獸藥殘留中四環(huán)素的檢測方法的比較實驗

田翠，鐘英，陳光亮，趙耀，鄭海芳，劉霜，羅小嬌，張維娜，張強

（瀘州市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，四川瀘州646000）

四環(huán)素作為一種廣譜的抗生素，對于疾病的治療和預(yù)防都有良好的效果，常被用于飼養(yǎng)業(yè)、畜牧業(yè)以及水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)。長期以來由于價格低廉、抗菌譜廣、使用方便等原因，在獸醫(yī)臨床上應(yīng)用廣泛。然而一些不法商家和養(yǎng)殖戶為了獲得更大的利益濫用抗生素，不但不能被動物吸收而以代謝產(chǎn)物排出體外對環(huán)境造成污染[1]，而且造成畜產(chǎn)品中抗生素嚴重超標，從而進入人體對身體造成傷害[2-5]。大量使用抗生素容易引起胃腸和肝臟的損害、致畸胎作用、二重感染，更嚴重的能抑制人體骨髓造血功能而引起再生障礙性貧血和粒狀白細胞缺乏癥等疾病。因此探究高效、快捷、準確的檢測動物源性食品中四環(huán)素類抗生素的殘留對人類健康有著十分重要的意義。本文通過對比動物源食品中四環(huán)素的三種檢測方法，農(nóng)醫(yī)發(fā)【2017】1 號文件附錄8，GB/T 21237-2007，農(nóng)業(yè)部1025 號公告-12-2008，以雞肉為例，經(jīng)過多次反復(fù)實驗，且對部分實驗條件進行了優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)GB/T 21237-2007 的不僅實驗操作方便且方法回收率較高，準確性高，能較好的滿足實驗要求。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 四環(huán)素、金霉素、土霉素的標準樣品來源于農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護科研監(jiān)測所；檸檬酸 (C6H8O7.H2O)、磷酸氫二鈉（Na2HPO4.12H2O）、乙二胺四乙酸二鈉(C10H14N2Na2O8.2H2O)、氫氧化鈉、濃氨水三氟乙酸均為分析純，甲醇、乙酸乙酯、乙腈、甲酸均為色譜純，實驗用水為二次蒸餾水，HLB 固相萃取柱60mg/3mL。高效液相色譜-質(zhì)譜為安捷倫三重四級桿液質(zhì)聯(lián)用儀6460。

1.2 樣品的制備和貯存 取適量新鮮或冷凍的樣品中取出500g，用組織攪碎機充分攪碎均勻，裝入潔凈的塑料瓶中，密封，并標記，于-18℃以下冰凍存放。

1.3 樣品提取和凈化

1.3.1 農(nóng)醫(yī)發(fā)[2017]1 號文件附錄8 優(yōu)化后的方法提取：稱取1±0.02g 試樣于50mL 離心管中，加入Mclivaine-Na2EDTa （pH=5.0±0.2） 緩沖液8mL，渦動1min，超聲20min，于-2℃1000r/min 離心10min，將上清液倒入另一50mL 離心管中，殘渣加入磷酸鹽緩沖液8mL，同樣的方法提取一次，合并兩次提取液，混勻，備用。

凈化：依次用甲醇5mL 和水5mL 活化固相萃取柱，取備用液過柱，依次用水5mL、20%的甲醇水溶液5mL 淋洗，減壓抽干5min，控制流速1mL/min。用15mL 洗脫液（乙酸乙酯：甲醇：濃氨水=150：150：6） 洗脫，并收集洗脫液，洗脫液于45℃水浴氮氣吹干，用復(fù)溶液（水：甲醇：乙腈：甲酸=40：5：5：0.05）1mL，渦動1min溶解殘余物，14000r/min 離心6min，0.45um 濾膜過濾，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定。

1.3.2 農(nóng)業(yè)部1025 號公告-12-2008 雞肉、豬肉中四環(huán)素累藥物殘留檢測液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法優(yōu)化后的方法

