達(dá)峰，不同組織中，F(xiàn)F在168h時(shí)已檢測不到殘留，F(xiàn)FA在264h基本檢測不到殘留。綜上可見，不同給藥方式下，藥物的消除變化規(guī)律差異較大，主要體現(xiàn)在口灌給藥及藥浴等給藥方式下，藥物的達(dá)峰時(shí)間明顯提前，消除速度較快，因?yàn)樵谶@樣的給藥方式下，魚體快速地吸收大量藥物，而本實(shí)驗(yàn)采用的實(shí)際生產(chǎn)給藥方式，由于水面面積較大，藥物在投藥的第一時(shí)間并不能保證被魚體大量吸收，一部分已經(jīng)散失在環(huán)境中造成達(dá)峰時(shí)間較晚。根據(jù)藥物殘留量及消除速率，建議以FF和FFA的濃度之和作為FF的標(biāo)示殘留物的指示值。

通過比較不同組織的殘留情況發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)F及FFA在鮰體內(nèi)的分布是不均勻的，殘留水平由高到低依次為肝臟、血液及肌肉，且在實(shí)驗(yàn)前期(前14天)，肝臟中藥物含量一直維持在較高水平上，說明FF藥物首先在魚肝臟中迅速富集，而肌肉中的藥物含量一直低于同期的肝臟及血液含量水平，這可能是由于肌肉為低血流量器官，且其細(xì)胞膜通透性較差，致使藥物不容易向肌肉組織轉(zhuǎn)移[24]。劉永濤等[16]發(fā)現(xiàn)在鮰體內(nèi)肝臟中藥物殘留量高于肌肉，鄭重鶯等[27]研究發(fā)現(xiàn)在南美白對蝦(Penaeusvannamei)體內(nèi)血液中藥物殘留量高于肌肉，而Samuelsen等[28]發(fā)現(xiàn)在單劑量管飼口服FF大西洋鱈(Gadusmorhua)的血漿中沒有檢測到FFA，分析可能是由于種屬及給藥方式不同所致。秦方錦等[24]研究發(fā)現(xiàn)給藥后0.25 h肝臟中藥物含量最高，說明FF首先在肝臟富集，這與本研究中結(jié)論一致，但在隨后的0.25～1 h肝臟中藥物濃度驟降，在2 h后，肝臟中FF又再次達(dá)峰，即肝臟中出現(xiàn)了藥物重吸收現(xiàn)象，本研究中未出現(xiàn)這種現(xiàn)象，可能是由于不同動(dòng)物種屬、給藥方式不同及取樣時(shí)間密集程度差異所致。說明FF藥物在不同水產(chǎn)物種體內(nèi)分布及殘留情況有所差異，受水產(chǎn)品種、給藥方式等因素影響。

研究環(huán)境樣品的藥物殘留情況發(fā)現(xiàn)，池塘水及底泥中FF檢出含量均顯著高于FFA，同時(shí)，池塘水中藥物含量(尤其是FF)顯著高于底泥中。以常規(guī)劑量為例，池塘水及底泥中FFA達(dá)峰濃度僅為FF達(dá)峰濃度的1.59%和3.92%，底泥中FF達(dá)峰濃度僅為池塘水中的14.88%，說明在環(huán)境中，F(xiàn)F也主要是以原型的方式降解消除，在拌藥投喂的方式下，餌料中的FF首先大量散失在水體中，而大部分持續(xù)性地存在于水體中直至降解，底泥中FF檢出量較少。近年來關(guān)于環(huán)境因子對FF降解影響的研究較少，戶江濤等[29]研究發(fā)現(xiàn)溫度(在10～30 ℃條件下，溫度升高有利于FF在沉積物中的降解)、微生物及有機(jī)質(zhì)(未處理沉積物中的降解半衰期為1.70 d，而滅菌和去除有機(jī)質(zhì)后的半衰期分別為6.73，11.64 d)對FF降解影響顯著；劉偉等[30]研究發(fā)現(xiàn)光照對于FF降解幾乎沒有影響；阮悅斐等[31]在對天津近郊地區(qū)淡水養(yǎng)殖水體的表層水和沉積物中典型抗生素的研究中指出沉積物中磺胺類抗生素檢出含量顯著高于水樣，認(rèn)為是底泥有機(jī)質(zhì)對磺胺類抗生素有較強(qiáng)的吸附能力，造成了含量差異，且被沉積物吸附的抗生素隨外部氣溫、水溫的變化，可能會(huì)從沉積物中解析釋放到水體中，造成水體中抗生素含量升高。聶湘平等[32]在珠三角淡水養(yǎng)殖水體底泥中檢出有喹諾酮類抗生素殘留，但是在對應(yīng)的表層水中并未檢出。綜上，說明本研究中所得結(jié)果可能是和環(huán)境因子(光照、微生物及有機(jī)質(zhì)等)有關(guān)，楊衛(wèi)民等[33]指出環(huán)境因子不同，抗生素降解也會(huì)有所差異，因此，關(guān)于FF及其代謝物FFA在環(huán)境中遷移行為的具體機(jī)理仍然需要更詳細(xì)的研究。