提?。悍Q取2±0.05g 試樣于50mL 離心管中，加入Mclivaine-Na2EDTA （pH=4.0±0.5） 緩沖液8mL，渦動1min，-2℃8000r/min 離心10min，取上清液于另一50mL 離心管中，重復(fù)提取一次，合并提取液，混勻，備用。

凈化：依次用甲醇5mL 和水5mL 活化固相萃取柱，取備用液過柱，依次用水5mL、5%的甲醇水溶液5mL 淋洗，減壓抽干。用10mL 甲醇洗脫并收集洗脫液，于40℃水浴氮氣吹干，用甲醇-水（3：7）1.0mL，渦動溶解殘余物，0.45um 濾膜過濾，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定。

1.3.3 GB/T 21317-2007 動物源食品四環(huán)素類獸藥殘留檢測方法，液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法與高效液相色譜法優(yōu)化后的方法

提?。悍Q取試樣5±0.01g 于50mL 離心管中，分別加入約18mL、18mL、12mLMclivaine-Na2EDTa（pH=4.0±0.05）緩沖液冰水浴超聲提取三次，每次渦動混勻1min，超聲提取10min，合并上清液，并定容至50mL 混勻，-2℃5000r/min 離心10min，濾紙過濾，待凈化。

凈化：吸取10mL 提取液過固相萃取柱，待液體全部流出，依次用5mL 水和5mL 甲醇-水（1：19）淋洗，抽干5min，最后用15mL 甲醇-乙酸乙酯（1：9）洗脫。收集洗脫液，于40℃水浴氮氣吹干，用1.0mL 甲醇-三氟乙酸水溶液（1：19）溶解殘渣，0.45um 濾膜過濾，待測定。

1.4 標準溶液的配置

1.4.1 標準儲備液

分別移取濃度為100ug/mL 四環(huán)素、金霉素、土霉素標準溶液0.50mL 于10.0mL 的棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度并搖勻，濃度均為5ug/mL，-20℃冰箱保存。

再移取2.00mL 濃度為5ug/mL 的混合標準儲備液于10.0mL 的棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度并搖勻，濃度為1ug/mL，-20℃冰箱保存。

1.4.2 混合標準工作液

選取不含四環(huán)素的空白組織樣品，經(jīng)過上述的提取凈化制備空白基質(zhì)液。分別添加混合濃度為1ug/mL 標準儲備液 ，0.01mL，0.02mL，0.04mL，0.08mL，0.10mL，0.20mL于空白基質(zhì)液中，并定容至1.00mL，配制成10.0ug/L，20.0ug/L，40.0ug/L，60.0ug/L，80.0ug/L，100.0ug/L，200.0ug/L 的基質(zhì)標準液體。

表1 液質(zhì)質(zhì)儀器條件

1.5 上機測試

將所前處理的溶液上高效液相色譜-質(zhì)譜為安捷倫三重四級桿液質(zhì)聯(lián)用儀6460。儀器條件如下：

色譜柱：C18 50*2.1nm

流動相：A：0.1%甲醇水溶液，B：0.1%甲酸甲醇溶液（梯度淋洗見表1）

柱溫：35℃；

流速：0.2mL/min；

進樣量：2uL。

1.6 結(jié)果計算

采用外標法定量，四環(huán)素類獸藥殘留量：X=L1*C*V/（L2*m）

X 樣品中帶測組份含量，單位為微克每千克(ug/kg)；

L1 樣品提取體積，單位為毫升(mL)；

L2 樣品移取體積，單位為毫升(mL)；

C 上機濃度測試濃度(ug/kg)；

m 稱取樣品的質(zhì)量（g）。

2 方法比對、回收率及原因分析

2.1 提取

表2 提取方法比對

2.2 凈化（三種方法所使用的均是HLB 固相萃取柱60mg/3mL）

表3 凈化方法比對

2.3 回收率

以加標100ug/kg 為例，三種方法的回收率如下

表4 回收率

農(nóng)醫(yī)發(fā)【2017】1號文件附錄8方法 在10-500ug/kg 的回收率為60%-110%，農(nóng)業(yè)部1025 號公告-12-2008 方法在50-200ug/kg 的回收率為 60% -120% ，GB/T 21317-2007 在50-200ug/kg 的回收率為60%-120%；三種方法中四環(huán)素和土霉素的回收率都均能滿足實驗要求，GB/T 21317-2007 較其它的方法回收率略高;金霉素的差別卻很大，只有GB/T 21317-2007 方法的的金霉素回收率在70%以上，綜上所述，測定雞肉中的四環(huán)素，只有GB/T 21317-2007 四環(huán)素、土霉素、金霉素回收率均能滿足實驗要求。