3.2 合理給藥劑量及休藥期探討

研究發(fā)現(xiàn)FF及FFA的藥物殘留量與給藥劑量呈正相關(guān)，同時(shí)給藥劑量的大小對于藥物的殘留時(shí)間也有一定的影響。這表明，在日常養(yǎng)殖過程中，如不遵守用藥限量規(guī)定，很可能引發(fā)藥物殘留問題。FF對常見病原菌的體外最低抑菌濃度MIC(μg/mL)一般為0.3～1.6[15]，而抗菌藥物給藥劑量是否有效取決于Cmax/MIC能否達(dá)到10[34]，本研究中低劑量組FF在肝臟、肌肉和血液中Cmax分別為28 955.91、7 274.14、9 335.79 ng/g，據(jù)此計(jì)算Cmax/MIC值分別在18.1～96.5、4.55～24.30、5.83～31.10范圍內(nèi)，說明本實(shí)驗(yàn)條件下低劑量1.25 g/kg難以判斷是否有效，計(jì)算常規(guī)劑量組及高劑量組的Cmax/MIC均在10以上，說明本實(shí)驗(yàn)條件下的2.50 g/kg和5.00 g/kg兩個(gè)劑量是有效的。但是需要說明的是，這是通過理論推算而得的結(jié)論，實(shí)際生產(chǎn)中還需根據(jù)魚病的爆發(fā)程度，多次驗(yàn)證得出最低有效劑量，即藥物劑量與藥效學(xué)的關(guān)系還需結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)進(jìn)一步研究。

漁藥休藥期通常是根據(jù)國家規(guī)定的最大殘留限量(MRL)及藥物在食用組織中的消除速率來確定。農(nóng)業(yè)農(nóng)村部規(guī)定了魚類帶皮肌肉的殘留限量為1 mg/kg，ADI為0～3 μg/(kg·d)[34]，據(jù)此計(jì)算，本實(shí)驗(yàn)條件下，三個(gè)劑量水平下的理論休藥期分別為3、6及9 d，說明了用藥量的增加，休藥期也要相應(yīng)延長。根據(jù)劉永濤等[16]研究結(jié)論推算，并結(jié)合本實(shí)驗(yàn)期間平均環(huán)境溫度(23 ℃)，建議實(shí)際生產(chǎn)中，不同劑量條件下休藥期分別設(shè)為161、230及345 度日。

3.3 氟苯尼考藥物使用對于生態(tài)環(huán)境的影響

徐永建等[4]研究指出抗生素的大量使用容易造成沉積物中生物群落量和質(zhì)的改變，抑制沉積物的降解速率。李兆新等[35]指出進(jìn)入環(huán)境中的抗生素可能使養(yǎng)殖環(huán)境中的病菌產(chǎn)生耐藥性，破壞水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的微生態(tài)平衡。因此，在使用FF藥物時(shí)，除了關(guān)注藥物對水產(chǎn)品的影響及殘留代謝狀況，也不可忽視FF藥物使用對于生態(tài)環(huán)境的潛在影響和危害。

Samueisen等[36]及陳清華[37]均指出水產(chǎn)養(yǎng)殖中使用的抗生素僅有20%～30%被魚類吸收，其他大部分抗生素則流失在水體中，或是隨懸浮物沉降匯集于底泥中。本研究發(fā)現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)被魚類吸收的FF藥物比例范圍為4.16%～94.9%，且在實(shí)驗(yàn)前5天均維持在90.0%以上，恰好實(shí)驗(yàn)前5天時(shí)用陽性飼料投喂魚苗，說明實(shí)驗(yàn)投喂期內(nèi)投喂的飼料中的藥物被魚體大量吸收，投喂結(jié)束后，隨著實(shí)驗(yàn)時(shí)間的延長，魚體中藥物濃度占比逐漸減小，而池塘水和底泥中的藥物含量逐漸增加，可能是由于部分藥物隨魚體糞便散失于環(huán)境之中以及藥物降解所致。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了FF藥物用于鮰養(yǎng)殖過程中時(shí)，未被魚體本身食用的藥物會(huì)散失到環(huán)境中，尤其是池塘水中，在實(shí)驗(yàn)第170天時(shí)仍有少量檢出。因此在實(shí)際養(yǎng)殖過程中：不建議漁民頻繁使用藥物；當(dāng)年度養(yǎng)殖結(jié)束時(shí)，根據(jù)實(shí)際情況采取活性炭吸附[38]、徹底清塘暴曬[39]等環(huán)境凈化措施；養(yǎng)殖池塘在需要外來水源補(bǔ)充時(shí)，需明確外來水源是否為藥物污染源，使用過藥物的池塘水也不應(yīng)隨意或短時(shí)間內(nèi)排泄到其他池塘；漁業(yè)主管部門應(yīng)定期監(jiān)控養(yǎng)殖區(qū)域內(nèi)環(huán)境中藥物殘留情況，以最大程度消除藥物殘留對環(huán)境的影響，從而避免對生態(tài)環(huán)境及人體健康形成長期潛在危害。

3.4 工作展望

本實(shí)驗(yàn)選擇了FFA作為FF的主要代謝產(chǎn)物進(jìn)行研究，但實(shí)際上氟苯尼考在代謝過程中是否還存在其他產(chǎn)物、FF在魚體中的代謝途徑及其在環(huán)境中的轉(zhuǎn)化機(jī)制等問題都尚需進(jìn)一步研究。擬結(jié)合高分辨液質(zhì)聯(lián)用儀篩查FF在魚體代謝過程中的代謝產(chǎn)物種類，梳理各代謝產(chǎn)物是否存在相互關(guān)系及具體降解消除情況，以進(jìn)一步摸清FF的代謝機(jī)制及規(guī)律，為指導(dǎo)科學(xué)用藥提供理論支撐。

本研究初步分析了藥物在環(huán)境中殘留規(guī)律及在水產(chǎn)品與環(huán)境中遷移行為，但未涉及遷移機(jī)理的研究，比如本研究中發(fā)現(xiàn)底泥中藥物含量明顯低于水體中，究竟是因?yàn)橥獠凯h(huán)境因素如環(huán)境的溫度及水溫[29]、光照[40]等影響了水體與沉積物的遷移，還是因?yàn)槌练e物中藥物解析又釋放到水體中，有待進(jìn)一步深入研究FF的環(huán)境生態(tài)效應(yīng)，如藥物在環(huán)境中降解及吸附行為、不同參數(shù)變化對于藥物遷移的影響及藥物使用對微生物群落的影響等，進(jìn)而了解FF藥物的使用在環(huán)境中的遷移規(guī)律，探究其環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)水平。

考慮到藥物在不同水產(chǎn)物種間的殘留規(guī)律及代謝機(jī)制可能會(huì)有所區(qū)別，且本研究中僅選擇了肝臟、肌肉及血液進(jìn)行組織分布研究，后期還需針對不同水產(chǎn)物種并納入皮膚、腎臟等更多的組織器官進(jìn)行全面深入的研究，以進(jìn)一步掌握FF在不同水產(chǎn)品中分布及消除數(shù)據(jù)。