2.4 原因分析

GB/T 21317-2007 的方法較其他方法三個參數(shù)回收率都較高，主要是由于提取完后過濾，部分殘渣和油脂殘留在濾紙上，凈化時不會堵塞固相萃取柱，以至于得到較高回收率。而其它兩個方法提取完直接過固相萃取柱，殘渣和油脂容易堵塞固相萃取柱，洗脫不充分，回收率低。

金霉素只有GB/T 21317-2007 方法回收率能滿足實驗要求，這與金霉素自身的特點有關(guān)，金霉素較易水解[9]，其分解速度與pH 和溫度有關(guān)系，堿性和中性條件下水解速度明顯大于酸性條件，高溫條件下的水解速度明顯大于室溫。農(nóng)醫(yī)發(fā)【2017】1 號文件采取超聲提取的方法，超聲過程中會放熱，加速了金霉素的水解，且氮吹溫度45℃，同樣加速了金霉素的水解，以致金霉素的回收率30%，三個方法中回收率最低；農(nóng)業(yè)部1025 號公告-12-2008 方法提取至有渦動混勻，沒有經(jīng)過超聲提取，提取不充分，因此金霉素的回收率只有43%；GB/T 21317-2007 方法中采取的是冰水浴超聲提取，且離心溫度設(shè)置-2℃，均能降低金霉素的水解，所以此方法金霉素的回收率能達到75%，能夠滿足回收率的要求。

3 實驗條件優(yōu)化及注意事項 （ 以GB/T 21317-2007 為例子）

3.1 樣品解凍

一般樣品中在-18℃以下冰箱里冰凍存放，檢測樣品恢復(fù)至室溫后，按照標準操作方法處理，嚴禁用微波等加熱方式對樣品進行解凍，應(yīng)在室溫下自然解凍后再進行前處理。

3.2 離心機最優(yōu)溫度-2℃

由于離心機高速轉(zhuǎn)動起來會放熱，且部分離心機達不到設(shè)置的溫度，所以一般溫度設(shè)置在-2℃左右，溫度太高油脂是液體狀態(tài)，進入提取液，凈化時時會堵塞固相萃取柱，降低回收率；溫度太低，試樣結(jié)冰，部分殘渣會包裹在冰中，凈化時時會堵塞固相萃取柱，降低回收率。

3.3 洗脫液的用量

由于固相萃取柱的廠家不同，填充的密度不同，導(dǎo)致固相萃取柱有差異，且部分四環(huán)素吸附在柱子上，洗脫液的量過少會致使部分四環(huán)素洗脫不完全，洗脫液量過多會洗脫出雜質(zhì)，對上機有干擾造成正偏差，經(jīng)過大量實驗得出最優(yōu)的洗脫液量15mL。以加標100ug/kg 為例，不同的洗脫液回收率如下：

洗脫液用量（mL）回收率（%）四環(huán)素 土霉素 金霉素5 51 55 25 10 68 75 40 15 80 86 75

4 結(jié)論

本文通過動物源食品中四環(huán)素的檢測，農(nóng)醫(yī)發(fā)【2017】1 號文件附錄8，GB/T 21237-2007，農(nóng)業(yè)部1025 號公告-12-2008 三種方法的對比，以雞肉為例，經(jīng)過多次反復(fù)實驗，且對部分實驗條件進行了優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)GB/T 21237-2007 的不僅實驗操作方便且方法回收率較高，準確性高，能較好的滿足實驗要求。